Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية

Published: April 17, 2014 doi: 10.3791/51176
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Materials Science and Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

ووصف طريقة للحصول على ألياف النانو والنانو معقدة من واحد أو عدة البروتينات المصفوفة خارج الخلية. يستخدم هذا الأسلوب تفاعلات البروتين السطحي لخلق مواد البروتين على أساس قائمة بذاتها مع تكوين الانضباطي والهندسة المعمارية لاستخدامها في مجموعة متنوعة من التطبيقات هندسة الأنسجة والتكنولوجيا الحيوية.

Abstract

ويتم تصنيع المصفوفة خارج الخلية (ECM) في الأنسجة وتجميعها من قبل الخلايا لتشكيل ييفي 3D، شبكة البروتين مع تنظيم محكم قطر الألياف وتكوينها وتنظيمها. بالإضافة إلى توفير الدعم الهيكلي، والخصائص الفيزيائية والكيميائية للECM تلعب دورا هاما في العمليات الخلوية متعددة بما في ذلك التصاق، والتمايز، وموت الخلايا المبرمج. في الجسم الحي، يتم تجميعها في ECM من خلال تعريض خفي التجميع الذاتي (اللييفات) مواقع داخل البروتينات . هذه العملية تختلف عن البروتينات المختلفة، ولكن فبرونيكتين (FN) اللييفات هو، تتميز بشكل جيد ويخدم كنظام نموذج لبوساطة خلية التجمع ECM. على وجه التحديد، وخلايا المستقبلات استخدام إنتغرين على غشاء الخلية لربط dimers FN والقوات مقلص ولدت أكتوميوزين تتكشف وفضح مواقع الربط لتجميع ألياف غير قابلة للذوبان في. هذه العملية بوساطة مستقبلات الخلايا تمكن لتجميع وتنظيم ECM من الأنسجة الخلوية لهيئة السلع التموينيةليه. هنا، نقدم طريقة تسمى بمبادرة سطح التجمع (SIA)، والذي يلخص الخلية بوساطة تجميع مصفوفة باستخدام تفاعلات البروتين على سطح تتكشف البروتينات ECM وتجميعها إلى ألياف غير قابلة للذوبان. الأولى، وكثف البروتينات ECM الصعود إلى polydimethylsiloxane مسعور (PDMS) السطح حيث أنها تفسد جزئيا (تتكشف) وفضح المجالات ملزمة خفي. ثم يتم تحويل البروتينات تكشفت في واضحة المعالم الدقيقة وnanopatterns من خلال microcontact الطباعة على بولي حراريا استجابة (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) السطح. حل أثار حراريا للPIPAAm يؤدي إلى التجميع النهائي وإطلاق سراح غير قابلة للذوبان ألياف النانو البروتين ECM والنانو مع هندستها واضحة المعالم. أبنية معقدة ممكنة عن طريق الهندسة تعريف أنماط على الطوابع PDMS تستخدم لmicrocontact الطباعة. بالإضافة إلى FN، ويمكن استخدام عملية SIA مع laminin، الفيبرينوجين والكولاجين النوع الأول والرابع لخلق متعددة المكونات النانوية ECMتوريس. وبالتالي، SIA يمكن استخدامها لهندسة المواد القائمة على البروتين ECM مع مراقبة دقيقة على تكوين البروتين، والألياف وهندسة العمارة السقالة من أجل تلخيص هيكل وتكوين ECM في الجسم الحي.

Introduction

وتتكون المصفوفة خارج الخلية (ECM) في أنسجة متعددة الوظائف البروتينات المشاركة في تنظيم الفيزيائية والكيميائية للعمليات الخلية متعددة بما في ذلك التصاق، والانتشار، والتمايز، وموت الخلايا المبرمج 1-3. يتم تصنيعه في ECM، وتجميعها، والذي نظمته الخلايا والألياف البروتين المكونة لها تركيبة فريدة من نوعها، وحجم الألياف، وهندستها المعمارية المترابطة التي تختلف مع نوع الأنسجة والمرحلة التنموية. وقد أظهرت الأعمال الأخيرة أن ECM يمكن أن توفر العظة مفيدة لتوجيه الخلايا لتشكيل الأنسجة المهندسة 4، مما يدل على أن تلخص في ECM من حيث تكوينها وهيكلها قد تمكن من وضع المواد بيوميمتيك لتطبيقات هندسة الأنسجة والتكنولوجيا الحيوية.

وقد تم تطوير عدد من الأساليب لتصنيع السقالات هندسة البوليمر التي يمكن أن تحاكي جوانب ECM في الأنسجة. على سبيل المثال، وelectrospinning المرحلة separأوجه أثبتت كل من القدرة على تشكيل المصفوفات التي يسهل اختراقها من الألياف بأقطار تتراوح بين عشرات ميكرومتر وصولا الى عشرات نانومتر 5-7. وقد أظهرت كل من التقنيات أيضا أن المصفوفات التي يسهل اختراقها للغاية من ألياف النانو يمكن أن تدعم التصاق الخلية والتسلل إلى السقالة 8. ومع ذلك، هذه المناهج تقتصر في هندستها الألياف والتوجهات و3D أبنية المحتملة التي يمكن أن تنشأ. Electrospinning تنتج عادة السقالات مع ألياف إما موجهة بشكل عشوائي أو الانحياز للغاية في حين أن مرحلة الانفصال تنتج السقالات بألياف موجهة بشكل عشوائي. وهناك أيضا قيود على المواد، وعادة ما تستخدم مع البوليمرات الاصطناعية الباحثين، مثل بولي (ε-caprolactone) (8) وبولي (حمض اللبنيك المشترك، الجليكوليك) 9، والتي هي المغلفة في وقت لاحق مع بروتينات ECM لتعزيز التصاق الخلية. وتستخدم البوليمرات الحيوية الطبيعية أيضا، بما في ذلك نوع الكولاجين أنا 10، والجيلاتين 11، 12 الفيبرينوجين،الشيتوزان 13، والحرير 14، ولكن لا تمثل سوى مجموعة فرعية صغيرة من البروتينات الموجودة في الأنسجة الأصلية. معظم الأنسجة تحتوي على الوسط أكبر من البروتينات والسكريات بما في ذلك ECM فبرونيكتين (FN)، laminin (LN)، ونوع الكولاجين الرابع وحمض الهيالورونيك التي يصعب أو يستحيل افتعال ألياف النانو باستخدام الأساليب القائمة.

لمواجهة هذا التحدي، فقد ركزنا جهودنا البحثية على محاكاة طريقة تجميع الخلايا وتجميع وتنظيم الألياف البروتين ECM في محيطهم. في حين أن عملية تكون اللييفات معين يختلف عن البروتينات ECM مختلفة، وعادة ما يتم تشغيل تغيير متعلق بتكوين جزئي في جزيء البروتين ECM من قبل الأنزيمية أو التفاعل بوساطة مستقبلات، الذي يعرض مواقع التجميع الذاتي خفي. نحن هنا استخدام FN كنظام نموذج لفهم أفضل لعملية اللييفات. لفترة وجيزة، homodimers FN ربط إنتغرين المستقبلات على سطح الخلية عبر تسلسل الأحماض الأمينية RGD في نوع 10 IIأكرر حدة. مرة واحدة ملزمة، وبصرف النظر لل integrins التحرك عبر أكتوميوزين الانكماش وتتكشف dimers FN لفضح مواقع التجميع الذاتي خفي. تعرض هذه المواقع ملزمة FN-FN تمكن dimers FN لتجميع الى يفية غير قابلة للذوبان الحق على سطح الخلية 15. وقد أثبت العمل في أنظمة خالية من الخلايا أن مواقع ملزمة FN-FN خفي يمكن كشف من خلال تتكشف باستخدام denaturants 16 أو التوتر السطحي في ل-السائل الصلبة واجهة الهواء 17-19. ومع ذلك، يتم تقييد الألياف FN إنشاؤها بواسطة هذه التقنيات إلى أحجام الألياف محددة وهندستها وعادة ما تكون منضمة إلى السطح.

نحن هنا تصف وصف التجمع بمبادرة سطح النهج (SIA) 20 أن يتغلب على هذه القيود من خلال الاستفادة من التفاعلات بروتين السطح لخلق بذاتها غير قابلة للذوبان ألياف النانو، nanofabrics (أوراق 2D) والنانو أخرى تتكون من البروتينات ECM واحدة أو متعددة (الشكل 1 ). في هذه الصفحةrocess، وكثف من البروتينات ECM المدمجة، والتشكل كروية في حل والتشويه والتحريف جزئيا (كشف) في الصعود إلى منقوشة، polydimethylsiloxane مسعور (PDMS) ختم. ثم يتم تحويل البروتينات ECM في هذه الولاية على بولي حراريا استجابة (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) السطح من خلال microcontact الطباعة 22. عندما رطب مع 40 درجة مئوية الماء يبقى PIPAAm صلبة، ولكن عندما تبرد إلى 32 درجة مئوية فإنه يمر من خلال درجة حرارة المحلول أقل الحرجة (LCST) حيث يصبح ماء، تتضخم مع الماء ثم يذوب، والإفراج عن النانو ECM تجميعها الخروج من السطح. يوفر طريقة SIA السيطرة على أبعاد بدقة نانومتر النطاق. من خلال التحكم في المعايير الأساسية مثل تكوين، والهندسة الألياف، والهندسة المعمارية، فمن الممكن أن ألخص العديد من الخصائص من ECM وجدت في الجسم الحي، ووضع السقالات المتقدمة لتطبيقات هندسة الأنسجة والتكنولوجيا الحيوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. تلفيق مقلب ماجستير عن طريق الطباعة التصويرية

  1. تم تصميم ألياف النانو البروتين ECM، nanofabrics والنانو لتكون ملفقة الأولى باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر (CAD) والبرمجيات. ثم يتم نقل هذا الملف إلى CAD الضوئية. سوف نوع الضوئية تعتمد على قرار من السمات؛ مع الضوئية القائمة على الشفافية الكافية لميزة الأحجام وصولا الى ~ 10 ميكرون. ميزات أصغر <10 ميكرون سيتطلب الكروم على الزجاج الضوئية. ملفقة كل من ألياف النانو والنانو المقدمة هنا باستخدام الضوئية القائمة على الشفافية، وبالتالي كانت نانومتر النطاق في السمك ولكن لا أبعاد الوحشي.
    ملاحظة: من المهم أن نميز الذي مناطق الضوئية سوف تكون مظلمة (منع الأشعة فوق البنفسجية بالمرور) والتي سوف تكون شفافة (تسمح للضوء بالمرور عبر الأشعة فوق البنفسجية) وهذا، جنبا إلى جنب مع نوع من مقاومة للضوء (إيجابية أو سلبية) ، سوف تملي تضاريس النهائي من القالب الرئيسي.
  2. لبدء تصنيع القالب الرئيسي، يذوى رقاقة 4 "السيليكون عن طريق وضعها على موقد تعيين إلى 150 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  3. توسيط رقاقة على ظرف الفراغ من تدور المغطي. صب SU8-2015 مقاومة للضوء سلبي على منتصف الرقاقة ويستمر صب في دوائر متحدة المركز حتى يتم تغطية حوالي ثلثي الرقاقة.
    ملاحظة: حافظ على زجاجة من SU8 بالقرب من رقاقة عندما تتدفق للحد من تشكيل فقاعات.
  4. برمجة spincoater على النحو التالي:
    • دورة انتشار: 500 دورة في الدقيقة مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 10 ثانية.
    • دورة تدور: 4،000 دورة في الدقيقة مع تسارع 100 دورة في الدقيقة / ثانية لمدة 30 ثانية.
    ملاحظة: ستكون هذه وصفة spincoating تشكل طبقة مقاومة للضوء وهذا هو ~ 10 ميكرون في سمك. عن طريق تغيير سرعة الغزل أو صياغة SU8، ويمكن تعديل سماكة.
  5. لينة خبز الرقاقة عن طريق وضعها على موقد تعيين إلى 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  6. فضح الرقاقة للأشعة فوق البنفسجية من خلالوالضوئية لجرعة مجموعه 140 ميغا جول / سم 2.
    ملاحظة: SU8 هو مقاومة للضوء سلبي بالتالي سوف المناطق حيث الأشعة فوق البنفسجية قادرة على تمرير من خلال الضوئية تبقى بعد النامية وتصبح الميزات التي أثيرت على القالب الرئيسي.
  7. بعد التعرض خبز الرقاقة عن طريق وضعها على موقد تعيين إلى 95 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
  8. تطوير رقاقة عن طريق وضعها في مطور SU8 لمدة 3 دقائق. بعد 3 دقائق، وشطف الرقاقة مع ايزوبروبيل. إذا تم إنتاج فيلم أبيض أثناء الشطف، لا يتم وضع رقاقة تماما وينبغي أن توضع في إعادته المطور لمدة 30 ثانية أخرى. شطف مرة أخرى مع ايزوبروبيل. كرر هذه العملية حتى لا يشكل فيلم أبيض أثناء الشطف ايزوبروبيل.
  9. تجفيف رقاقة في تيار من النيتروجين ومكان في طبق بتري 150 ملم للحماية من الغبار.

2. جعل PDMS طوابع

  1. إعداد prepolymer PDMS من خلال الجمع بين قاعدة المطاط الصناعي وكيل علاج في10:01 نسبة ث / ث. وعادة ما تستخدم 80 غرام من قاعدة و 8 غرام من وكيل علاج لضمان عدم وPDMS كافية لتغطية القالب الرئيسي في طبقة سميكة 1 سم.
  2. خلط وديغا في PDMS باستخدام خلاط الجاذبية لتعيين التالية:
    • مزيج: 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة
    • ديغا: 2،000 دورة في الدقيقة لمدة 2 دقيقة.
  3. إذا خالط غير متوفر خلط PDMS باليد لمدة 10 دقيقة باستخدام 10 مل ماصة المصلية. ديغا الخليط عن طريق وضعها في مجفف فراغ لمدة 30 دقيقة لإزالة الفقاعات.
  4. صب يكفي PDMS prepolymer على القالب الرئيسي (منقوشة رقاقة السيليكون) لتشكيل طبقة سميكة 1 سم. علاج PDMS قبل الخبز عند 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو في درجة حرارة الغرفة لمدة 48 ساعة.
  5. مرة واحدة شفي، والمناطق التي تحتوي على أنماط يمكن قطع لتشكيل الطوابع PDMS. للتمييز بين الجانب الميزة من مساعدات من الطوابع PDMS، وقطع من الدرجة الأولى من واحدة من زوايا على مساعدات من الطوابع.

3. Microcontact العلاقات العامةinting من أنماط ECM

  1. نظيفة coverslips 25 مم الزجاج بواسطة صوتنة في الايثانول 95٪ لمدة 1 ساعة ثم الجافة في الفرن 65 درجة مئوية.
  2. إعداد الحل PIPAAm عن طريق إذابة PIPAAm في 1-بيوتانول بتركيز 10٪ (ث / ت، عادة 1 غ في 10 مل).
  3. توسيط ساترة الزجاج على فراغ تشوك من spincoater وماصة 200 ميكرولتر من الحل PIPAAm بحيث يتم تغطية سطح الزجاج بأكمله.
  4. Spincoat ساترة في 6،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة.
  5. تنظيف الطوابع PDMS بواسطة صوتنة في 50٪ من الإيثانول لمدة 30 دقيقة ثم الجافة تحت تيار من النيتروجين.
    ملاحظة: يجب أن يتم تنفيذ التجفيف والخطوات اللاحقة في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية للحفاظ على العقم للتطبيقات حيث سيتم استخدام النانو ECM مع الخلايا.
  6. معطف السطح المزخرف من كل PDMS ختم مع 200 ميكرولتر من محلول البروتين، وعادة 50 ميكروغرام / مل في الماء المقطر المعقم لFN. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    ملاحظة: اليتم طلاء حجم هو لPDMS ختم 1.5 سم 2، وسوف تحتاج إلى تعديل وفقا لحجم من الطوابع PDMS، البروتين ECM المستخدمة وتركيز البروتين ECM في الحل.
  7. غسل الطوابع PDMS في الماء المقطر لإزالة الزائدة من البروتين وجافة تماما تحت تيار من النيتروجين.
    ملاحظة: أي ترك الماء على الطابع تؤدي إلى حل مبكر للطلاء PIPAAm على ساترة ومنع نقل البروتين المناسبة.
  8. لتصنيع معقمة، ضع لل coverslips PIPAAm المغلفة داخل طبق بتري المغلقة وتعقيم باستخدام التعرض للأشعة فوق البنفسجية، 45 دقيقة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة الأحيائية كافية. إذا كان غير مطلوب العقم هذه الخطوة يمكن حذفها.
  9. أداء microcontact الطباعة عن طريق وضع الجانب سمة من سمات الطابع PDMS في اتصال مع ساترة PIPAAm المغلفة. إذا لزم الأمر، واستخدام ملقط لبخفة على الجزء الخلفي من الطوابع لإزالة أي فقاعات الهواء وضمان اتصال موحدة.
  10. بعد 5 ميلن، تقشر الطابع PDMS من ساترة.
  11. في هذه المرحلة، والبروتينات ECM إضافية يمكن منقوشة لخلق هياكل أكثر تعقيدا ومتعدد المكونات. وقد تم التحقق من ما يصل إلى 3 المطبوعات للعمل مع هذه العملية، وأكثر من ذلك قد يكون ممكنا.

4. الإفراج عن ECM ألياف النانو والنانو

  1. وضع PIPAAm ساترة المغلفة منقوشة في طبق بتري 35 مم وتفقد الدقة باستخدام نمط النقيض من المرحلة المجهري. اعتمادا على نمط، قد تكون كاميرا CCD اللازمة لحل ملامح النمط. ويمكن أيضا أن تستخدم مضان المجهري لتفقد نمط تقديم وصفت البروتينات ECM fluorescently.
  2. إضافة 3 مل من الماء المقطر 40 درجة مئوية إلى طبق بتري والسماح للمياه لتبريد تدريجيا.
  3. انحلال طبقة PIPAAm والافراج عن أنماط البروتين ECM يمكن رصدها باستخدام النقيض من المرحلة المجهري. إذا كان التطبيق لا تسمح باستخدام تك البصريةhniques، وإطلاق سراح يمكن رصدها عن طريق قياس درجة حرارة المحلول. عادة، يتم تبريد الماء إلى درجة حرارة الغرفة، أقل بكثير من LCST من PIPAAm (32 ° C)، لضمان وأفرج عن النانو البروتين ECM.
  4. بعد الإفراج عنهم، ألياف النانو، والنانو nanofabrics أخرى تطفو في الماء. لاستخدامها لمزيد من التطبيقات التي يحتاجونها لمعالجته. والنهج الدقيق تعتمد على الهدف التجريبية ويمكن أن تشمل الخطوات مثل شل حركة على سطح آخر، تتحرك مع نظام مياداة مجهرية أو التضمين في هيدروجيل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SIA قادر على ألياف النانو الهندسة ECM البروتين مع مراقبة دقيقة على أبعاد الألياف. لإثبات ذلك، ومنقوشة صفائف من ألياف النانو FN مع أبعاد مستو من 50 × 20 ميكرون على ساترة PIPAAm المغلفة (الشكل 2A). عند الإفراج عنهم، تعاقدت ألياف لأنهم كانوا تحت الضغط قبل المتأصلة عند منقوشة على سطح PIPAAm (الشكل 2B). وكشف تحليل للألياف النانو FN كانوا monodisperse ما قبل النشر بمتوسط ​​طول 50.19 ± 0.49 ميكرون وعرض 19.98 ± 0.17 ميكرون (الشكل 2C). على الرغم من التعاقد بشكل ملحوظ، بعد الإفراج عنهم ما زالت الألياف FN monodisperse بمتوسط ​​طول 14.15 ± 0.92 ميكرون وعرض 2.65 ± 0.32 ميكرون (الشكل 2D). قدمت القوة الذرية المجهري قرار منظور أعلى من الألياف التغييرات الأبعاد المرتبطة بعملية الإفراج SIA. والجدير بالذكر أن ألياف ما قبل النشر زيارتهاسمك موحد من ~ 5 نانومتر (الشكل 2E) في حين كان ألياف بعد الإفراج سمك غير متجانسة بناء على أمر من عدة مئات من نانومتر (الشكل 2F).

باستخدام عملية SIA فمن الممكن لمهندس مجموعة متنوعة من النانو ECM البروتين مع حجم الانضباطي، والشكل، والتكوين (الشكل 3). على سبيل المثال، ألياف النانو FN في البداية كانت منقوشة 20 ميكرون في العرض و 1 سم في الطول على ساترة PIPAAm المغلفة. على التبريد وPIPAAm حل أفرج عن تشكيل ألياف النانو المواضيع الطويلة (الشكل 3A). أبعد من ذلك، لأنه يتم تعريف نمط من تضاريس سطح ختم PDMS تستخدم لmicrocontact الطباعة، فمن الممكن لهندسة النانو معقدة البروتين ECM. كما إثبات صحة المفهوم، أنشأنا FN نجوم متعددة المسلحة التي احتفظت الشكل العام لها بعد الإفراج (الشكل 3B). ومن المثير للاهتمام، تعاقدت الأسلحة للنجم FN مثل ألياف النانو ولكنجسد النجم الحفاظ حجمها. في حين FN المهم، أردنا أيضا لإثبات أن SIA يعمل مع البروتينات ECM أخرى مثل LN والتي يمكن إدراجها البروتينات ECM متعددة في نفس الهيكل. على سبيل المثال، ونحن هندسيا لnanofabric 2-D تتألف من ألياف النانو متعامد ومترابطة من FN وLN في مجموعة شعرية مربع (الشكل 3C). قبل الإفراج-كانت ألياف النانو FN 20 ميكرون واسعة وكانت ألياف النانو LN 50 ميكرون واسع. بعد إطلاق كلا النوعين من ألياف النانو التعاقد ولكن تم الإبقاء على الترابط العام وساحة بنية شعرية. تثبت هذه النتائج أن SIA يمكن استخدامها لهندسة المواد ECM مع مجموعة متنوعة من التراكيب والهياكل.

وتظهر حالات فشل SIA من ألياف النانو ECM في الشكل 4. أحد الأسباب هو الافراج غير لائق من نمط غير مكتملة بسبب سوء نقل البروتين ECM إلى السطح PIPAAm خلال microcontact الطباعة (الشكل 4A). فإن وجود الثقوب، وحواف غير منتظمة، وغيرها من العيوب خلق ألياف النانو والنانو التي هي ناقصة وعرضة للكسر والتفتت عند الإفراج عنهم. حل سريع للPIPAAm يمكن أيضا أن يسبب ضعف الإخلاص نمط بعد الإفراج (الشكل 4B). وعلى سبيل المثال، وذلك باستخدام درجة حرارة الغرفة 20 درجة مئوية المياه DI أدناه بالفعل LCST من PIPAAm بدلا من 40 درجة مئوية الماء يسبب PIPAAm لتنتفخ بسرعة وتذوب. يمكن أن يسبب هذا مشكلتين؛ (ط) يمكن التوسع السريع تمزق بعض ألياف النانو ECM و (ب) التوسع السريع يمكن أن يسبب اضطراب في نمط الترتيب بعد الافراج عنهم.

الشكل 1
الشكل 1. تخطيطي لعملية SIA. (A) وspincoated A رقاقة السيليكون مع SU8 مقاومة للضوء سلبية وتتعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية من خلال الضوئية. يتم تطوير المناطق غير المكشوفة بعيدا ترك م نمط الطوبوغرافي أستر العفن. (B) يتم سكب PDMS prepolymer على القالب الرئيسي ومملح لمدة 4 ساعة عند 65 درجة مئوية. (C) وبعد المعالجة، وقطع ختم PDMS من (D) ثم حضنت ختم مع حل البروتين ECM حيث كثف البروتينات إلى الطابع في التشكل تكشفت جزئيا. (E) وتشطف وختم لإزالة الزائدة البروتين المجفف، ووضعها على اتصال مع امتثالي ساترة الزجاج PIPAAm المغلفة. (F) ثم يتم إزالة الطابع تاركا وراءه البروتين ECM منقوشة على ساترة PIPAAm المغلفة، وأملت نمط من تضاريس الطابع. (G) ثم يتم وضع ساترة في طبق بتري ومغطاة 40 ° C الماء ثم تبرد تحت LCST من PIPAAm (~ 32 ° C)، الذي يسبب انحلال PIPAAm والإفراج عن تجميع ألياف النانو ECM البروتين و / أو النانو من السطح.

tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
الشكل 2. SIA طريق لمهندس السكان من ألياف النانو monodisperse. (A) ومنقوشة صفيف من المستطيلات FN، و 50 ميكرومتر في الطول و 20 ميكرون في العرض على سطح PIPAAm. (B) إضافة 40 ° C DI المياه والتبريد اللاحقة تحت LCST من PIPAAm تسبب انحلال PIPAAm والافراج عن ألياف النانو FN. عند الإفراج عنهم، تعاقدت الألياف لأنها تحت الضغط قبل عندما منقوشة على سطح PIPAAm. (C) تحليل أبعاد nanofiber يكشف ما قبل الإفراج الألياف هي monodisperse مع طول وعرض 50.19 ± 0.49 ميكرومتر و19.98 ± 0.17 ميكرون، على التوالي. (D) وعند الإفراج ألياف النانو التعاقد لكنها ظلت monodisperse مع طول بعد الإفراج وعرض 14.15 ± 0.92 ميكرون و 2.65 ± 0.32 ميكرون، على التوالي. (E) فؤاد أظهرت أن ألياف النانو ما قبل النشركانت ~ 5 نانومتر سميكة. أظهرت (F) فؤاد من ألياف النانو بعد الإفراج أن سمك قد ارتفع إلى عدة مئات من نانومتر في حين انخفضت الطول والعرض. النطاق الحانات هي (A) 50 ميكرون و (ب) 10 ميكرون.

الرقم 3
تم منقوشة الرقم 3. طريق SIA لمهندس ECM البروتين وألياف النانو النانو مع حجم الانضباطي، والشكل، والتكوين. (A) ألياف النانو FN على ساترة PIPAAm المغلفة ك 1 سم في الطول و 20 ميكرون في العرض. أسفر إطلاق الحرارية في SIA طويلة، ألياف النانو FN سليمة مع انخفاض العرض من ~ 3 ميكرون (B) مثال لنجم FN متعددة المسلحة أكثر تعقيدا، ممثل النانو المتنوعة التي يمكن إنشاؤها باستخدام SIA. أسفر إطلاق الحرارية في الانكماش من الأسلحة ولكن ليس في المنطقة الوسطى من النجم، حيث انضم إلى السلاح معا. (C) وهو أيضاالممكن دمج البروتينات ECM متعددة في نفس الهيكل. على سبيل المثال، متعامد، مترابطة 20 ميكرومتر واسعة من خطوط الجبهة الوطنية (أحمر) و 50 ميكرومتر واسعة من خطوط LN (الخضراء) خطوط دمجها في 2D nanofabric كانت منقوشة ثم أطلق سراحه. حتى بعد الإفراج عنهم، الإبقاء على نمط الهندسة الأولية والتواصل. أشرطة النطاق هي 50 ميكرومتر.

الرقم 4
الشكل 4. أمثلة على المشاكل التي قد تمنع SIA السليم وإطلاق البروتين من سطح PIPAAm. (A) ضعيف microcontact الطباعة من البروتينات ECM على نتائج PIPAAm في التجزئة وغيرها من العيوب من 20 ميكرون خط FN واسعة يمنع من SIA مستمر FN nanofiber وبدلا من ذلك يؤدي إلى تشكيل العديد من أجزاء أصغر FN. (B) بسرعة الافراج عن ألياف النانو FN من الركيزة PIPAAm قد تؤثر أيضا على ترتيب الألياف النهائي. في هذه الحالة المياهر 20 درجة مئوية، وأقل بالفعل من LCST PIPAAm، تم إضافة وتسبب انحلال السريع مما تسبب في ألياف النانو لرجع، وكسر (30 ثانية) وشكل عشوائي، تكوينات غير المنظم (52 ثانية). أشرطة النطاق هي 50 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

طريقة SIA المقدمة هنا يقلد الخلية بوساطة تجميع مصفوفة وتمكن هندسة ECM البروتين وألياف النانو النانو مع حجم الانضباطي والتنظيم والتكوين. في حين لم تكن متطابقة إلى ECM-لدت الخلية، SIA يخلق ECM تتكون من البروتين الألياف النانوية التي تخضع للطي 20 عكسها / تتكشف خلال سلالة الميكانيكية 21 ويمكن ربط الخلايا 20. وهذا يوفر قدرة فريدة لبناء مواد البروتين ECM أن ألخص العديد من الخصائص من ECM وجدت في الجسم الحي. على سبيل المثال، يمكن أن تكون ملفقة ألياف النانو ECM في أطوال محددة مع مستوى الرقابة غير مجدية مع غيرها من التقنيات. علينا أن نظهر القدرة على إنشاء صفائف من ألياف النانو monodisperse (الشكل 2) مع مراقبة دقيقة من طول وعرض ما قبل النشر (الشكل 2C) وبعد الافراج عن (الشكل 2D). ويمكن لهذه ألياف النانو ECM يكون أي طول، كما يتبين من افتعال FN نانوالألياف في 1 ~ أطوال سم (الشكل 3A). في المقابل، يمكن أن تقنيات تصنيع أخرى مثل electrospinning ومرحلة الانفصال خلق ألياف النانو ولكن ليس مع مراقبة دقيقة للطول، وإنتاج الألياف معظمها المستمر. هذه التقنيات هي أيضا محدودة في هندستها وتنظيم الألياف داخل السقالة. SIA يمكن استخدامها لبناء النانو ECM مع التعسفي الهندسة المستوية، مثل نجم (الشكل 3B)، وفي ورقة 2-D مع التحكم التعسفي للمنظمة الألياف، مثل nanofabric (الشكل 3C). علاوة على ذلك، طرق تصنيع أخرى عادة ما تستخدم المواد الاصطناعية أو سوى عدد محدود من تلك الطبيعية مثل الشيتوزان والليفين. في المقارنة، SIA تمكن التجمع من ألياف النانو والنانو مكونة تماما من البروتينات ECM مثل FN وLN، والتي لا يمكن أن تكون ملفقة مع هذه الأساليب الأخرى.

الخطوة الحاسمة في عملية SIA هو الإصدار أثار حراريا، من اله PIPAAm السطح. لضمان الإفراج السليم، وهناك عدد قليل من الخطوات الرئيسية التي ينبغي النظر فيها. الأولى، بعد الخطوة microcontact الطباعة، يجب فحص على الاخلاص من نمط ECM نقلها إما باستخدام المجهر مرحلة التباين أو المجهري مضان (إذا الموسومة البروتينات ECM fluorescently). إذا كان هناك أي عيوب في نمط البروتين على سطح PIPAAm، ثم الإفراج اللاحقة إنتاج النانو التي تحتوي على هذه العيوب (كما لوحظ في الشكل 4A). إذا ختم PDMS تنتج مرارا أنماط البروتين مع العيوب، فمن المحتمل أن الجانب micropatterned من الطوابع PDMS تم خدش أو يحتوي على العيوب وطابع جديد وربما قالب رئيسية جديدة ينبغي بذل. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي توخي الحذر عند ترطيب البروتين منقوشة، ساترة PIPAAm المغلفة. يجب أن يكون الماء في أو بالقرب من 40 درجة مئوية، والسماح لتبرد ببطء. إذا كان الماء ليس دافئا بما يكفي أو يبرد بسرعة أيضا، سوف تنتفخ وPIPAAmالثانية تذوب بسرعة كبيرة جدا مما تسبب في ألياف النانو البروتين ECM والنانو أن يحتمل ممزقة من القوات وإطلاق سراح هؤلاء اعتباطا أن أي التنظيم الهيكلي تشبه الجافة، الدولة أصدرت قبل ستفقد (الشكل 4B).

ألياف النانو البروتين ECM، النانو وnanofabrics تجميعها باستخدام SIA دينا العديد من التطبيقات في الميكانيكا الحيوية، هندسة الأنسجة، والتكنولوجيا الحيوية. على سبيل المثال، أدلة حديثة تشير إلى أن الخواص الميكانيكية للECM الألياف البروتين يحكم الوظائف البيولوجية 23. هي مناسبة بشكل مثالي لخلق SIA ECM ألياف النانو البروتين في شكل منقى للتحليل الميكانيكية. لإجراء هذه التجارب، أصدرت ألياف النانو البروتين ECM يمكن التلاعب بها باستخدام micropositioners الدقة ثم امتدت. Deravi وآخرون قد استخدمت مؤخرا هذا النهج لإثبات أن ألياف النانو FN يمكن أن تحمل ما يصل إلى ملحقات 8 أضعاف، وأنها تخضع لدنة، والبلاستيك، والحادي والعشرينالأنظمة مع تزايد الضغط 21-تشنج المطر. في هندسة الأنسجة والبروتين ECM السقالات مقرها في شكل المواد الهلامية تستخدم (على سبيل المثال، نوع الكولاجين الأول والفيبرين) أو الأنسجة decellularized 4 على نطاق واسع. بالمقارنة مع هذه التقنيات، والاستفادة من SIA هو القدرة على هندسة العمارة مع السقالات واضحة المعالم في الألياف 1-D ورقة 2-D (الشكل 3C). على سبيل المثال، لقد أظهرنا سابقا أن العضلية يمكن المصنف على ألياف النانو FN لتشكيل فروع وظيفية من عضلة القلب 20. هذا يدل على أن ألياف النانو FN هي الخلية ملزمة وأنها يمكن أن توجه الجمعية متباين الخواص من الخلايا في الأنسجة هياكل الانحياز. يمكن للnanofabrics 2-D تحاكي بنية تكوين والصفحي من الغشاء القاعدي للتطبيق في هندسة الأنسجة الظهارية والبطانية. علاوة على ذلك، نحن نعمل على تطوير طرق جديدة لنشر هذه ألياف النانو ECM وnanofabrics في 3-D عن طريق دمجها ضمن مصفوفات هيدروجيل.من العملية الموضحة في هذه المقالة، فمن الممكن استخدام SIA لمهندس ECM القائم على البروتين، والمواد ذات البنية النانومترية لمجموعة واسعة من التطبيقات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وقدمت الدعم المالي لدائرة الخدمات الطبية المشتركة من المعاهد الوطنية للصحة الميكانيكا الحيوية في الطب التجديدي برنامج التدريب T32 (2T32EB003392)، إلى QJ من زمالة دود-ICES وAWF من جائزة مبتكر جديد للمدير المعاهد الوطنية للصحة (1DP2HL117750).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm Polysciences 21458-10 40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) Dow Corning Mix 10 parts base with 1 part curing agent. 
Butanol
Fibronectin BD biosciences 354008 Human, 1mg
Laminin BD biosciences 354239 Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist Microchem SU8-2015
SU8 Developer Microchem
Sonicator Branson M3510 Branson Ultrasonic Corporation CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer Thinky Corporation
Spincoater Specialty Coating Systems G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5 Fisher Scientific 12-545-86

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
  2. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  3. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  5. Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
  6. Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
  7. Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
  8. Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
  9. Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
  10. Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
  11. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
  12. Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
  13. Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
  14. Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
  15. Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
  16. Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
  17. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
  18. Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
  19. Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
  20. Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
  21. Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
  22. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
  23. Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 86، ألياف النانو، Nanofabrics، خارج الخلية مصفوفة البروتينات، Microcontact الطباعة، فيبرونكتين]، Laminin، هندسة الأنسجة، وبولي (N-isopropylacrylamide)، الجمعية بمبادرة السطحية
ألياف النانو البروتين ECM والنانو المهندسة طريق الجمعية بمبادرة السطحية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szymanski, J. M., Jallerat, Q.,… More

Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly. J. Vis. Exp. (86), e51176, doi:10.3791/51176 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter