Summary
Kromosommålning är en användbar metod för att studera organisationen av cellkärnan och karyotypens utveckling. Här demonstrerar vi ett tillvägagångssätt för att isolera och förstärka specifika regioner av intresse från enstaka polytenkromosomer som sedan används för två- och tredimensionell fluorescerande in situ hybridisering (FISH).
Abstract
Fluorescerande in situ hybridisering (FISH) av hela armen kromosom sonder är en robust teknik för att kartlägga genomiska regioner av intresse, upptäcka kromosomal omorganiseringar och studera tredimensionell (3D) organisation av kromosomer i cellkärnan. Tillkomsten av laser capture microdissection (LCM) och hela genomförstärkning (WGA) gör det möjligt att erhålla stora mängder DNA från enstaka celler. Den ökade känsligheten hos WGA-kit fick oss att utveckla kromosomfärger och använda dem för att utforska kromosomorganisation och utveckling i icke-modellorganismer. Här presenterar vi en enkel metod för att isolera och förstärka de eukromatiska segmenten av enstaka polytenkromosomarmar från äggstockssjuksköterskeceller i den afrikanska malariamyggan Anopheles gambiae. Denna procedur ger en effektiv plattform för att erhålla kromosomfärger, samtidigt som den totala risken för att införa främmande DNA till provet minskar. Användningen av WGA möjliggör flera omgångar av omförstärkning, vilket resulterar i stora mängder DNA som kan användas för flera experiment, inklusive 2D och 3D FISH. Vi visade att de utvecklade kromosomfärgerna framgångsrikt kan användas för att upprätta korrespondensen mellan eukromatiska delar av polyten och mitotiska kromosomarmar i An. gambiae. Sammantaget ger unionen av LCM och enkelkromosom WGA ett effektivt verktyg för att skapa betydande mängder mål-DNA för framtida cytogenetiska och genomiska studier.
Introduction
Kromosommålning är en användbar teknik för att studera utvecklingen av karyotyper 1-5 och för att visualisera cytogenetiska avvikelser via hybridisering av fluorescerande märkt kromosomal DNA 1,6-8. Denna metod tillämpas också för att studera 3D-dynamiken i kromosomterritorier i utveckling 9 och patologi 10. Differentiellt märkta kromosomfärger används för visualisering av enskilda mitotiska 11,12,meiotiska 13,14eller interfasa icke-polyten 15,16 och polyten 9,11,17 kromosomer. Ett enkelt och robust protokoll för att få kromosomfärger skulle vara mycket användbart för att utöka denna teknik till icke-modellorganismer, såsom myggor. Anopheles gambiae-komplexet är en grupp av sju morfologiskt oskiljbara myggor som varierar i beteende och anpassning, inklusive förmågan att överföra malaria. Dessa myggor fungerar som en utmärkt modell för att bättre förstå utvecklingen av närbesläktade arter som skiljer sig mycket i sin vektorkapacitet. De flesta cytogenetiska studier på malariamyggor har gjorts med välutvecklade, högt polyteniserade kromosomer (granskade i 18,19). De läsbara bandningsmönstren av polytenkromosomer gjorde det möjligt för forskare att visa sambandet mellan polymorfa inversioner och ekologiska anpassningar i Anopheles gambiae 20. Vävnadsspecifika 21 och artspecifika 22 funktioner i 3D polytene kromosom organisation har karakteriserats i An. macullipennis komplex. Att studera mitotiska kromosomer kan dock ge ytterligare viktig information. Till exempel har en högre nivå av heterochromatinpolymorfism som observerats i mitotiska kromosomer korrelerats med minskad parningsaktivitet och fertilitet i An. gambiae 23. Korrespondensen mellan eukromatiska segment av polyten och mitotiska kromosomarmar kan vara svår att fastställa endast genom att jämföra deras relativa längder. Detta beror på att heterochromatin utgör en betydande del av mitotiska kromosomer, men är underrepresenterad i polytenkromosomer 24. Tillgången på kromosomfärger för malariamyggor skulle göra det möjligt för forskare att avsevärt utöka cytogenetiska studier genom att inkludera ytterligare arter, samtidigt som kostnaderna och tiden i analyserna av karyotypisk evolution och 3D-dynamik av kromosomer i denna grupp epidemiologiskt viktiga insekter skulle minskas avsevärt.
För att få stora kromosomer har mikrodissekret blivit en integrerad teknik för att manipulera och isolera specifika regioner av intresse för kromosomkomplementet. I kombination med hel genomförstärkning (WGA) resulterar mikrodissekret i kraftfulla nedströmsapplikationerinklusiveFISH 11,12 och nästa generations genomsekvensering 25-27. Tidigare krävde tekniken användning av specialiserade mikrodissektionsnålar som måste styras manuellt av en erfaren användare 28. Utvecklingen av laser capture microdissection (LCM) har resulterat i ett förenklat verktyg som är bättre lämpat för att isolera enstaka celler 29,30 eller enskilda kromosomer 31-33 med en mindre risk för kontaminering. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för användaren att studera de genetiska heterogeniteter och kromosomavvikelser som uppstår i enstaka celler, istället för ett konsensuslandskap som resulterar från sammanslagning av flera celler tillsammans 34-36. Flera metoder har använts för att förstärka DNA som framställts av mikrodissektion. DOP-PCR, en teknik som är användbar för förstärkning av mycket repetitiva sekvenser, har använts för att förstärka mikrodissekerade kromosomer från arter inklusive gräshoppan 37, den spiny ålen 38, och Nilen tilapia 39. På senare tid har PCR-baserade GenomePlex WGA4 Single Cell kit och multipla deplacementförstärkningsbaserade (MDA) Repli-G Single Cell kit blivit värdefulla verktyg för experiment som involverar genetisk analys av enstaka mänskliga celler samt kromosomer40-42, inklusive B-kromosomsystemen i gräshoppor 37 och johannesbröd 43. Dessa två satser har var och en fördelar och nackdelar, men deras uppenbara överlägsenhet över andra tillgängliga förstärkningssystem har visats 44.
Mängden DNA som kan erhållas från en enda kromosom eller ett kromosomsegment är betydligt mindre än för en hel kärna. Därför är mikrodissektion, förstärkning och efterföljande analys av en enda kromosom mycket mer utmanande, särskilt hos organismer med små genom som i Drosophila eller Anopheles. Även om färger har utvecklats från enstaka mikrodiskoplekterade kromosomer av en människa 33 och en wasp 45, krävde ett framgångsrikt FISH-experiment flera (minst 10-15) mikrodiskopekterade mitotiska kromosomer av en fruktfluga 11. Förmågan att mikrodissekera och förstärka en enda kromosom skulle dock vara viktig för i) minska risken för kontaminering med material från en annan kromosom, ii) minimera antalet kromosompreparat som behövs för mikrodissektion, iii) sänkning av nukleotid och strukturell polymorfism hos det mikrodisksekerade provet i både FISK och sekvensering nedströmstillämpningar. Polytenkromosomer som finns i många dipteranska arter erbjuder en unik möjlighet att förvärva en mycket högre startmängd DNA. De ger också en högre upplösning och kromosomstruktur som inte kan uppnås genom användning av mitotiska kromosomer. Denna extra upplösning kan vara avgörande för att visualisera kromosomomer, kromatinstruktur och kromosomsegment som ska mikrodissekeras 28,46.
Här presenterar vi ett förfarande för att effektivt isolera ett eukromatiskt segment från en enda polytenkromosomarm, förstärka DNA och använda det i nedströms FISK-applikationer i malariamyggor. Först applicerar vi LCM för att isolera och extrahera en enda kromosomarm från speciellt förberedda membranrutschbanor. För det andra används WGA för att förstärka DNA från det mikrodissekerade materialet. För det tredje hybridiserar vi det förstärkta DNA i FISH-experiment till polyten squashpreparat 47,metafas- och interfaskromosombilder 48, liksom 3D äggstocksprover. Detta förfarande har gjorts för att framgångsrikt måla en majoritet av eukromatin i kromosomvapen av An. gambiae.
Protocol
1) Polyten kromosom glidpreparering för laser capture mikrodissektion
- Dissekera halv-gravid Anopheles honor vid 25 timmar efter blodmatning. Fixera äggstockar från cirka fem honor till 500 μl färsk modifierad Carnoys lösning (100% metanol: glacial ättiksyra, 3:1) vid rumstemperatur i 24 timmar. Överför äggstockarna till -20 °C för en långtidslagring.
- Förbered Carnoys lösning (100% etanol: glacial ättiksyra, 3:1) och 50% propionsyra strax innan kromosom glider.
- Placera ett par äggstockar i en droppe Carnoys lösning på en Zeiss 1.0 PET-membranrutschbana. Beroende på storlek, dela äggstockar i cirka 2-4 sektioner med dissekerande nålar och placera dem i en droppe av 50% propionsyra på rena diabilder under ett dissekeringsmikroskop.
- Separera folliklar och ta bort återstående vävnad med pappershandduk under ett dissekeringstereomikroskop. Tillsätt en ny droppe på 50% propionsyra till folliklarna och låt dem sitta i 3-5 minuter vid rumstemperatur.
- Placera ett silikoniserat täckglas ovanpå droppen. Låt rutschkanan stå i ca 1 min.
- Täck bilden med ett absorberande material (filterpapper används för den här metoden), och när du använder radergummisidan av en penna, applicera en generös mängd tryck på täcket genom att trycka på det upprepade gånger med suddgummit.
- Värm rutschkanan till 60 °C på ett gliddenaturerings-/hybridiseringssystem i 15-20 min för att underlätta utjämningen av polytenkromosomerna. Placera diabilderna i en fuktig kammare vid 4 °C över natten så att syran kan platta till kromosomerna ytterligare.
- Placera diabilder i kall 50% etanol i 10 min. Ta försiktigt bort täcket och byt ut i kallt 50% etanol i 10 minuter till.
- Dehydrera bilder i 70%, 90%, 100% etanol i 5 min vardera. Lufttorra rutschkanor.
- Förbered en lösning av GURR-buffertlösning genom att tillsätta en enda bufferttablett till 1 L destillerat vatten. autoklav.
- Förbered Giemsa-lösningen genom att tillsätta 1 ml Giemsa färglösning till 50 ml GURR-buffert.
- Placera lufttorkade diabilder i Giemsa-lösningen i 10 min och tvätta tre gånger i 1X PBS. Lufttorka glider igen i ett kontrollerat sterilt klimat för att undvika förorening.
2) Laserfångst mikrodissekering av en enda polytenkromosomarm
Det här avsnittet beskriver användningen av PALMRobo-programvaran, som levereras med PALM MicroBeam Laser Microdissection-systemet.
- Rengör mikroskopet med 100% etanol. Sterilisera handskar och rör med UV-ljus i en UV-tvärlänk.
- Slå upp PALM MicroBeam Laser Microdissection mikroskop och slå på laser. Öppna laserav dissekeringssviten, PALMRobo, och konfigurera inställningarna "Power" och "Focus" vid behov.
- Sök efter polytenkromosomarm av intresse.
- Använd verktyget "Penna" och beturera det markerade området.
- Öppna fönstret "Element" från menyraden.
- Markera "Ritat element" och se till att du har valt "Klipp ut".
- Montera det självhäftande kapsylröret i hållaren och placera ovanför bilden, lämna ett litet mellanrum <1 mm i storlek och starta lasersnittet.
- Placera "Katapultvalet" inom skärplatsen och lämna utrymme mellan kanten och kromosomen.
- Välj "LPC" i listrutan och börja katapultera.
- Kontrollera att provet katapulterades till locket genom att trycka på ikonen "Öga".
3) Rening av DNA från en enda mikrodisksekerad polytenkromosomarm
Följ instruktionerna från QIAamp DNA Micro Kit för att frigöra och rena det insamlade DNA:t. Steg 3.1 ändrades för att rymma det inverterade röret.
- Tillsätt 15 μl Buffer ATL och 10 μl proteinas K till det inverterade röret (inuti locket) och inkubera vid 56 °C i 3 timmar.
- Tillsätt 25 μl buffert ATL, 50 μl buffert AL och 1 μl bärar-RNA; blanda. Tillsätt 50 μl 100% EtOH; blanda.
- Överför lysat till QIAamp-kolumnen; centrifug. Tvätta genom att tillsätta 500 μl buffert AW1; centrifug. Placera kolumnen i nytt uppsamlingsrör, tillsätt 500 μl buffert AW2; centrifug. Placera kolonnen i ett nytt rör; centrifugera för att avlägsna överflödig vätska.
- Placera kolonnen i ett 1,5 μl mikrocentrifugrör och tillsätt 20 μl vatten för att eluera; centrifug.
- Avdunsta nyutfräsat DNA ner till en slutlig volym på 9 μl med hjälp av en vakuumfuge.
4) Förstärkning av DNA från en enda mikrodisksekerad polytenkromosomarm
Två olika protokoll användes för WGA av en enda kromosom arm.
- DNA-förstärkning och sondberedning via GenomePlex WGA
- Följ GenomePlex WGA4 Kit-protokollet för encellig cell för att producera den första omgången förstärkt DNA:
- Tillsätt nylagad Proteinase K-lösning till provet på 9 μl. blandning. Inkubera DNA vid 50 °C i 1 timme och värm sedan till 99 °C i 4 minuter. Håll dig på is.
- Tillsätt 2 μl 1X förberedelsebuffert för enkelcelliga bibliotek och 1 μl bibliotekstabiliseringslösning; blandning. Värmeprov till 95 °C i 2 min. Svalt på is och centrifuger.
- Tillsätt 1 μl bibliotekspreparatenzym; blandning och centrifugering. Inkubera enligt följande:
- Tillsätt 7,5 μl 10X amplifierings master mix, 48,5 μl vatten. 5,0 μl WGA DNA-polymeras; blandning och centrifugering.
- Termocykl enligt följande:
- Rena DNA med hjälp av Genomic DNA Clean & Concentrateor Kit. Protokollet är följande:
- Tillsätt 5:1 DNA-bindningsbuffert:DNA-prov (speciellt för genomiskt DNA på mindre än 2 kb. Om prov-DNA är större än 2 kb, använd ett 2:1-förhållande) och överför till medföljande spinnkolonn. centrifug.
- Tillsätt 200 μl DNA-tvättbuffert och centrifuger. Upprepa tvättsteget. Tillsätt sedan 50 μl vatten och eluera DNA:t i ett nytt 1,5 ml-rör.
- Ampify prova DNA med hjälp av GenomePlex WGA3 Reamplification Kit enligt följande:
- Tillsätt 10 μl DNA till PCR-röret (satsen rekommenderar 10 ng totalt DNA) med 49,5 μl vatten, 7,5 μl 10x Amplification Master Mix, 3,0 μl 10 mM DNTP-blandning och 5,0 μl WGA DNA-polymeras. Blanda och centrifug.
- Använd följande profil för reaktionen:
- Lagra DNA vid -20 °C.
- Etikett-DNA för FISK med hjälp av GenomePlex WGA3 Reamplification Kit enligt följande:
- Skapa en huvudmix från GenomePlex WGA3 Reamplification Kit genom att tillsätta 10 μl DNA till PCR-röret med 49,5 μl vatten, 7,5 μl 10X amplifiering Master Mix, 3,0 μl 1 mM dNTP-blandning (1 mM dATP, dCTP, dGTP, 0,3 μl 1 mM dTTP - om du använder märkt dUTP), 1 μl 25 nM märkt dUTP och 5,0 μl WGA DNA-polymeras.
- Använd följande profil för reaktionen:
- Etanol fäller ut den märkta sonden genom att lägga till 1/10 den slutliga reaktionsvolymen (7,5 μl för 75 μl reaktion) på 3 M natriumacetat pH 5,2 och 2-3 volymer 100% etanol. Kyl DNA-provet vid -80 °C i minst 30 minuter.
- Centrifugprov vid 4 °C i 10 min för att skapa märkt pellets och avlägsna supernatant och lufttorr pellet.
- Skapa hybridiseringsbuffert enligt följande:
0,2 g Dextransulfat
1200 μl Avjoniserad formamid
580 μl H2O
120 μl 20X SSC - Tillsätt 40 μl hybridiseringsbuffert till lufttorkad pellet.
- Följ GenomePlex WGA4 Kit-protokollet för encellig cell för att producera den första omgången förstärkt DNA:
- DNA-förstärkning och sondberedning via REPLI-G Single Cell WGA följt av nicköversättning
- Följ REPLI-g WGA Kit-protokollet för en cell för att producera det förstärkta DNA:t:
- Förbered buffert D2 (3 μl 1 M DTT + 33 μl buffert DLB).
- Blanda 4 μl renat mikrodiskecterat material med 3 μl buffert D2. Snärtrör att blanda. Inkubera i 10 min vid 65 °C. Tillsätt 3 μl stopplösning; blanda.
- Tillsätt 9 μl H2O, 29 μl REPLI-g reaktionsbuffert och 2 μl REPLI-g DNA-polymeras i provet. Inkubera vid 30 °C i 8 timmar. Inaktivera DNA-polymeras genom uppvärmning till 65 °C i 3 min. Lagra DNA vid -20 °C.
- Följ nicköversättningsprotokollet för att märka REPLI-g-förstärkt DNA:
- Förbered följande märkningsmix:
1 μg förstärkt DNA
5 μl 10X DNA-polymerasbuffert
5 μl 10X dNTP
5 μl 1X BSA
1 μl 1 mM märkt dNTP
4 μl 1 U/μl DNase I
1 μl 10 U/μl DNA-polymeras I
H2O till 50 μl - Inkubera vid 15 °C i 2 timmar. Tillsätt 2 μl 0,5 M EDTA för att stoppa reaktionen. Kontrollera DNA-fragmentstorleken genom att köra på gel.
- Följ stegen från 4.1.4.3-4.1.4.6 för att fälla ut och löslig pellet.
- Förbered följande märkningsmix:
- Följ REPLI-g WGA Kit-protokollet för en cell för att producera det förstärkta DNA:t:
5) 2D FISH på polyten och mitotiska kromosom squashpreparat
Se detaljerade protokoll för FISH om preparat av polyten squashes 47 och mitotiska kromosombilder 48. Här ger vi korta protokoll.
- FISK på polytenkromosom squashpreparat
- Sänk ned bilderna i 1X PBS i 20 min på RT. Fäst bilderna i 4% paraformaldehyd i 1X PBS i 1 min.
- Dehydrera glider genom etanoltvättar: 50%, 70%, 90%, 100% för 5 min vardera på RT. Lufttorra diabilder.
- Förvärm sonden i hybridiseringsbuffert vid 37 °C. Tillsätt 10-20 μl sond för att skjuta. Täck med 22 X 22 mm täckslip. Tryck ut eventuella luftbubblor med en pipettspets.
- Denature kromosomer och sond vid 90 °C i 10 min. Tätningskanter av täcklip med gummicement. Överför rutschkanan till fuktig kammare och inkubera vid 39 °C över natten.
- Tvätta rutschkanorna med 1X SSC vid 39 °C i 20 min. Tvätta bilderna med 1X SSC på RT i 20 min. Skölj bilderna i 1X PBS och tillsätt sedan Prolong anti-fade med DAPI. Täck med täckslip och förvara i skjutbox vid 4 °C i minst en timme före visualisering.
- FISK på mitotiska kromosom squashpreparat
- Extrahera mitotiska kromosomer från imaginala skivor av4: e instar larva av An. gambiae.
- Förbered kromosombilder som är lämpliga för FISH.
- Tillsätt 2-3 μl märkt DNA-sond till hybridiseringsbufferten i ett rör och blanda försiktigt genom pipetting.
- Applicera 10 μl av sondblandningen på glid och täck med ett 22 X 22 mm täckslip. Tryck ut eventuella luftbubblor med en pipettspets.
- För motstning och detektion, applicera Förläng anti-toning med DAPI på preparatet och håll dig i mörker i minst en timme före visualisering.
6) 3D FISH på helmonterad äggstocksvävnad
- Förbered följande buffert A-blandning:
60 mM KCl
15 mM NaCl
0,5 mM spermidin
0,15 mM spermin
2 mM EDTA
0,5 mM EGTA
15 mM RÖR - Förbered bilder för nukleär visualisering genom att lägga till ett lager nailpolish i ett kvadratiskt mönster för att matcha storleken på täckena. Detta skapar en upphöjd yta för att förhindra squashing av atomkärnor när du placerar på täckglas i framtiden.
- Dissekera färska äggstockar från Christophers steg 3 honor och håll i en lösning av 150-250 μl buffert A med 0,5% digitonin. Kör större dissektionsnål över folliklar (i rör med buffert A med 0,5% digitonin) för att förstöra follikulärt membran.
- Virvel i 5-10 min för att ytterligare störa folliklar. Skrapa ner alla stora follikulära bitar och centrifugeringsrör i 30 sek vid lägsta inställning på ~ 500 varv per minut (RPM). Överför supernatant till ett nytt 2 ml Eppendorf-rör och tillsätt 100 μl buffert A. Upprepa steg 6.3 mellan 5-7 gånger tills den synliga vävnaden bryts i små partiklar.
- Snurra båda rören i 10 min vid 2 000 varv/min. Kassera supernatant i båda rören. Obs: Båda rören kommer att användas för att göra slutliga nukleära visualiseringsbilder. Röret med uppsamlat supernatant bör huvudsakligen innehålla extraherade atomkärnor, medan det ursprungliga röret med vävnad kommer att innehålla en blandning av vävnad och atomkärnor inbäddade i sjuksköterskans celler. Tillsätt 200 μl buffert A – 0,1 % triton och inkubera över natten vid 4 °C. Centrifug 5 min vid 10 000 varv/min (10 621 x G) och ta bort supernatant.
- Tillsätt 200 μl 4% paraformaldehyd i PBS. Inkubera i termomixer i 30 min, blanda vid 450 varv/min. Centrifug 5 min vid 5 000 varv/min (2 655 x G) och ta bort supernatant. Tvätta med buffert A med 0,1% Triton i 5 min, blanda vid 450 RPM i termomixer. Centrifug 5 min vid 5 000 varv/min (2 655 G) och ta bort supernatant.
- Tillsätt förvärmd vid 37 °C märkt sond till röret. Denatur vid 95 °C i termomixer, blandning vid 450 varv/min, i 10 min. Fortsätt denaturationen vid 80 °C i 15 minuter med fortsatt blandning. Inkubera vid 37 °C i termomixer, med 450 varv/min som blandas över natten. Centrifugera 5 min vid 5 000 varv/min (2 655 x G). Ta bort supernatant.
- Tvätta med buffert A med 0,1% Triton i 5 min. Centrifugera 5 min vid 5 000 varv/min (2 655 x G). Upprepa 2 gånger. Applicera droppe Förlängning Anti-fade med DAPI.
- Pipet ut nuclei/DAPI lösning försiktigt (undvika bubblor), applicera på glid och täck med täckglas.
Representative Results
Figur 1 beskriver det övergripande genomflödet av det protokoll som beskrivs i den här artikeln. Användaren börjar initialt med att mikrodissekera kromosom-DNA-prover från membranbilder. Mikrodiskecterat material extraheras och renas. Det renade DNA:t förstärks sedan, förstärks, märks och används sedan för FISH för att märka kromosomspridningar.
LCM-protokollet kan delas upp i tre övergripande steg: 1) Hitta kromosomer av intresse och förbereda regionen för skärning (figur 2A), 2) Skärning och katapultering av kromosomområdet av intresse via laser(figur 2B) och 3) Kontroll för att avgöra om provet faktiskt katapulteras till självhäftande lock(figur 2C). Processen med LCM som används på An. gambiae Sua stam polytene kromosomer visas i video 1. Videon beskriver hela processen från programstart, inklusive viktiga programvarufunktioner och tips.
GenomePlex och REPLI-g encelliga WGA-kit som används i detta protokoll skiljer sig mycket åt i resulterande produktstorlek samt total avkastning. Figur 3 visar resultaten av gelelektrofores som körts för GenomePlex- och REPLI-g-kiten, samt kvantifiering av proverna av Nanodrop.
Mikrodiskuterat material har använts för att skapa FISH-sonder som riktar sig mot eukromatiska regioner i en kromosom. Figur 4 visar FISK av fem sonder som genereras från mikrodiskuterat material på polytenkromosomer av An. gambiae. Fyra autosomala armar var märkta med tre fluorforer med WGA3-kit: 3R-kromosomen är märkt i grönt (fluorescein), 3L-kromosomen är i en blandning av rött (Cy-3) och gult (Cy-5), 2R-kromosomen är i gult (Cy-5) och 2L-kromosomen är i rött (Cy-3). X-kromosomen var märkt i orange (Cy-3) med hjälp av nicköversättning av REPLI-g-materialet i ett separat experiment. För att fastställa korrespondensen mellan eukromatiska delar av polyten och mitotiska kromosomarmar har kromosomfärger hybridiserats till interfas- och profas-, prometafas- och metafaskromosomer i An. gambiae (Figur 5). För att visualisera 3D-organisationen av en enda polytene kromosom arm i cellkärnan, hela berget FISH utfördes på An. gambiae Sua stam äggstockscancer sjuksköterska celler (Video 2). Distinkta kromosomarmterritorier ses tydligt i atomkärnor med interfas(figur 5D)och polyten (Video 2) kromosomer.
Figur 1. Schematisk representation av de experimentella förfarandena mot beredning av kromosomfärger. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 2. De viktigaste stegen i kromosommikrodissektion. A) Laserassisterad skärning av den kromosomala intresseregionen genom membranet. B) Membranet med ett hål efter katapulteringen utförs. C) Utsikten över den katapulterade delen av membranet med ett kromosomsegment i det fäst vid limlocket. Pilen anger heterochromatinet för X-kromosomen som fanns kvar på bilden. Asterisken visar en bit av en annan kromosom som fanns kvar på bilden. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 3. Agarose gel bilder som visar DNA efter WGA. A) Låg molekylvikt (200-500 bp) DNA från arm 3R efter användning av WGA4- och WGA3 GenomePlex-satserna. B) Hög molekylvikt (10-20 kb) DNA från arm 2L efter REPLI-g förstärkning. Stegen på 100 bp visas i vänster körfält. Tabellerna nedan visar DNA-koncentrationer mätta med Nanodrop. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 4. Målning av polytenkromosomer från äggstockssjuksköterskeceller i An. gambiae med hjälp av fyra sonder genererade av mikrodiskopekt material. X-kromosomen är märkt i orange (Cy-3) genom nicköversättning av REPLI-g-materialet. 2R-armen är märkt i gult (Cy-5); 2L-armen är i rött (Cy-3); 3R-armen är märkt i grönt (fluorescein); 3L-armen är märkt i en blandning av rött (Cy-3) och gult (Cy-5). Autosomes är märkta med WGA3-förstärkningssatsen. Kromatin är färgat i blått (DAPI). Kromosomnamn placeras nära telomeriska regioner. Klicka här om du vill visa större bild.
Figur 5. Målning av interfas (A), profas (B), prometafas (C) och metafas (D) kromosomer från larv imaginala skivor av An. gambiae Mopti stam med hjälp av tre sonder genereras från mikrodissekerat material märkt av WGA3. 2R-armen är märkt i grönt (fluorescein); 2L-armen är omärkt; 3R-armen är i rosa, en blandning av rött (Cy-3) och orange (Cy-5); 3L-armen är märkt med orange (Cy-5). X-kromosomen har en röd etikett som motsvarar 18S rDNA-sonden. Kromatin är färgat i blått (DAPI). Ljust färgade områden av kromosomer motsvarar heterochromatin. Klicka här om du vill visa större bild.
Video 1. Processen med LCM av An. gambiae polytene kromosomer. Klicka här om du vill visa video 1.
Video 2. Hela berget 3D FISH utförs på An. gambiae äggstockscancer sjuksköterska celler. Sonden är märkt i Cy-3 (avbildad i blått) och är tillverkad av en mikrodisksekerad 2R-kromosomarm. Kromatin var färgat med DAPI och avbildas av cyan pseudofärgning (ljusblå). Klicka här om du vill visa video 2.
Discussion
Det finns flera steg som är avgörande för att framgångsrikt förstärka DNA från mikrodiskoplekterade polytenkromosomprover. Protokollet använder användningen av LCM, en metod som både ökar den totala effektiviteten och minskar exponeringen för främmande DNA genom att ta bort interaktionen mellan fysiska verktyg och provet. Förstärkningen av utländskt DNA är dock fortfarande den största potentiella fallgropen i detta experiment. Under hela processen är det därför viktigt att hålla proverna skyddade mot kontaminering. Under hela bildberedningen och mikrodissektionsfaserna är det viktigt att etanol tvätta dissekeringsnålar, diabilder, täckslipsar och arbetsytan. Det rekommenderas också att UV behandla all tillämplig utrustning (nålar, diabilder, täckglas) före användning.
Membranet på dissekeringsbilderna gör det mycket svårt att sprida kromosomerna. Det är viktigt att använda mer av äggstocken (hälften till ett helt par äggstockar) när du gör dessa bilder, för att ge en större chans att hitta en väl spridd kärna. Det rekommenderas också att använda färsk vävnad när du gör diabilder, eftersom förstärkningshastigheterna verkar sjunka när vävnader i åldern 49 och kromosomspridning blir mer utmanande. Förberedelsen av bilder för mikrodissektion är det mest tidskrävande steget i det här protokollet. Kromosomer måste vara väl spridda för att undvika oavsiktligt förvärv av oönskat material. Giemsa färgning gör det möjligt för användaren att kontrollera spridningskvaliteten med ett faskontrastmikroskop innan mikrodissektionssystemet används.
Kombinationen av mikrodissektion och förstärkning ger möjlighet att extrahera och analysera kromosomfragment i storlek från små regioner av intresse till en majoritet av armarna. Detta protokoll gör det möjligt för användaren att erhålla DNA från morfologiskt distinkta regioner såsom inversioner, specifika eukromatiska band och interband, telomeriska, centromeriska och intercalary heterochromatin. Användaren kan tillämpa de genererade målarsonderna på att undersöka avvikande kromosomer, studera inter-species homologi vid vissa lokus eller karakterisera rumslig organisation av kromosomer i en intakt 3D-kärna. För att utveckla kromosomfärger valde vi eukromatiska segment för att undvika hybridisering av repetitivt DNA med flera kromosomregioner. Som ett resultat erhöll vi armspecifik målning utan att använda en konkurrent, som totalt genomiskt DNA eller C0t-1 DNA-fraktion.
Vi valde att använda GenomePlex WGA och REPLI-G kit baserat på recensioner som jämförde effektiviteten och avhoppen för flera förstärkningssatser 40,44. Båda satserna presterade bäst bland de tillgängliga metoderna i båda avhoppsfrekvensen (GenomePlex hade en hastighet på 12,5% jämfört med REPLI-g: s 37,5%) och procentandel av förstärkta markörer (GenomePlex hade en 45,24% förstärkningshastighet jämfört med REPLI-g: s 30,0%) 40.GenomePlex-kitet gav också en högre mängd DNA och gjorde det därmed till en bättre kandidat för flera nedströmstekniker. Ett återförstärkningskit för GenomePlex-systemet finns också tillgängligt, vilket möjliggör ytterligare förstärkning av DNA. Det är dock viktigt att notera att förstärkning inte är perfekt. Möjligheten kvarstår att framgångsrik förstärkning kan införa fel eller ha en fördom mot specifika lokus i mål-DNA. Det är viktigt att överväga den slutliga fragmentstorleken för de tillgängliga genomförstärkningsmetoderna. GenomePlex fragmentering resulterar i ett bibliotek med fragment som sträcker sig från 200-500 bp, medan REPLI-g kit producerar fragment som är ungefär 10-20 kb stora. Den avsedda nedströms tillämpningen av detta protokoll är FISH, vilket gör GenomePlex-kitet till ett mer genomförbart alternativ, eftersom det gav önskad fragmentstorlek och förmågan att märka DNA-fragment direkt genom WGA. Långa DNA-molekyler som produceras av REPLI-g-förstärkningen måste fragmenteras i nedströms nick-översättningsmärkningsreaktionen.
Detta protokoll har anpassats för att framgångsrikt förstärka DNA från en enda polytene kromosom arm. Andra protokoll kräver poolning av många (vanligtvis 10-30) kromosomfragment för att kunna förstärka provet 7,11,28,40. Även om poolning av flera kromosomer är möjligt med vår metod, betonar den ökade sannolikheten för provkontaminering vikten av att börja experimentet med så få kromosomer som möjligt. Om polytenkromosomer inte är tillgängliga kan vårt protokoll anpassas för användning i mitotiska kromosomer. Det kan dock vara nödvändigt att samla 10-15 mitotiska kromosomer före förstärkning för framgångsrik FISH 11. Förstärkningsbias är lägre med stora mängder startmall DNA 50. Polytenkromosomer ger cirka 512 kopior av en enda DNA-sekvens och 1024 kopior av två homologa DNA-sekvenser. Således, poolning mitotiska kromosomer kommer att bidra till att öka den övergripande kvaliteten på DNA-produkten efter förstärkning.
Denna procedur har många potentiella användningsområden i cytogenetiska och genomiska studier. Här använde vi kromosomfärger för att upprätta korrespondensen mellan eukromatiska segment av polyten och mitotiska kromosomarmar i An. gambiae. Samma målning sonder kan tillämpas på cytogenetiska karakterisering av An. gambiae cellinjer. Omfattande genomiska omorganiseringar och förändringar i kromosomnummer är vanliga egenskaper hos cellinjerna 51,52. Aneuploidi, polyploidi och kromosomala omorganiseringar som flyttningar, inversioner, borttagningar och ringkromosomer har upptäckts i olika myggcellslinjer 53,54. Klassiska cytogenetiska observationer 55 och fysisk kartläggning 56 har visat förekomsten av helarm kromosomal flyttningar i utvecklingen av malaria myggor. Därför kan mikrodeklekt material användas tillsammans med FISK-experiment för att jämföra homologi av kromosomala regioner mellan arter. Vi framgångsrikt utfört 3D FISH med 2R-målning sonden på polytene kromosomer i hela mount äggstockscancer sjuksköterska celler. Denna metod kommer att underlätta spårning av kromosombanor och studera kärnarkitekturen i Anopheles. Tekniker som DNA-genotypning 57,58, nästa generations genomsekvensering 26,27, fysisk och länkande kartutveckling och generering av sonder för kromosommålning 33,59 kan alla dra nytta av arm- och regionspecifik mikrodissektion. Genom att kombinera LCM-teknik och främja encellig WGA visar vi en effektiv, praktisk metod för att producera rimliga mängder DNA från en enda polytenkromosomarm.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av bidraget från National Institutes of Health 1R21AI094289 till Igor V. Sharakhov
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A491-212 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A412-4 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 402907 | |
| Membrane slides 1.0 PET | Zeiss | 415190-9051-000 | |
| Buffer tablets “GURR” | Life Technologies | 10582-013 | |
| KaryoMAX Giemsa Stain | Life Technologies | 10092-013 | |
| ThermoBrite Slide Denaturation/Hybridization System | Abbott Molecular | 30-144110 | |
| Vacufuge vacuum concentrator | Eppendorf | 22820001 | |
| Spectroline Microprocessor-Controlled UV Crosslinker XL-1000 | Fisher Scientific | 11-992-89 | |
| Thermo Scientific NanoDrop | Fisher Scientific | ND-2000 | |
| REPLI-g Single Cell Kit | Qiagen | 150343 | |
| GenomePlex Single Cell Kit (WGA4) | Sigma-Aldrich | WGA4-10RXN | |
| GenomePlex WGA Reamplification Kit (WGA3) | Sigma-Aldrich | WGA3-50RXN | |
| MZ6 Leica stereomicroscope | Leica | VA-OM-E194-354 | A different stereomicroscope can be used |
| Olympus CX41 Phase Microscope | Olympus | CX41RF-5 | A different phase microscope can be used |
| PALM MicroBeam Laser Microdissection Microscope | Zeiss | ||
| Thermomixer | Eppendorf | 22670000 | |
| 10x PBS | Invitrogen | P5493 | |
| 50x Denhardt’s solution | Sigma-Aldrich | D2532 | |
| 99% Formamide | Fisher Scientific | BP227500 | |
| Dextran sulfate sodium salt | Sigma | D8906 | |
| 20x SSC buffer | Invitrogen | AM9765 | |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| dATP, dCTP, dGTP, dTTP | Fermentas | R0141, R0151, R0161, R0171 | |
| Cy3-dUTP, Cy5-dUTP | GE Healthcare | PA53022, PA55022 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A3294 | |
| DNA polymerase I | Fermentas | EP0041 | |
| DNase I | Fermentas | EN0521 | |
| Spermine | Sigma-Aldrich | S3256-1G | |
| Spermidine | Sigma-Aldrich | S0266-1G | |
| Potassium Chloride (KCl) | Fisher Scientific | BP366-500 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | BP3581 | |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E0396-25G | |
| PIPES | Sigma-Aldrich | P6757-25G | |
| EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | |
| Digitonin | Sigma-Aldrich | D141-100MG | |
| Triton-X100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| AdhesiveCap 500 clear | Zeiss | 415190-9211-000 | |
| QIAamp DNA Micro Kit (50) | Qiagen | 56304 | |
| Genomic DNA Clean and Concentrator Kit | Zymo Research | D4010 | |
| 37% Paraformaldehyde | Fisher Scientific | F79-500 |
References
- Ried, T., Schrock, E., Ning, Y., Wienberg, J. Chromosome painting: a useful art. Human molecular genetics 7. , 1619-1626 (1998).
- Yang, F., et al. Reciprocal chromosome painting illuminates the history of genome evolution of the domestic cat, dog and human. Chromosome Res. 8, 393-404 (2000).
- Badenhorst, D., Dobigny, G., Robinson, T. J. Karyotypic evolution of hapalomys inferred from chromosome painting: a detailed characterization contributing new insights into the ancestral murinae karyotype. Cytogenet Genome Res 136. , 83-88 (2012).
- Trifonov, V. A., et al. Chromosomal evolution in Gekkonidae. I. Chromosome painting between Gekko and Hemidactylus species reveals phylogenetic relationships within the group. Chromosome Res. 19, 843-855 (2011).
- Nie, W., et al. Chromosomal rearrangements and karyotype evolution in carnivores revealed by chromosome painting. Heredity (Edinb. , 108-1017 (2012).
- Guan, X. Y., et al. Detection of chromosome 6 abnormalities in melanoma cell lines by chromosome arm painting probes). Cancer Genet Cytogenet. 107, 89-92 (1998).
- Guan, X. Y., et al. Characterization of a complex chromosome rearrangement involving 6q in a melanoma cell line by chromosome microdissection. Cancer genetics and cytogenetics 134. , 65-70 (2002).
- Breen, M., et al. Detection of equine X chromosome abnormalities in equids using a horse X whole chromosome paint probe (WCPP). Vet J. 153, 235-238 (1997).
- Kokhanenko, A. A., Anan'ina, T. V., Stegniy, V. N. The changes in chromosome 6 spatial organization during chromatin polytenization in the Calliphora erythrocephala Mg. (Diptera: Calliphoridae) nurse cells. Protoplasma 250. , 141-149 (2013).
- Timme, S., et al. Nuclear position and shape deformation of chromosome 8 territories in pancreatic ductal adenocarcinoma. Anal Cell Pathol (Amst. 34, 21-33 (2011).
- Drosopoulou, E., et al. Sex chromosomes and associated rDNA form a heterochromatic network in the polytene nuclei of Bactrocera oleae (Diptera: Tephritidae). Genetica. 140, 169-180 (2012).
- Pazian, M. F., Shimabukuro-Dias, C. K., Pansonato-Alves, J. C., Oliveira, C., Foresti, F. Chromosome painting of Z and W sex chromosomes in Characidium (Characiformes). Crenuchidae). Genetica. 141, 1-9 (2013).
- Howe, E. S., Murphy, S. P., Bass, H. W. Three-dimensional acrylamide fluorescence in situ hybridization for plant cells. Methods Mol Biol 990. , 53-66 (2013).
- Lysak, M. A., Mandakova, T. Analysis of plant meiotic chromosomes by chromosome painting. Methods Mol Biol 990. , 13-24 (2013).
- Ji, Z., Zhang, L. Chromosomics: detection of numerical and structural alterations in all 24 human chromosomes simultaneously using a novel OctoChrome FISH assay. J Vis Exp. 10, (2012).
- Idziak, D., et al. Painting the chromosomes of Brachypodium: current status and future prospects. Chromosoma. 120, 469-479 (2011).
- Fuchs, J., Kuhfittig, S., Reuter, G., Schubert, I. Chromosome painting in Drosophila. Chromosome Res. 6, 335-336 (1998).
- Zhimulev, I. F. Morphology and structure of polytene chromosomes. 34, Academic Press. 1-490 (1996).
- Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. in Chromosome Mapping Research Developments eds. J.F. Verrity & L.E. Abbington) (Nova Science. , Publishers, Inc. (2008).
- Coluzzi, M., Sabatini, A., Torre, della, Di Deco, A., A, M., Petrarca, V. A polytene chromosome analysis of the Anopheles gambiae species complex). Science. 298, 1415-1418 (2002).
- Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malaria mosquitoes. Genetika. 23, 821-827 (1987).
- Stegnii, V. N. Systemic reorganization of the architectonics of polytene chromosomes in the onto- and phylogenesis of malarial mosquitoes. II. Species specificity in the pattern of chromosome relations with the nuclear envelope of nutrient ovarian cells. Genetika. 23, 1194-1199 (1987).
- Bonaccorsi, S., Santini, G., Gatti, M., Pimpinelli, S., Colluzzi, M. Intraspecific polymorphism of sex chromosome heterochromatin in two species of the Anopheles gambiae complex. Chromosoma. 76, 57-64 (1980).
- Zhimulev, I. F. Polytene chromosomes, heterochromatin, and position effect variegation. Adv Genet. 37, 1-566 (1998).
- Seifertova, E., et al. Efficient high-throughput sequencing of a laser microdissected chromosome arm. BMC Genomics. 14, 1471-2164 (2013).
- Weise, A., et al. High-throughput sequencing of microdissected chromosomal regions. European journal of human genetics. EJHG. 18, 457-462 (2010).
- Murphy, S. J., et al. Mate pair sequencing of whole-genome-amplified DNA following laser capture microdissection of prostate cancer. DNA research : an international journal for rapid publication of reports on genes and genomes 19. , 395-406 (2012).
- Moshkin, Y. M., et al. Microdissection and sequence analysis of pericentric heterochromatin from the Drosophila melanogastermutant Suppressor of Underreplication. Chromosoma. 111, 114-125 (2002).
- Decarlo, K., Emley, A., Dadzie, O. E., Laser Mahalingam, M. capture microdissection: methods and applications. Methods Mol Biol 755. , 1-15 (2011).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. 10, (2010).
- Kubickova, S., Cernohorska, H., Musilova, P., Rubes, J. The use of laser microdissection for the preparation of chromosome-specific painting probes in farm animals. Chromosome Res. 10, 571-577 (2002).
- Fukova, I., et al. Probing the W chromosome of the codling moth, Cydia pomonella, with sequences from microdissected sex chromatin. Chromosoma. 116, 135-145 (2007).
- Thalhammer, S., Langer, S., Speicher, M. R., Heckl, W. M., Geigl, J. B. Generation of chromosome painting probes from single chromosomes by laser microdissection and linker-adaptor PCR. Chromosome Res. 12, 337-343 (2004).
- Sims, C. E., Allbritton, N. L. Analysis of single mammalian cells on-chip. Lab on a chip 7. , 423-440 (2007).
- Hutchison, C. A., 3rd,, Venter, J. C. Single-cell genomics. Nature biotechnology. 24, 657-658 (2006).
- Lasken, R. S., Egholm, M. Whole genome amplification: abundant supplies of DNA from precious samples or clinical specimens. Trends in biotechnology 21. , 531-535 (1016).
- Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in the grasshopper Eyprepocnemis plorans. Cytogenet Genome Res. 125, 286-291 (2009).
- Liu, J. D., et al. Sex chromosomes in the spiny eel (Mastacembelus aculeatus) revealed by mitotic and meiotic analysis. Cytogenet Genome Res. 98, 291-297 (2002).
- Harvey, S. C., et al. Molecular-cytogenetic analysis reveals sequence differences between the sex chromosomes of Oreochromis niloticus: evidence for an early stage of sex-chromosome differentiation. Cytogenet Genome Res. 97, 76-80 (2002).
- Hockner, M., Erdel, M., Spreiz, A., Utermann, G., Kotzot, D. Whole genome amplification from microdissected chromosomes. Cytogenet Genome Res. 125, 98-102 (2009).
- Kitada, K., Taima, A., Ogasawara, K., Metsugi, S., Aikawa, S. Chromosome-specific segmentation revealed by structural analysis of individually isolated chromosomes. Genes Chromosomes Cancer. 50, 217-227 (2011).
- Ma, L., et al. Direct determination of molecular haplotypes by chromosome microdissection. Nature methods. 7, 299-301 (2010).
- Teruel, M., et al. Microdissection and chromosome painting of X and B chromosomes in Locusta migratoria. Chromosome Res. 17, 11-18 (2009).
- Treff, N. R., Su, J., Tao, X., Northrop, L. E., Scott, R. T. Single-cell whole-genome amplification technique impacts the accuracy of SNP microarray-based genotyping and copy number analyses. Molecular human reproduction 17. , 335-343 (2011).
- Rutten, K. B., et al. Chromosomal anchoring of linkage groups and identification of wing size QTL using markers and FISH probes derived from microdissected chromosomes. in Nasonia(Pteromalidae : Hymenoptera). Cytogenetic and Genome Research 105. , 126-133 (2004).
- Post, R. J., Kruger, A., Somiari, S. B. Laser-assisted microdissection of polytene chromosomes from Diptera for the development of molecular markers. Molecular Ecology Notes. 6, 634-637 (2006).
- George, P., Sharakhova, M. V., Sharakhov, I. V. High-throughput physical mapping of chromosomes using automated in situ hybridization. Journal of visualized experiments : JoVE. 10, (2012).
- Timoshevskiy, V. A., Sharma, A., Sharakhov, I. V., Sharakhova, M. V. Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes. J Vis Exp. 10, (2012).
- Frumkin, D., et al. Amplification of multiple genomic loci from single cells isolated by laser micro-dissection of tissues. BMC biotechnology. 8, 10-1186 (2008).
- Raghunathan, A., et al. Genomic DNA amplification from a single bacterium. Applied and environmental microbiology 71. , 3342-3347 (2005).
- Cassio, D. Long term culture of MDCK strains alters chromosome content. BMC Res Notes. 6, 162-1610 (2013).
- Landry, J. J., et al. The Genomic and Transcriptomic Landscape of a HeLa Cell Line. G3. , Bethesda. (1534).
- Steiniger, G. E., Mukherjee, A. B. Insect chromosome banding: technique for G- and Q-banding pattern in the mosquito Aedes albopictus. Can J Genet Cytol. 17, 241-244 (1975).
- Brown, S. E., et al. Toward a physical map of Aedes aegypti. Insect Mol Biol. 4, 161-167 (1995).
- Green, C., Hunt, R. Interpretation of variation in ovarian polytene chromosomes of Anopheles funestus Giles. A. parensis Gillies, and A. aruni? Genetica. 51, 187-195 (1980).
- Sharakhova, M. V., Xia, A., Leman, S. C., Sharakhov, I. V. Arm-specific dynamics of chromosome evolution in malaria mosquitoes. BMC evolutionary biology. 11, 10-1186 (2011).
- Gu, L. H., et al. DNA genotyping of oral epithelial cells by laser capture microdissection]. Fa yi xue za zhi 22. , 196-197 (2006).
- Rook, M. S., Delach, S. M., Deyneko, G., Worlock, A., Wolfe, J. L. Whole genome amplification of DNA from laser capture-microdissected tissue for high-throughput single nucleotide polymorphism and short tandem repeat genotyping. The American journal of pathology 164. , 23-33 (2004).
- Houen, A., Field, B. L., Saunders, V. A. Microdissection and chromosome painting of plant B chromosomes. Methods in cell science : an official journal of the Society for In. Vitro Biology. 23, 115-124 (2001).
