Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

2D og 3D kromosom maleri i malaria myg

Published: January 6, 2014 doi: 10.3791/51173
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Entomology, Virginia Tech

Summary

Kromosommaleri er en nyttig metode til at studere organiseringen af cellekernen og udviklingen af karyotypen. Her demonstrerer vi en tilgang til at isolere og forstærke specifikke interesseregioner fra enkelt polytenkromosomer, der efterfølgende bruges til to- og tredimensionel fluorescerende in situ-hybridisering (FISH).

Abstract

Fluorescerende in situ hybridisering (FISH) af hele armkromosomsonder er en robust teknik til kortlægning af genomiske interesseregioner, påvisning af kromosomale omlægninger og undersøgelse af tredimensionel (3D) organisering af kromosomer i cellekernen. Fremkomsten af laserfangst mikrodissection (LCM) og hele genomforstærkning (WGA) giver mulighed for at opnå store mængder DNA fra enkelte celler. Den øgede følsomhed af WGA kits fik os til at udvikle kromosom maling og bruge dem til at udforske kromosom organisation og udvikling i ikke-model organismer. Her præsenterer vi en enkel metode til isolering og forstærkning af de eukromatiske segmenter af enkelt polytenkromosomarme fra æggestokkene sygeplejerskeceller i den afrikanske malaria myg Anopheles gambiae. Denne procedure giver en effektiv platform til at opnå kromosommaling, samtidig med at den samlede risiko for at introducere udenlandsk DNA til prøven reduceres. Brugen af WGA giver mulighed for flere runder af re-forstærkning, hvilket resulterer i store mængder af DNA, der kan bruges til flere eksperimenter, herunder 2D og 3D FISH. Vi viste, at de udviklede kromosommaling med succes kan bruges til at etablere korrespondancen mellem eukromatiske dele af polyten og mitotiske kromosomarme i An. gambiae. Samlet set giver foreningen af LCM og single-kromosom WGA et effektivt værktøj til at skabe betydelige mængder mål-DNA til fremtidige cytogenetiske og genomiske undersøgelser.

Introduction

Kromosommaleri er en nyttig teknik til at studere udviklingen af karyotyper 1-5 og til visualisering af cytogenetiske abnormiteter via hybridisering af fluorescerende mærket kromosomal DNA 1,6-8. Denne metode anvendes også til at studere 3D-dynamikken i kromosomområder i udvikling 9 og patologi 10. Differentieret mærket kromosom maling anvendes til visualisering af individuelle mitotiske 11,12, meiotiske 13,14eller interfase ikke-polyten 15,16 og polyten 9,11,17 kromosomer. En enkel og robust protokol til at opnå kromosommaling ville være meget nyttig til at udvide denne teknik til ikke-modelorganismer, såsom myg. Anopheles gambiae-komplekset er en gruppe på syv morfologisk ikke skelnelige myg, der varierer i adfærd og tilpasning, herunder evnen til at overføre malaria.  Disse myg tjener som en fremragende model for bedre at forstå udviklingen af nært beslægtede arter, der adskiller sig meget i deres vektoriske kapacitet.  De fleste cytogenetiske undersøgelser i malaria myg er blevet udført ved hjælp af veludviklede, højt polyteniserede kromosomer (gennemgået i 18,19). De læsbare banding mønstre af polytene kromosomer tillod forskere at demonstrere sammenhængen mellem polymorfe inversioner og økologiske tilpasninger i Anopheles gambiae 20. Også vævsspecifikke 21 og artsspecifikke 22 funktioner i 3D polytenkromosomorganisation er blevet karakteriseret i An. macullipennis-komplekset. Men at studere mitotiske kromosomer kan give yderligere vigtige oplysninger. For eksempel er et højere niveau af heterochromatin polymorfi observeret i mitotiske kromosomer blevet korreleret med reduceret parringsaktivitet og frugtbarhed i An. gambiae 23. Det kan være vanskeligt kun at fastslå overensstemmelsen mellem eukromatiske segmenter af polyten- og mitotiske kromosomarme ved at sammenligne deres relative længder. Dette skyldes, at heterochromatin udgør en betydelig del af mitotiske kromosomer, men er underrepræsenteret i polytenkromosomer 24. Tilgængeligheden af kromosommaling til malariamyg vil gøre det muligt for forskere at udvide cytogenetiske undersøgelser betydeligt ved at inkludere yderligere arter, samtidig med at omkostningerne og tiden i analyserne af karyopatisk evolution og 3D-dynamikken i kromosomer i denne gruppe af epidemiologisk vigtige insekter reduceres betydeligt.

For at opnå store strækninger af kromosomer er mikrodissection blevet en integreret teknik til at manipulere og isolere specifikke regioner af interesse for det kromosomale supplement.  Når mikrodissection kombineres med helgenomforstærkning (WGA), resulterer det i kraftfulde downstream-applikationer, herunder FISH 11,12 og næste generations genomsekvensering 25-27. Tidligere krævede teknikken brug af specialiserede mikrodissection nåle, der skulle styres manuelt af en erfaren bruger 28.  Udviklingen af laserfangstmikreringsmikrektion (LCM) har resulteret i et forenklet værktøj, der er bedre egnet til isolering af enkeltceller 29,30 eller individuelle kromosomer 31-33 med en mindsket risiko for forurening. Denne tilgang giver brugeren mulighed for at studere de genetiske heterogeniteter og kromosomale abnormiteter, der forekommer i enkelte celler, i stedet for et konsensuslandskab, der skyldes at samle flere celler sammen 34-36. Flere metoder er blevet brugt til at forstærke DNA produceret af microdissection.  DOP-PCR, en teknik, der er nyttig til forstærkning af meget gentagne sekvenser, er blevet brugt til at forstærke mikrodissected kromosomer fra arter, herunder græshoppe 37, den spiny ål 38, og Nilen tilapia 39.  For nylig er pcr-baserede GenomePlex WGA4 Single Cell kit og flere forskydning forstærkning baseret (MDA) Repli-G Single Cell kit blevet værdifulde værktøjer til eksperimenter, der involverer genetisk analyse af enkelt menneskelige celler samt kromosomer40-42, herunder B-kromosomsystemer i græshopper 37 og græshopper 43. Disse to kits har hver især fordele og ulemper, men deres tilsyneladende overlegenhed over andre tilgængelige forstærkningssystemer er blevet påvist 44.

Mængden af DNA, der kan opnås fra et enkelt kromosom eller et kromosomsegment, er betydeligt mindre end en hel kerne. Derfor er mikrodissection, forstærkning og efterfølgende analyse af et enkelt kromosom langt mere udfordrende, især hos organismer med små genomer som i Drosophila eller Anopheles.  Selv om maling er udviklet fra enkelt microdissected kromosomer af et menneske 33 og en hveps 45, en vellykket FISK eksperiment krævede flere (mindst 10-15) mikrodissected mitotiske kromosomer af en frugt flyve 11. Evnen til at mikrodissektere og forstærke et enkelt kromosom ville imidlertid være vigtig for (i) at reducere risikoen for kontaminering med materiale fra et andet kromosom, (ii) at minimere antallet af kromosompræparater, der er nødvendige for mikrodissection, (iii) at sænke nukleotid og strukturel polymorfi af den mikrodisserede prøve i både FISH og sekventering af downstream-applikationer. Polytene kromosomer findes i mange Dipteran arter giver en unik mulighed for at erhverve en langt højere startmængde af DNA. De giver også en højere opløsning og kromosomstruktur, der ikke kan opnås ved brug af mitotiske kromosomer. Denne ekstra opløsning kan være afgørende for at visualisere kromosomale omlejringer, kromatinstruktur og kromosomale segmenter, der skal mikrodissected 28,46.

Her præsenterer vi en procedure for effektivt at isolere et eukromatisk segment fra en enkelt polytenkromosomarm, forstærke DNA'et og bruge det i downstream FISH-applikationer i malariamyg.  Først anvender vi LCM til at isolere og udtrække en enkelt kromosomarm fra specielt forberedte membrandias. For det andet bruges WGA til at forstærke DNA'et fra det mikrodisserede materiale. For det tredje hybridiserer vi det forstærkede DNA i FISH-eksperimenter til polytene squashpræparater 47, metafase og interfasekromosom dias 48, samt 3D-æggestokke hele mount prøver. Denne procedure er blevet gjort for at kunne male et flertal af euchromatin i kromosomale arme af An. gambiae.

Protocol

1) Polytene kromosom dias forberedelse til laserfangst mikrodissection

  1. Dissekere halv-gravid Anopheles hunner på 25 timer post-blod fodring. Æggestokkene fikses fra ca. fem hunner til 500 μl frisk modificeret Carnoys opløsning (100% methanol: iseddike, 3:1) ved stuetemperatur i 24 timer. Der overføres æggestokke til -20 °C for at få en langtidsopbevaring.
  2. Forbered Carnoys opløsning (100% ethanol: iseddike, 3:1) og 50% propionsyre lige før kromosomdias.
  3. Placer et par æggestokke i en dråbe af Carnoys opløsning på en Zeiss 1,0 PET-membranrutrut. Afhængigt af størrelsen, opdele æggestokke i ca 2-4 sektioner med dissekere nåle og placere dem i en dråbe på 50% propionsyre på rene dias under en dissektion mikroskop.
  4. Adskil follikler og fjern resterende væv ved hjælp af køkkenrulle under et dissektion stereomikroskop. Tilsæt en ny dråbe på 50% propionsyre til folliklerne og lad dem sidde i 3-5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Placer en siliciumbelagt coverslip oven på dråben. Lad rutsjebanen stå i ca. 1 minut.
  6. Dæk diaset med et absorberende materiale (filterpapir bruges til denne metode), og mens du bruger viskelædersiden af en blyant, skal du lægge et generøst tryk på coverlipet ved at trykke på det gentagne gange med viskelæderet.
  7. Skub til 60 °C på et glidende denaturerings-/hybridiseringssystem i 15-20 minutter for at hjælpe med at flade polytenekromosomerne ud. Placer lysbilleder i et fugtigt kammer ved 4 °C natten over, så syren yderligere kan flade kromosomer.
  8. Placer dias i koldt 50% ethanol i 10 min. Fjern forsigtigt coverlip, og udskift i koldt 50% ethanol i 10 mere min.
  9. Dehydrerer dias i 70%, 90%, 100% ethanol i 5 min hver. Lufttørre rutsjebaner.
  10. Forbered en opløsning af GURR bufferopløsning ved at tilføje en enkelt buffertablet til 1 L destilleret vand. Autoklave.
  11. Giemsa-opløsningen fremstilles ved at tilsætte 1 ml Giemsa-farvningsopløsning til 50 ml GURR-buffer.
  12. Placer lufttørrede rutsjebaner i Giemsa opløsning i 10 minutter og vask tre gange i 1X PBS. Lufttørring glider igen i et kontrolleret sterilt klima for at undgå forurening.

2) Laserfangst mikrodissection af en enkelt polyten kromosom arm

Dette afsnit beskriver brugen af PALMRobo-softwaren, som leveres med PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet.

  1. Rengør mikroskopet med 100% ethanol. Steriliser handsker og rør med UV-lys i uv-crosslinker.
  2. Tænd palme microbeam lasermikrosfektion mikroskop og tænde laser. Åbn laserdissektionspakken, PALMRobo, og konfigurer indstillingerne "Power" og "Focus" efter behov.
  3. Søg efter polytene kromosom arm af interesse.
  4. Opret en disposition for det valgte område ved hjælp af værktøjet "Blyant".
  5. Åbn vinduet "Elementer" fra menulinjen.
  6. Vælg "Tegnet element", og sørg for, at du har valgt "Klip".
  7. Sæt klæbebåndsrøret i holderen og placer det over rutsjebanen, så der er et lille mellemrum <1 mm i størrelse, og start laserskæret.
  8. Placer "Katapultvalget" på det afskårne sted, så der er plads mellem kanten og kromosomet.
  9. Vælg "LPC" på rullelisten, og begynd katapultering.
  10. Kontroller, at prøven blev slynget ind i hætten ved at trykke på ikonet "Øje".

3) Rensning af DNA fra en enkelt mikrodissected polytene kromosom arm

Følg instruktionerne i QIAamp DNA Micro Kit for at frigive og rense det indsamlede DNA. Trin 3.1 blev ændret for at imødekomme det omvendte rør.

  1. Der tilsættes 15 μl Buffer ATL og 10 μl proteinase K til det omvendte rør (inde i hætten) og inkuberes ved 56 °C i 3 timer.
  2. Der tilsættes 25 μl buffer ATL, 50 μl buffer AL og 1 μl bære RNA. blanding. Der tilsættes 50 μl 100% EtOH; blande.
  3. Overfør lysate til kolonnen QIAamp; centrifuge. Vaskes ved tilsætning af 500 μl buffer AW1; centrifuge. Kolonnen anbringes i det nye opsamlingsrør, tilsættes 500 μl buffer AW2; centrifuge. Placer kolonnen i et nyt rør; centrifuge for at fjerne overskydende væske.
  4. Kolonnen anbringes i et mikrocentrifugerør på 1,5 μl og tilsættes 20 μl vand for at elute. centrifuge.
  5. Fordamper friskt elueret DNA ned til et sidste volumen på 9 μl ved hjælp af en vakuumfuge.

4) Forstærkning af DNA fra en enkelt mikrodissected polytene kromosom arm

To forskellige protokoller blev brugt til WGA af en enkelt kromosomarm.

  1. DNA-forstærkning og sondeforberedelse via GenomePlex WGA
    1. Følg GenomePlex-pakken med en enkelt celle for at producere det første parti forstærket DNA:
      1. Der tilsættes frisklavet Proteinase K-opløsning til prøven på 9 μl. blanding. Inkuber DNA ved 50 °C i 1 time, og varm derefter til 99 °C i 4 min. Bliv ved med at være på is.
      2. Der tilsættes 2 μl 1X forberedelsesbuffer til enkeltcellebibliotek og 1 μl biblioteksstabiliseringsløsning. varmeprøve til 95 °C i 2 min. Køligt på is og centrifuge.
      3. Tilføje 1 μl bibliotekspræparatetzym; blanding og centrifuge. Inkuber på følgende måde:
        Equation 1
      4. Der tilsættes 7,5 μl 10X forstærkningsmesterblanding, 48,5 μl vand. 5,0 μl WGA DNA Polymerase; blanding og centrifuge.
      5. Termocykel som følger:
        Equation 2
    2. Rense DNA ved hjælp af genomisk DNA Clean &Concentrator Kit. Protokollen er som følger:
      1. Der tilsættes 5:1 DNA-bindingsbuffer:DNA-prøve (specielt til genomisk DNA på mindre end 2 kb. Hvis prøve-DNA er større end 2 kb, skal du bruge et 2:1-forhold) og overføre til den angivne spinkolonne. centrifuge.
      2. Der tilsættes 200 μl DNA-vaskebuffer og centrifuge. Gentag vasketrin. Derefter tilsættes 50 μl vand og elute DNA i en ny 1,5 ml rør.
    3. Forstærk prøve-DNA'et på en måde ved hjælp af GenomePlex WGA3-gensamplificeringssættet på følgende måde:
      1. Der tilsættes 10 μl DNA til PCR-røret (sættet anbefaler 10 ng i alt DNA) med 49,5 μl vand, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP mix og 5,0 μl WGA DNA Polymerase. Bland og centrifuge.
      2. Brug følgende profil til reaktionen:
        Equation 3
      3. Opbevar DNA ved -20 °C.
    4. Label DNA til FISH ved hjælp af GenomePlex WGA3 Reamplification Kit som følger:
      1. Opret en masterblanding fra GenomePlex WGA3 Reamplification Kit ved at tilsætte 10 μl DNA til PCR-røret med 49,5 μl vand, 7,5 μl 10X Amplification Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP mix (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - hvis du bruger mærket dUTP), 1 μl af 25 nM mærket dUTP og 5,0 μl WGA DNA Polymerase.
      2. Brug følgende profil til reaktionen:
        Equation 3
      3. Ethanol udfælder den mærkede sonde ved at tilsætte 1/10 det endelige reaktionsvolumen (7,5 μl for 75 μl reaktion) på 3 M Natriumacetat pH 5,2 og 2-3 mængder 100% ethanol. Dna-prøven nedkøles ved -80 °C i mindst 30 min.
      4. Centrifugeprøve ved 4 °C i 10 minutter for at skabe mærket pellet og fjerne supernatant og lufttørret pellet.
      5. Opret hybridiseringsbuffer på følgende måde:
        0,2 g Dextran Sulfat
        1200 μl Deioniseret formamid
        580 μl H2O
        120 μl 20X SSC
      6. Der tilsættes 40 μl hybridiseringsbuffer til lufttørret pellet.
  2. DNA forstærkning og sonde forberedelse via REPLI-G Single Cell WGA efterfulgt af nick-oversættelse
    1. Følg REPLI-g WGA Kit-protokollen med en enkelt celle for at producere det forstærkede DNA:
      1. Forbered Buffer D2 (3 μl af 1 M DTT + 33 μl Buffer DLB).
      2. 4 μl renset mikrodisseret materiale blandes med 3 μl Buffer D2. Svirp rør til at blande. Inkuber i 10 min ved 65 °C. Der tilsættes 3 μl Stop-opløsning. blande.
      3. Der tilsættes 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reaktionsbuffer og 2 μl REPLI-g DNA Polymerase til prøven. Inkuber ved 30 °C i 8 timer. Inaktiver DNA-polymerase ved opvarmning til 65 °C i 3 min. Opbevar DNA ved -20 °C.
    2. Følg nick oversættelsesprotokollen for at mærke REPLI-g forstærket DNA:
      1. Forbered følgende etiketblanding:
        1 μg forstærket DNA
        5 μl 10X DNA Polymerase Buffer
        5 μl 10X dNTP
        5 μl 1X BSA
        1 μl 1 mM mærket dNTP
        4 μl 1 U/μl DNase I
        1 μl 10 U/μl DNA Polymerase I
        H2O til 50 μl
      2. Inkuber ved 15 °C i 2 timer. Der tilsættes 2 μl 0,5 M EDTA for at stoppe reaktionen. Tjek DNA fragment størrelse ved at køre på gel.
      3. Følg trin fra 4.1.4.3-4.1.4.6 til bundfald og opløse pellet.

5) 2D FISK på polyten og mitotisk kromosom squash præparater

Der henvises til detaljerede protokoller for FISK om præparater af polytene squash 47 og mitotiske kromosomdias 48. Her leverer vi korte protokoller.

  1. FISK på polyten kromosom squash præparater
    1. Fordyb dias i 1X PBS i 20 min på RT. Fix dias i 4% Paraformaldehyd i 1X PBS i 1 min.
    2. Dehydrat glider gennem ethanol vasker: 50%, 70%, 90%, 100% i 5 min hver på RT. Lufttørre dias.
    3. Forvarm sonden i hybridiseringsbuffer ved 37 °C. Tilsæt 10-20 μl sonde til dias. Dæk med 22 X 22 mm coverlip. Tryk eventuelle luftbobler ud ved hjælp af en pipettespids.
    4. Denaturer kromosomer og sonde ved 90 °C i 10 min. Forsegl kanter af coverslip med gummicement. Overfør rutsjebanen til fugtigt kammer og inkuber ved 39 °C natten over.
    5. Rutsjebanerne vaskes med 1X SSC ved 39 °C i 20 min. Vask rutsjebanerne med 1X SSC ved RT i 20 min. Skyl dias i 1X PBS, og tilsæt derefter Prolonger anti-fade med DAPI. Dæk med coverlip, og opbevar i glidekassen ved 4 °C i mindst en time før visualisering.
  2. FISK på mitotiske kromosom squash præparater
    1. Ekstrakt mitotiske kromosomer fra imaginaale diske af 4th instar larve af An. gambiae.
    2. Forbered kromosom dias egnet til FISK.
    3. Der tilsættes 2-3 μl mærket DNA-sonde til hybridiseringsbuffer i et rør og blandes forsigtigt ved pipettering.
    4. Påfør 10 μl af sondeblandingen på rutsjebanen og dækslet med en 22 X 22 mm coverlip. Tryk eventuelle luftbobler ud ved hjælp af en pipettespids.
    5. Til modbevaring og detektion skal du anvende Prolonger anti-fade med DAPI på præparatet og holde det mørkt i mindst en time før visualisering.

6) 3D FISK på hele montere æggestokkene væv

  1. Forbered følgende buffer A-blanding:
    60 mM KCl
    15 mM NaCl
    0,5 mM Spermidin
    0,15 mM spermin
    2 mM EDTA
    0,5 mM EGTA
    15 mM RØR
  2. Forbered dias til nuklear visualisering ved at tilføje et lag af nailpolish i et firkantet mønster, der matcher størrelsen af coverlips. Dette skaber en hævet overflade for at forhindre squashing af kerner, når du placerer på coverslip i fremtiden.
  3. Disseker friske æggestokke fra Christophers scene 3 hunner og hold i en opløsning på 150-250 μl Buffer A med 0,5% digitonin. Kør større dissektion nål over follikler (i rør med Buffer A med 0,5% digitonin) for at ødelægge follikulær membran.
  4. Vortex i 5-10 minutter for yderligere at forstyrre follikler. Skrab eventuelle store follikulære stykker og centrifuge rør i 30 sek ved laveste indstilling af ~ 500 omdrejninger i minuttet (RPM). Supernatant overføres til et nyt 2 ml Eppendorf-rør, og der tilsættes 100 μl Buffer A. Gentag trin 6.3 mellem 5-7 gange, indtil det synlige væv er brudt i små partikler.
  5. Drej begge rør i 10 minutter ved 2.000 omdrejninger i minuttet. Kassér supernatant i begge rør. Bemærk: Begge rør vil blive brugt til at gøre endelige nukleare visualisering dias. Røret med opsamlet supernatant bør indeholde primært ekstraheret kerner, mens det oprindelige rør med væv vil indeholde en blanding af væv og kerner indlejret i sygeplejerskeceller. Der tilsættes 200 μl buffer A – 0,1% Triton og inkuber natten over ved 4 °C. Centrifuge 5 min ved 10.000 RPM (10.621 x G) og fjern supernatant.
  6. Der tilsættes 200 μl 4% Paraformaldehyd i PBS. Inkuber i termomixer i 30 min. Centrifuge 5 min ved 5.000 omdrejninger (2.655 x G) og fjern supernatant. Vask med Buffer A med 0,1% Triton i 5 min, bland ved 450 RPM i thermomixer. Centrifuge 5 min ved 5.000 RPM (2.655 G) og fjern supernatant.
  7. Forvarmet ved 37 °C mærket sonde til rør. Denaturer ved 95 °C i termomixer, blanding ved 450 omdrejninger i 10 min. Denatureringen fortsættes ved 80 °C i 15 minutter med fortsat blanding. Inkuber ved 37 °C i termomixer, med 450 RPM blanding natten over. Centrifuge 5 min ved 5.000 omdrejninger (2.655 x G). Fjern supernatant.
  8. Vask med Buffer A med 0,1% Triton i 5 min. Centrifuge 5 min ved 5.000 omdrejninger (2.655 x G). Gentag 2 gange. Påfør slip af Prolong Anti-fade med DAPI.
  9. Pipet ud nuclei / DAPI løsning omhyggeligt (undgå bobler), gælder for dias, og dække med coverslip.

Representative Results

Figur 1 beskriver den overordnede gennemstrømning af protokollen, der er beskrevet i denne artikel.  Brugeren starter i første omgang med at mikrodissecting kromosom DNA-prøver fra membran dias.  Mikrodisseret materiale udvindes og renses. Det rensede DNA forstærkes derefter, forstærkes igen, mærkes og bruges derefter til FISH til at mærke kromosomspredninger.

LCM-protokollen kan opdeles i tre overordnede trin: 1) At finde kromosomer af interesse og forberede regionen til skæring (Figur 2A), 2) Skæring og katapult af det kromosomområde af interesse via laser (Figur 2B) og 3) Kontrol for at afgøre, om prøven faktisk slynges ind i klæbende hætte (Figur 2C). Processen med LCM, der anvendes på An. gambiae Sua stamme polytene kromosomer er vist i Video 1. Videoen beskriver hele processen fra programstart, herunder vigtige softwarefunktioner og tip.

GenomePlex og REPLI-g enkeltcellede WGA-sæt, der bruges i denne protokol, adskiller sig meget i resulterende produktstørrelse såvel som samlet udbytte.  Figur 3 viser resultaterne af gel elektroforese løb for GenomePlex og REPLI-g kits, samt kvantificering af prøverne ved Nanodrop.

Mikrodisseret materiale er blevet brugt til at skabe FISH-sonder, der er målrettet mod eukromatiske områder af et kromosom.  Figur 4 viser FISH af fem sonder genereret af mikrodisseret materiale på polytene kromosomer i An. gambiae.  Fire autosomale arme var mærket med tre fluorophorer ved hjælp af WGA3-sættet: 3R-kromosomet er mærket med grønt (fluorescein), 3L-kromosomet er i en blanding af rødt (Cy-3) og gult (Cy-5), 2R-kromosomet er i gult (Cy-5), og 2L-kromosomet er i rødt (Cy-3). X-kromosomet blev mærket i orange (Cy-3) ved hjælp af nick-oversættelse af REPLI-g materialet i et separat eksperiment. For at fastslå overensstemmelsen mellem eukromatiske dele af polyten og mitotiske kromosomarme er kromosommaling blevet hybridiseret til interfase, profase, prometaphase og metafasekromosomer i An. gambiae (Figur 5).  For at visualisere 3D-organiseringen af en enkelt polytenkromosomarm i cellekernen blev hele mount FISH udført på An. gambiae Sua stamme æggestokkene sygeplejerske celler (Video 2).  Forskellige kromosomarmområder ses tydeligt i kerner med interfase (Figur 5D) og polyten (Video 2) kromosomer.

Figure 1
Figur 1. Skematisk repræsentation af de eksperimentelle procedurer mod fremstilling af kromosommaling. Klik her for at se større billede.

Figure 2
Figur 2. De vigtigste skridt i kromosom mikrodissection. A) Laserassisteret skæring af det kromosomale område af interesse gennem membranen. B) Membranen med et hul efter katapulten udføres. C) Visningen af det katapulterede stykke af membranen med et kromosomalt segment i det fastgjort til klæbehætten. Pilen angiver heterochromatin af X-kromosomet, der forblev på diaset. Stjernen viser et stykke af et andet kromosom, der forblev på diaset. Klik her for at se større billede.

Figure 3
Figur 3. Agarose gel billeder, der viser DNA efter WGA. A) Lav molekylvægt (200-500 bp) DNA fra arm 3R efter brug af WGA4- og WGA3 GenomePlex-kits. B) Høj molekylvægt (10-20 kb) DNA fra arm 2L efter REPLI-g forstærkning. 100 bp stigen er vist i venstre vognbane. Tabellerne under gelbillederne viser DNA-koncentrationer målt ved Nanodrop. Klik her for at se større billede.

Figure 4
Figur 4. Maling af polytenkromosomer fra æggestokkene sygeplejerske celler i An. gambiae ved hjælp af fire sonder genereret fra mikrodiskuterede materiale. X-kromosomet er mærket i orange (Cy-3) ved nick-oversættelse af REPLI-g materialet. 2R armen er mærket i gult (Cy-5); 2L armen er i rødt (Cy-3); 3R-armen er mærket med grønt (fluorescerende) 3L-armen er mærket i en blanding af rød (Cy-3) og gul (Cy-5). Autosomer er mærket med WGA3 forstærkningssættet. Chromatin er farvet i blåt (DAPI). Kromosomnavne er placeret i nærheden af telomeriske regioner. Klik her for at se større billede.

Figure 5
Figur 5. Maling af interfase (A), profase (B), prometaphase (C) og metafase (D) kromosomer fra larvemaginaler fra An. gambiae Mopti-stammen ved hjælp af tre sonder genereret af mikrodisseret materiale mærket af WGA3. 2R-armen er mærket med grønt (fluorescerende); 2L-armen er umærket; 3R-armen er i pink, en blanding af rød (Cy-3) og orange (Cy-5); 3L armen er mærket i orange (Cy-5). X-kromosomet har en rød etiket svarende til 18S rDNA-sonden. Chromatin er farvet i blåt (DAPI). Farvestrålende områder af kromosomer svarer til heterochromatin. Klik her for at se større billede.

Video 1. Processen med LCM af An. gambiae polytene kromosomer. Klik her for at se Video 1.

Video 2. Hele mount 3D FISH udført på En. gambiae æggestokkene sygeplejerske celler. Sonden er mærket i Cy-3 (afbildet i blåt) og blev lavet af en mikrodissected 2R kromosom arm.  Chromatin blev plettet med DAPI og er afbildet af cyan pseudo-farve (lyseblå). Klik her for at se Video 2.

Discussion

Der er flere trin, der er afgørende for at kunne forstærke DNA fra mikrodisserede polytenkromosomprøver. Protokollen anvender brugen af LCM, en metode, der både øger den samlede effektivitet og reducerer eksponeringen for fremmed DNA ved at fjerne samspillet mellem fysiske værktøjer med prøven. Forstærkningen af udenlandsk DNA er dog stadig den største potentielle faldgrube i dette eksperiment. Under hele processen er det derfor vigtigt at holde prøverne beskyttet mod forurening. I hele diasforberedelsen og mikrodisseringsfaserne er det vigtigt at ethanolvaske dissektionsnåle, dias, dæksedler samt arbejdsområdet.  Det anbefales også at UV behandle alt relevant udstyr (nåle, rutsjebaner, coverslips) før brug.

Membranen på dissektionsdiasene gør det meget vanskeligt at sprede kromosomerne.  Det er vigtigt at bruge mere af æggestokken (halvdelen til et helt par æggestokke), når du foretager disse dias, for at give en større chance for at finde en godt spredt kerne.  Det anbefales også at bruge frisk væv, når du foretager dias, som forstærkning satser synes at falde som væv alder 49 og kromosom spredning bliver mere udfordrende.  Forberedelsen af dias til mikrodissection er det mest tidskrævende trin i denne protokol.  Kromosomer skal spredes godt for at undgå utilsigtet erhvervelse af uønsket materiale.  Giemsa farvning giver brugeren mulighed for at kontrollere spredning kvalitet med en fase kontrast mikroskop før du bruger microdissection system.

Kombinationen af mikrodissection og forstærkning giver mulighed for at udtrække og analysere kromosomale fragmenter, der spænder i størrelse fra små regioner af interesse til et flertal af armene.  Denne protokol giver brugeren mulighed for at få DNA fra morfologisk forskellige regioner såsom inversioner, specifikke eukromatiske bånd og interbånd, telomerisk, centromerisk og intercalær heterochromatin. Brugeren kan anvende de genererede malesonder til at undersøge afvigende kromosomer, studere homologi mellem arter på bestemte loci eller karakterisere rumlig organisering af kromosomer i en intakt 3D-kerne. Til udvikling af kromosommaling valgte vi eukromatiske segmenter for at undgå hybridisering af gentagen DNA med flere kromosomale regioner. Som et resultat opnåede vi armspecifikt maleri uden at bruge en konkurrent, som total genomisk DNA eller C0t-1 DNA-fraktion.

Vi valgte at bruge GenomePlex WGA- og REPLI-G-kits baseret på anmeldelser, der sammenlignede effektiviteten og frafaldet af flere forstærkningssæt 40,44.  Begge sæt klarede sig bedst blandt de tilgængelige metoder i både frafaldsprocent (GenomePlex havde en 12,5% sats sammenlignet med REPLI-g's 37,5%) og procentdel af forstærkede markører (GenomePlex havde en 45,24% forstærkningshastighed vs REPLI-g's 30,0%) 40. GenomePlex-sættet leverede også en større mængde DNA og gjorde det dermed til en bedre kandidat til flere downstream-teknikker.  Der findes også et genforstærkningssæt til GenomePlex-systemet, hvilket giver mulighed for yderligere forstærkning af DNA. Det er dog vigtigt at bemærke, at forstærkning ikke er perfekt.  Muligheden er fortsat, at vellykket forstærkning kan indføre fejl eller have en bias mod specifikke loci i målet DNA. Det er vigtigt at overveje den endelige fragmentstørrelse af de tilgængelige genomforstærkningsmetoder.  GenomePlex fragmentering resulterer i et bibliotek med fragmenter fra 200-500 bp, mens REPLI-g-sættet producerer fragmenter på ca. 10-20 kb i størrelse. Den tilsigtede downstream-anvendelse af denne protokol er FISH, hvilket gør GenomePlex-sættet til en mere realistisk mulighed, da det gav den ønskede fragmentstørrelse og evnen til at mærke DNA-fragmenter direkte gennem WGA. Lange DNA-molekyler, der produceres af REPLI-g-forstærkningen, skal fragmenteres i den nedstrøms nickoversættelsesmærkningsreaktion.

Denne protokol er blevet tilpasset for at forstærke DNA fra en enkelt polytenkromosomarm.  Andre protokoller kræver samling af mange (typisk 10-30) kromosomfragmenter for at kunne forstærke prøven 7,11,28,40.  Selvom samling af flere kromosomer er mulig ved hjælp af vores metode, understreger den øgede sandsynlighed for prøveforurening vigtigheden af at starte eksperimentet med så få kromosomer som muligt. Hvis polytenkromosomer ikke er tilgængelige, kan vores protokol tilpasses til brug i mitotiske kromosomer. Det kan dog være nødvendigt at samle 10-15 mitotiske kromosomer inden forstærkning for vellykket FISH 11. Forstærkning bias er lavere med store mængder af startskabelon DNA 50. Polytenekromosomer giver ca. 512 kopier af en enkelt DNA-sekvens og 1024 kopier af to homologe DNA-sekvenser.  Således vil samling af mitotiske kromosomer bidrage til at øge den samlede kvalitet af DNA-produktet efter forstærkning.

Denne procedure har mange potentielle anvendelser i cytogenetiske og genomiske undersøgelser. Her brugte vi kromosom maling til at etablere korrespondancen mellem eukromatiske segmenter af polytene og mitotiske kromosomarme i An. gambiae. De samme malesonder kan anvendes til cytogenetisk karakterisering af An. gambiae cellelinjer. Omfattende genomiske omlægninger og ændringer i kromosomnumre er fælles træk ved cellelinjer 51,52. Aneuploidy, polyploidy og kromosomale omlejringer såsom translokationer, inversioner, sletninger og ringkromosomer er blevet opdaget i forskellige mygcellelinjer 53,54. Klassiske cytogenetiske observationer 55 og fysisk kortlægning 56 har vist forekomsten af fuldarmskromosomale translokationer i udviklingen af malariamyg. Derfor kan mikrodiskriteret materiale anvendes i forbindelse med FISH-forsøg til at sammenligne homologi af kromosomale regioner mellem arter. Vi har med succes udført 3D FISH med 2R-maleri sonde på polytene kromosomer i hele montere æggestokkene sygeplejerske celler. Denne metode vil lette sporingen af kromosombaner og studere den nukleare arkitektur i Anopheles. Teknikker som DNA genotyping 57,58, næste generation genom sekventering 26,27, fysisk og sammenkobling kort udvikling, og generering af sonder til kromosom maleri 33,59 alle kan drage fordel af arm-og regionsspecifikke microdissection. Ved at kombinere LCM-teknologi og fremme encellet WGA demonstrerer vi en effektiv, praktisk metode til fremstilling af rimelige mængder DNA fra en enkelt polytenkromosomarm.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health 1R21AI094289 til Igor V. Sharakhov

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Fisher Scientific A491-212
Methanol Fisher Scientific A412-4
Propionic acid  Sigma-Aldrich 402907
Membrane slides 1.0 PET Zeiss 415190-9051-000
Buffer tablets “GURR” Life Technologies 10582-013
KaryoMAX Giemsa Stain Life Technologies 10092-013
ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System Abbott Molecular 30-144110
Vacufuge vacuum concentrator Eppendorf 22820001
Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 Fisher Scientific 11-992-89
Thermo Scientific NanoDrop Fisher Scientific ND-2000
REPLI-g Single Cell Kit Qiagen 150343
GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) Sigma-Aldrich WGA4-10RXN
GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) Sigma-Aldrich WGA3-50RXN
MZ6 Leica stereomicroscope Leica VA-OM-E194-354 A different stereomicroscope can be used
Olympus CX41 Phase Microscope Olympus CX41RF-5 A different phase microscope can be used
PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope Zeiss
Thermomixer Eppendorf 22670000
10x PBS Invitrogen P5493
50x Denhardt’s solution Sigma-Aldrich D2532
99% Formamide Fisher Scientific BP227500
Dextran sulfate sodium salt Sigma D8906
20x SSC buffer Invitrogen AM9765
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P-36931
dATP, dCTP, dGTP, dTTP Fermentas R0141, R0151, R0161, R0171
Cy3-dUTP, Cy5-dUTP GE Healthcare PA53022, PA55022
BSA Sigma-Aldrich A3294
DNA polymerase I Fermentas EP0041
DNase I  Fermentas EN0521
Spermine Sigma-Aldrich S3256-1G
Spermidine Sigma-Aldrich S0266-1G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Scientific BP366-500
Sodium Chloride (NaCl) Fisher Scientific BP3581
EGTA Sigma-Aldrich E0396-25G
PIPES Sigma-Aldrich P6757-25G
EDTA Fisher Scientific S311-500
Digitonin Sigma-Aldrich D141-100MG
Triton-X100 Fisher Scientific BP151-100
AdhesiveCap 500 clear Zeiss 415190-9211-000
QIAamp DNA Micro Kit (50) Qiagen 56304
Genomic DNA Clean and Concentrator Kit Zymo Research D4010
37% Paraformaldehyde Fisher Scientific F79-500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ried, T., Schrock, E., Ning, Y., Wienberg, J. Chromosome painting: a useful art. Human molecular genetics 7. , 1619-1626 (1998).
  2. Yang, F., et al. Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chromosome Res. 8, 393-404 (2000).
  3. Badenhorst, D., Dobigny, G., Robinson, T. J. Karyotypic evolution of hapalomys inferred from chromosome painting: a detailed characterization contributing new insights into the ancestral murinae karyotype. Cytogenet Genome Res 136. , 83-88 (2012).
  4. Trifonov, V. A., et al. Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843-855 (2011).
  5. Nie, W., et al. Chromosomal rearrangements and karyotype evolution in carnivores revealed by chromosome painting. Heredity (Edinb. , 108-1017 (2012).
  6. Guan, X. Y., et al. Detection of chromosome 6 abnormalities in melanoma cell lines by chromosome arm painting probes). Cancer Genet Cytogenet. 107, 89-92 (1998).
  7. Guan, X. Y., et al. Characterization of a complex chromosome rearrangement involving 6q in a melanoma cell line by chromosome microdissection. Cancer genetics and cytogenetics 134. , 65-70 (2002).
  8. Breen, M., et al. Detection of equine X chromosome abnormalities in equids using a horse X whole chromosome paint probe (WCPP). Vet J. 153, 235-238 (1997).
  9. Kokhanenko, A. A., Anan'ina, T. V., Stegniy, V. N. The changes in chromosome 6 spatial organization during chromatin polytenization in the Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) nurse cells. Protoplasma 250. , 141-149 (2013).
  10. Timme, S., et al. Nuclear position and shape deformation of chromosome 8 territories in pancreatic ductal adenocarcinoma. Anal Cell Pathol (Amst. 34, 21-33 (2011).
  11. Drosopoulou, E., et al. Sex chromosomes and associated rDNA form a heterochromatic network in the polytene nuclei of Bactrocera oleae (Diptera: Tephritidae). Genetica. 140, 169-180 (2012).
  12. Pazian, M. F., Shimabukuro-Dias, C. K., Pansonato-Alves, J. C., Oliveira, C., Foresti, F. Chromosome painting of Z and W sex chromosomes in Characidium (Characiformes). Crenuchidae). Genetica. 141, 1-9 (2013).
  13. Howe, E. S., Murphy, S. P., Bass, H. W. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol 990. , 53-66 (2013).
  14. Lysak, M. A., Mandakova, T. Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. Methods Mol Biol 990. , 13-24 (2013).
  15. Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel OctoChrome FISH assay. J Vis Exp. 10, (2012).
  16. Idziak, D., et al. Painting the chromosomes of Brachypodium: current status and future prospects. Chromosoma. 120, 469-479 (2011).
  17. Fuchs, J., Kuhfittig, S., Reuter, G., Schubert, I. Chromosome painting in Drosophila. Chromosome Res. 6, 335-336 (1998).
  18. Zhimulev, I. F. Morphology and structure of polytene chromosomes. 34, Academic Press. 1-490 (1996).
  19. Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. in Chromosome Mapping Research Developments eds. J.F. Verrity & L.E. Abbington) (Nova Science. , Publishers, Inc. (2008).
  20. Coluzzi, M., Sabatini, A., Torre, della, Di Deco, A., A, M., Petrarca, V. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex). Science. 298, 1415-1418 (2002).
  21. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malaria mosquitoes. Genetika. 23, 821-827 (1987).
  22. Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malarial mosquitoes. II. Species specificity in the pattern of chromosome relations with the nuclear envelope of nutrient ovarian cells. Genetika. 23, 1194-1199 (1987).
  23. Bonaccorsi, S., Santini, G., Gatti, M., Pimpinelli, S., Colluzzi, M. Intraspecific polymorphism of sex chromosome heterochromatin in two species of the Anopheles gambiae complex. Chromosoma. 76, 57-64 (1980).
  24. Zhimulev, I. F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet. 37, 1-566 (1998).
  25. Seifertova, E., et al. Efficient high-throughput sequencing of a laser microdissected chromosome arm. BMC Genomics. 14, 1471-2164 (2013).
  26. Weise, A., et al. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions. European journal of human genetics. EJHG. 18, 457-462 (2010).
  27. Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19. , 395-406 (2012).
  28. Moshkin, Y. M., et al. Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogastermutant Suppressor of Underreplication. Chromosoma. 111, 114-125 (2002).
  29. Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Laser Mahalingam, M. capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755. , 1-15 (2011).
  30. Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. 10, (2010).
  31. Kubickova, S., Cernohorska, H., Musilova, P., Rubes, J. The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res. 10, 571-577 (2002).
  32. Fukova, I., et al. Probing the W chromosome of the codling moth, Cydia pomonella, with sequences from microdissected sex chromatin. Chromosoma. 116, 135-145 (2007).
  33. Thalhammer, S., Langer, S., Speicher, M. R., Heckl, W. M., Geigl, J. B. Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res. 12, 337-343 (2004).
  34. Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a chip 7. , 423-440 (2007).
  35. Hutchison, C. A., 3rd,, Venter, J. C. Single-cell genomics. Nature biotechnology. 24, 657-658 (2006).
  36. Lasken, R. S., Egholm, M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in biotechnology 21. , 531-535 (1016).
  37. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Cytogenet Genome Res. 125, 286-291 (2009).
  38. Liu, J. D., et al. Sex chromosomes in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic analysis. Cytogenet Genome Res. 98, 291-297 (2002).
  39. Harvey, S. C., et al. Molecular-cytogenetic analysis reveals sequence differences between the sex chromosomes of Oreochromis niloticus: evidence for an early stage of sex-chromosome differentiation. Cytogenet Genome Res. 97, 76-80 (2002).
  40. Hockner, M., Erdel, M., Spreiz, A., Utermann, G., Kotzot, D. Whole genome amplification from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res. 125, 98-102 (2009).
  41. Kitada, K., Taima, A., Ogasawara, K., Metsugi, S., Aikawa, S. Chromosome-specific segmentation revealed by structural analysis of individually isolated chromosomes. Genes Chromosomes Cancer. 50, 217-227 (2011).
  42. Ma, L., et al. Direct determination of molecular haplotypes by chromosome microdissection. Nature methods. 7, 299-301 (2010).
  43. Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in Locusta migratoria. Chromosome Res. 17, 11-18 (2009).
  44. Treff, N. R., Su, J., Tao, X., Northrop, L. E., Scott, R. T. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Molecular human reproduction 17. , 335-343 (2011).
  45. Rutten, K. B., et al. Chromosomal anchoring of linkage groups and identification of wing size QTL using markers and FISH probes derived from microdissected chromosomes. in Nasonia(Pteromalidae : Hymenoptera). Cytogenetic and Genome Research 105. , 126-133 (2004).
  46. Post, R. J., Kruger, A., Somiari, S. B. Laser-assisted microdissection of polytene chromosomes from Diptera for the development of molecular markers. Molecular Ecology Notes. 6, 634-637 (2006).
  47. George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-throughput physical mapping of chromosomes using automated in situ hybridization. Journal of visualized experiments : JoVE. 10, (2012).
  48. Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes. J Vis Exp. 10, (2012).
  49. Frumkin, D., et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC biotechnology. 8, 10-1186 (2008).
  50. Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environmental microbiology 71. , 3342-3347 (2005).
  51. Cassio, D. Long term culture of MDCK strains alters chromosome content. BMC Res Notes. 6, 162-1610 (2013).
  52. Landry, J. J., et al. The Genomic and Transcriptomic Landscape of a HeLa Cell Line. G3. , Bethesda. (1534).
  53. Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus. Can J Genet Cytol. 17, 241-244 (1975).
  54. Brown, S. E., et al. Toward a physical map of Aedes aegypti. Insect Mol Biol. 4, 161-167 (1995).
  55. Green, C., Hunt, R. Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles. A. parensis Gillies, and A. aruni? Genetica. 51, 187-195 (1980).
  56. Sharakhova, M. V., Xia, A., Leman, S. C., Sharakhov, I. V. Arm-specific dynamics of chromosome evolution in malaria mosquitoes. BMC evolutionary biology. 11, 10-1186 (2011).
  57. Gu, L. H., et al. DNA genotyping of oral epithelial cells by laser capture microdissection]. Fa yi xue za zhi 22. , 196-197 (2006).
  58. Rook, M. S., Delach, S. M., Deyneko, G., Worlock, A., Wolfe, J. L. Whole genome amplification of DNA from laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotide polymorphism and short tandem repeat genotyping. The American journal of pathology 164. , 23-33 (2004).
  59. Houen, A., Field, B. L., Saunders, V. A. Microdissection and chromosome painting of plant B chromosomes. Methods in cell science : an official journal of the Society for In. Vitro Biology. 23, 115-124 (2001).

Tags

Immunologi og infektion Problem 83 Mikrodissection hele genomforstærkning malaria myg polytenkromosom mitotiske kromosomer fluorescens in situ hybridisering kromosommaleri
2D og 3D kromosom maleri i malaria myg
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

George, P., Sharma, A., Sharakhov,… More

George, P., Sharma, A., Sharakhov, I. V. 2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes. J. Vis. Exp. (83), e51173, doi:10.3791/51173 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter