Summary
Метод получения нановолокон и сложных наноструктур из одной или нескольких белков внеклеточного матрикса описана. Этот метод использует белок-поверхностные взаимодействия для создания на основе белков материалы свободно стоящая с перестраиваемой состава и архитектуры для использования в различных тканевой инженерии и биотехнологии приложений.
Abstract
Внеклеточного матрикса (ECM) в тканях синтезируется и собран клеток, чтобы сформировать 3D фибриллярных, сеть белка с жестко регулируется диаметра волокна, состава и организации. В дополнение к обеспечению структурной поддержки, физические и химические свойства ECM играют важную роль в нескольких клеточных процессов, включая адгезию, дифференцировки и апоптоза. В естественных условиях, ЕСМ собраны, подвергая загадочное самосборки (фибриллогенеза) сайтов в белках . Этот процесс варьируется для различных белков, но фибронектин (FN) фибриллогенез хорошо охарактеризованы и служит в качестве модельной системы для клеточного сборки ECM. В частности, клетки используют рецепторов интегрина на клеточной мембране, чтобы связать FN димеры и актомиозин генерируемые сократительные силы разворачиваться и подвергать сайты связывания для сборки в нерастворимые волокна. Этот процесс рецептор-опосредованного позволяет клетки собрать и организовать ECM от сотовой, чтобы ткани SCAле. Здесь мы представляем метод называется поверхность инициативе в сборе (SIA),, которая рассматривает сборку матрицу клеточный помощью белка-поверхностные взаимодействия разворачиваться ECM белков и собрать их в нерастворимые волокна. Во-первых, ECM белки адсорбируются на гидрофобной полидиметилсилоксана (PDMS) поверхности, где они частичной денатурации (раскройте) и выставить загадочные связывающие домены. В развернутые белки, которые затем передаются в четко определенных микро-и nanopatterns через микроконтактной печати на термочувствительной поли (N-изопропилакриламида) (PIPAAm) поверхности. Термически срабатывает роспуск PIPAAm приводит к окончательной сборки и выпуска нерастворимых ECM белка нановолокон и наноструктур с четко определенными геометрий. Сложные архитектуры возможны инженерными определяется узоры на марках PDMS, используемых для микроконтактной печати. В дополнение к FN, процесс SIA может быть использован с ламинин, фибриногена и коллагены типа I и IV, чтобы создать многокомпонентный ECM наноструктурвания. Таким образом, SIA может использоваться для проектирования на основе белков ЕСМ материалов с точным контролем над белковой композиции, геометрии волокна и лесов архитектуры для того, чтобы повторять структуру и состав внеклеточного матрикса в естественных условиях.
Introduction
Внеклеточного матрикса (ECM) в тканях состоит из многофункциональных белков, участвующих в физической и химической регуляции нескольких процессов адгезии клеток, включая, пролиферации, дифференцировки и апоптоза 1-3. ЕСМ синтезируется, собран и организован клеток и составляющие белковые фибриллы имеют уникальные композиции, размер волокна, геометрии и взаимосвязанные архитектуры, которые меняются в зависимости от типа ткани и стадии развития. Последние работы показал, что ECM может обеспечить поучительные сигналы для руководства клеток образовывать инженерии тканей 4, предполагая, что Резюмируя ECM с точки зрения состава и структуры может способствовать развитию биомиметических материалов для тканевой инженерии и биотехнологии приложений.
Ряд способов изготовления были разработаны для проектирования полимерных каркасов, которые могут имитировать аспекты ЕСМ в тканях. Например, электропрядения и фаза СовместноеAtion оба продемонстрировали способность к образованию пористых матриц волокон с диаметром от десятков микрометров до десятков нанометров 5-7. Оба метода показали также, что очень пористые матрицы нановолокон может поддерживать клеточную адгезию и проникновение в эшафот 8. Однако эти подходы ограничены в возможных волокна геометрий, ориентаций и 3D архитектур, которые могут быть созданы. Электропрядения обычно производит строительные леса либо случайно ориентированных или сильно выровненных волокон, тогда как разделение фаз производит строительные леса со случайно ориентированными волокнами. Существуют также ограничения на материалах с использованием исследователи обычно синтетические полимеры, такие как поли (ε-капролактон) 8 и поли (молочной-со-гликолевой кислоты) 9, который впоследствии покрывают белков ЕСМ в целях содействия адгезии клеток. Природные биополимеры, также используются, в том числе коллагена типа I 10, желатин 11, фибриноген 12,хитозан 13, и шелк 14, но они представляют лишь небольшую часть белков, обнаруженных в нативной ткани. Большинство тканей содержат большее среду белков ЕСМ и полисахаридов, включая фибронектин (FN), ламинин (LN), коллагена типа IV и гиалуроновой кислоты, которые трудно или невозможно изготовить нановолокон с использованием существующих методов.
Для решения этой проблемы, мы сосредоточили наши усилия исследования на имитируя путь клетки синтезировать, собрать и организовать ECM белка фибрилл в их окружении. В то время как специфический процесс фибриллогенез варьируется для различных белков ECM, как правило, изменение конформации в молекуле ECM белка запускается с помощью ферментативных или рецептор-опосредованного взаимодействия, который предоставляет загадочные места самосборки. Здесь мы используем FN в качестве модельной системы, чтобы лучше понять процесс фибриллогенеза. Вкратце, FN гомодимеры связываются с интегрином рецепторы на поверхности клетки с помощью последовательности RGD аминокислоты в 10-м типа IIПовторяю блок. После связывания интегрины раздвигаются с помощью сокращения актомиозинового и разворачиваться димеры FN выставить загадочные места самосборки. Разоблачение этих сайтов связывания FN-НС позволяет димеры FN собрать в нерастворимый фибриллы прямо на поверхности клетки 15. Работа в бесклеточных системах показал, что криптические сайты связывания FN-FN могут быть выявлены через развертывание с использованием денатурирующих 16 или поверхностное натяжение на воздух-жидкость-твердое тело 17-19. Однако волокна FN, созданные этими методами ограничены конкретных размеров и геометрии волокна и, как правило, связаны с поверхностью.
Здесь мы опишем подход называется, поверхность инициативе в сборе (SIA) 20, который преодолевает эти ограничения, используя белок-поверхностные взаимодействия для создания свободно стоящая нерастворимые нановолокон, nanofabrics (2D листов) и других наноструктур, состоящих из одного или нескольких белков ECM (рис. 1 ). В этом рrocess, ECM белки адсорбируются от компактного, шаровидной конформации в растворе и частично денатурированный (в сборе) на узорной, гидрофобный полидиметилсилоксана (PDMS) марки. Контроллер ЭСУД белки, которые затем передаются в этом состоянии на термочувствительного поли (N-изопропилакриламида) (PIPAAm) поверхности через микроконтактной печати 22. Когда гидратируют 40 ° С воды PIPAAm остается твердым, но при охлаждении до 32 ° С он проходит через ниже критической температуры раствора (НКТР), где она становится гидрофильной, набухает водой, а затем растворяется, высвобождая собранные ECM наноструктур офф поверхность. Метод SIA обеспечивает контроль над размерами с нанометрового масштаба точностью. Контролируя ключевые параметры, такие как композиции, геометрии волокна, и архитектуры, можно резюмировать многие свойства ЕСМ, найденные в естественных условиях и для разработки современных лесов для тканевой инженерии и биотехнологии приложений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Изготовление мастер Mold Использование фотолитографии
- В ECM белка нановолокна, nanofabrics и наноструктуры быть сфабрикованы сначала разработан с использованием системы автоматизированного проектирования (САПР). Этот CAD файл затем переносили в фотошаблона. Тип фотошаблонов будет зависеть от разрешения особенностей; с прозрачностью на основе фотошаблонов достаточно для функции размеры до ~ 10 мкм. Меньшие особенности <10 мкм потребует хром на стеклянной фотошаблонов. Все нановолокон и наноструктур, представленные здесь, были изготовлены с использованием прозрачности основе фотошаблона, и, таким образом были нанометровые толщиной, но не поперечные размеры.
Примечание: Важно, чтобы отличить, какие области фотошаблона будет темно (предотвратить ультрафиолетовый свет, чтобы пройти через) и который будет прозрачным (позволяют УФ свету проходить через), поскольку это, вместе с типом фоторезиста (положительное или отрицательное) , будет диктовать конечный топографию мастер формы. - Для начала изготовление мастер-форму, обезвоживают 4 "кремниевую пластину, поместив его на плите, установленной до 150 ° С в течение 15 мин.
- Сосредоточьте пластины на вакуумном патроне спин-машины для нанесения покрытий. Налейте SU8-2015 негативного фоторезиста на середину пластины и продолжить заливки концентрическими кругами, пока около двух третей пластины не покрыта.
Примечание: Держите бутылку SU8 близко к пластине при заливке, чтобы минимизировать образование пузырьков. - Запрограммировать spincoater следующим образом:
- Распространение цикл: 500 мин с ускорением 100 об / сек в течение 10 сек.
- Отжим: 4000 оборотов в минуту с ускорением 100 об / сек в течение 30 сек.
- Мягкий испечь вафли, поместив его на плите, установленной до 95 ° С в течение 3 мин.
- Expose пластину с ультрафиолетовым светом черезфотошаблон для общей дозы 140 мДж / см 2.
Примечание: SU8 является негативный фоторезист поэтому регионы, где УФ-излучение может проходить через фотошаблон останется после разработки и стать поднятые особенности на мастер-формы. - Начать экспозицию испечь пластины, поместив его на плите, установленной до 95 ° С в течение 4 мин.
- Разработка пластины, поместив его в SU8 разработчика в течение 3 мин. Через 3 минуты, промойте пластину с изопропилового спирта. Если белая пленка образуется в процессе промывки, пластина не полностью разработана и он должен быть помещен обратно в разработчика для еще 30 сек. Промыть снова изопропилового спирта. Повторите этот процесс, пока белая пленка не образует в изопропиловый спирт промывки.
- Сушат пластины в потоке азота и место в 150 мм чашки Петри для защиты от пыли.
2. Выполнение PDMS Марки
- Подготовьте форполимера PDMS путем объединения эластомера основы и отвердителя в10:01 / мас отношение. Обычно 80 г основания и 8 г отвердителя используются чтобы у пассажиров было достаточно PDMS, чтобы покрыть мастер плесень в толщиной 1 см слоя.
- Смешайте и дегазации PDMS с помощью центростремительное мешалки на следующее:
- Смешайте: 2000 оборотов в минуту в течение 2 мин
- Дега: 2000 оборотов в минуту в течение 2 мин.
- Если смеситель недоступен смешивать PDMS вручную в течение 10 мин с использованием 10 мл серологической пипеткой. Дегазируют смеси, поместив его в вакуумном эксикаторе в течение 30 мин для удаления пузырьков.
- Налейте достаточно PDMS форполимера через мастер-форму (с рисунком кремниевой пластины) с образованием густой 1 см слой. Вылечить PDMS путем обжига при 65 ° С в течение 4 часов или при комнатной температуре в течение 48 часов.
- После отверждения, Регионы, содержащие образцы можно вырезать, чтобы сформировать марки PDMS. Чтобы отличить особенность сторону от задней стороны штампа PDMS, вырезать на ступеньку из одного из углов на задней стороне марки.
3. Микроконтакта Printing из ECM Patterns
- Чистые 25 мм покровные стекла диаметр ультразвуком в 95% этаноле в течение 1 часа и затем сушат в печи 65 ° C.
- Приготовьте раствор путем растворения PIPAAm PIPAAm в 1-бутаноле при концентрации 10% (вес / объем, как правило, 1 г в 10 мл).
- Центрирование покровным стеклом на вакуумном патрона из spincoater и пипетки 200 мкл раствора PIPAAm так, чтобы вся поверхность покрыта стеклом.
- Spincoat покровное на 6000 оборотах в минуту в течение 1 мин.
- Очистка марки PDMS путем обработки ультразвуком в 50% этаноле в течение 30 мин и затем сушат в токе азота.
Примечание: Сушка и последующие шаги должны быть выполнены в шкафу биологической безопасности для сохранения стерильности для приложений, где ECM наноструктуры будут использованы с клетками. - Coat рисунком поверхность каждого PDMS печать с 200 мкл раствора белка, как правило, 50 мкг / мл в стерильной дистиллированной воде в течение FN. Инкубировать в течение 1 часа при комнатной температуре.
Примечание: Чтэто покрытие объем, для PDMS штампа 1,5 см 2 и должны быть отрегулированы в зависимости от размера PDMS штамп, ЕСМ белком, используемым и концентрации ECM белка в растворе. - Промыть марки PDMS в дистиллированной воде, чтобы удалить избыток протеина и высохнуть в потоке азота.
Примечание: Любая вода, оставленная на марке вызовет преждевременное растворение покрытия PIPAAm на покровное и нарушить их нормальную передачу белка. - Для стерильной изготовления, разместить покровные на PIPAAm покрытием внутри закрытой чашке Петри и стерилизовать с помощью УФ экспозиции, 45 мин под УФ-светом в области биобезопасности кабинета достаточно. Если стерильность не требуется этот шаг может быть пропущен.
- Выполнение микроконтактной печати, поместив функцию сторону штампа PDMS в контакте с покровным PIPAAm покрытием. При необходимости используйте щипцы нажмите слегка на задней марок для удаления пузырьков воздуха и обеспечить равномерный контакт.
- Через 5 мильп, шелушиться PDMS штамп из покровного стекла.
- На данном этапе, дополнительные белки ECM может быть с рисунком, чтобы создавать более сложные и многокомпонентных конструкций. До 3 печатные издания были проверены на работу с этим процессом, и более может быть осуществимо.
4. Выпуск ECM нановолокон и наноструктур
- Поместите узорной покровное PIPAAm покрытием в 35 мм чашки Петри и осмотрите образец верности использованием фазового контраста микроскопии. В зависимости от модели, ПЗС-камера может быть необходимо решить особенности узора. Флуоресцентная микроскопия также может быть использован для проверки образец при условии, что ECM белки флуоресцентной метки.
- Добавьте 3 мл 40 ° C дистиллированной водой до чашки Петри и дать воде постепенно прохладно.
- Роспуск слоя PIPAAm и выпуск моделей ECM белка можно контролировать с помощью фазового контрастной микроскопии. Если приложение не позволяет использование оптического текhniques, релиз можно контролировать путем измерения температуры раствора. Как правило, вода охлаждается до комнатной температуры, что значительно ниже НКТР PIPAAm (32 ° C), чтобы гарантировать, что ECM белка наноструктуры были освобождены.
- После освобождения, нановолокна, nanofabrics и другие наноструктуры, плавающие в воде. Чтобы использовать их в дальнейшем, они должны манипулировать. Точное подход будет зависеть от цели экспериментальной и может включать в себя такие шаги, как иммобилизации на другую поверхность, двигаясь с системой микроманипулятора или встраивания в гидрогеле.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SIA способен инженерно ECM белка нановолокон с точным контролем над размерами волокна. Чтобы продемонстрировать это, массивы FN нановолокон с плоскими размерами 50 х 20 мкм были рисунком на покровное PIPAAm покрытием (рис. 2А). После освобождения, волокна контракт, потому что они находились под неотъемлемого предварительного напряжения при рисунком на поверхности PIPAAm (рис. 2В). Анализ показал, нановолокон FN они были монодисперсных предварительного выпуска со средней длиной 50,19 ± 0,49 мкм и шириной 19,98 ± 0,17 мкм (рис. 2в). Несмотря заражения заметно, FN волокна после освобождения были еще монодисперсными со средней длиной 14,15 ± 0,92 мкм и шириной 2,65 ± 0,32 мкм (рис. 2D). Атомно-силовая микроскопия при условии более высокого разрешения перспективу волоконно изменения размеров, связанных с процессом выпуска SIA. Примечательно, что волокна пре-релиз былравномерная толщина ~ 5 нм (рис. 2Е), тогда как волокна после освобождения было гетерогенную толщину порядка нескольких сотен нанометров (рис. 2F).
При использовании способа SIA можно спроектировать различные ECM белок наноструктур с перестраиваемой размера, формы и состава (рис. 3). Например, FN нановолокна первоначально 20 мкм в ширину и 1 см в длину были рисунком на покровное в PIPAAm покрытием. При охлаждении и PIPAAm растворения нановолокна были освобождены формирования длинных темы (рис. 3А). Кроме того, поскольку структура определяется топографии поверхности штампа PDMS, используемого для микроконтактной печати, можно проектировать сложные ECM белок наноструктур. В качестве доказательства правильности концепции, мы создали несколько вооруженных FN звезды, которые сохранили свои общую форму после освобождения (рис. 3В). Интересно, что герб звезды FN контракт как нановолокон, ноТело звезды поддерживается его размер. В то время как FN важно, мы также хотели продемонстрировать, что SIA работает с другими ECM белков, таких как LN и что многочисленные белки ECM могут быть включены в ту же структуру. Например, мы спроектировали 2-D nanofabric состоящую из ортогональных и взаимосвязанных нановолокон из FN и LN в квадратной решетки решетки (рис. 3C). Pre-Release нановолокна FN были широко 20 мкм и нановолокна LN были широко 50 мкм. После освобождения оба типа нановолокон контракт, но в целом взаимосвязь и квадратные решетчатая структура сохранялась. Эти результаты показывают, что SIA может использоваться для проектирования ECM материалов с различными состава и структуры.
Экземпляры неудачной SIA из ECM нановолокон показаны на рисунке 4. Одной из причин является неправильное освобождение неполный набор из-за плохой передачи ECM белка к поверхности PIPAAm во микроконтактной печати (рис. 4А). Наличие отверстий, неровными краями и другими дефектами создаст нановолокон и наноструктур, которые являются неполными и склонны к поломке и фрагментации после освобождения. Быстрое растворение PIPAAm также может привести к ухудшению картина верности после освобождения (рис. 4В). Например, при использовании комнатной температуре 20 ° C ДИ воды уже ниже НКТР PIPAAm вместо 40 ° C воды приведет к тому, PIPAAm быстро набухают и растворяются. Это может вызвать две проблемы; (Я) быстрое расширение может разорвать некоторые ECM нановолокон и (II) быстрое расширение может вызвать нарушение договоренности шаблон после освобождения.
Рисунок 1. Схема процесса SIA. (A) кремниевую пластину с spincoated SU8 негативного фоторезиста и облучают УФ-светом через фотошаблон. Номера для открытых областях разработаны далеко оставляя топографически образцу м астра плесень. (В) PDMS предполимер поливают мастер формы и вылечить в течение 4 часов при 65 ° С (С) После отверждения PDMS штамп вырезается. (D) Штамп затем инкубировали с раствором ECM белка где белки адсорбируют к штампу в частично развернутой конформации. (E) марка промывают, чтобы удалить избыток белка, сушат и помещают в конформной контакте с PIPAAm покрытием покровным стеклом. (F) Штамп затем удаляют, оставляя за рисунком ECM белок на покровное PIPAAm покрытием, шаблон диктуется топографии штампа. (G) покровное затем помещают в чашку Петри и покрыты 40 ° С воды, а затем охлаждают ниже НКТР PIPAAm (~ 32 ° С), который вызывает растворение PIPAAm и освобождение собранных белковых нановолокон ECM и / или наноструктур от поверхности.
tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
Рисунок 2. Использование SIA инженер популяции монодисперсных нановолокон. (A) Массив FN прямоугольников, 50 мкм в длину и 20 мкм в ширину были рисунком на поверхность PIPAAm. (B) Добавление 40 ° C дистиллированной воды и последующего охлаждения ниже НКТР PIPAAm срабатывает растворение PIPAAm и освобождение нановолокон FN. После освобождения, волокна контракт, поскольку они находятся под предварительного напряжения при рисунком на поверхности PIPAAm. (С) Анализ размеров нановолокон Pre-Release показывает волокна являются монодисперсными с длиной и шириной 50,19 ± 0,49 мкм и 19,98 ± 0,17 мкм соответственно. (D) После освобождения нановолокна контракту но оставались монодисперсных с длиной после освобождения и шириной 14,15 ± 0,92 мкм и 2,65 ± 0,32 мкм соответственно. (E) АСМ показали, что нановолокна предварительные версиибыли толщиной ~ 5 нм. (F) АСМ после освобождения нановолокон показали, что толщина увеличилась до нескольких сотен нанометров, а длина и ширина уменьшается. -Scale Столбики (A) 50 мкм и (B) 10 мкм.
Рисунок 3. Использование SIA инженер ECM белок нановолокон и наноструктур с перестраиваемой размера, формы и композиции. (FN) нановолокна были рисунком на покровное в PIPAAm покрытием до 1 см в длину и 20 мкм в ширину. Тепловой расцепитель привело к SIA длинных неповрежденных FN нановолокон с пониженным шириной ~ 3 мкм. (В) Пример более сложной нескольких вооруженных звезды FN, представителя различных наноструктур, которые могут быть созданы с помощью SIA. Тепловой расцепитель привело к сжатию руки, но не центральная область звезды, где руки соединены вместе. (С) Это такжеможно интегрировать различные белки ECM в той же структуре. Например, ортогональной, взаимосвязанные 20 мкм в ширину линии FN (красный) и 50 мкм в ширину линии LN (зеленый) линии, интегрированные в 2D nanofabric были рисунком, а затем отпустили. Даже после освобождения, картина сохранила свою первоначальную геометрию и взаимосвязанность. Масштабные бары 50 мкм.
Рисунок 4. Примеры проблем, которые могут помешать правильной SIA и высвобождение белка с поверхности PIPAAm. (А) Плохо микроконтактная печать ECM белков на результатах PIPAAm к фрагментации и других дефектов мкм широкой линии 20 FN предотвращает SIA непрерывного FN нановолокна и вместо приводит к образованию множество мелких фрагментов FN. (B) быстрым снижением нановолокон FN от PIPAAm подложки может также повлиять на окончательное расположение волокон. В этом случае воды в, уже ниже НКТР PIPAAm добавляли т 20 ° C и вызвало быстрое растворение в результате чего нановолокна огрызнуться, перерыв (30 сек) и образуют случайную, неорганизованные настройки (52 сек). Масштабные бары 50 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Метод SIA представленные здесь имитирует клеточный узел матрицы и позволяет инжиниринг ECM белка нановолокон и наноструктур с размером перестраиваемый, организации и состава. В то время как не идентичны клеток генерируемые ECM, SIA создает ECM состоит из наноразмерных белковых волокон 20, которые проходят обратимое сворачивание / разворачивание при механической деформации 21 и может связывают клетки 20. Это дает уникальную возможность для создания ECM белковых материалов, что повторять многие свойства ЕСМ, найденные в естественных условиях. Например, ECM нановолокна могут быть изготовлены в определенной длины с уровнем управления недопустимой с другими методами. Мы демонстрируем способность создавать массивы монодисперсных нановолокон (рис. 2) с точным контролем длины и ширины пре-релиза (рис. 2С) и после выхода на (рис. 2D). Эти ECM нановолокна могут быть любой длины, о чем свидетельствует изготовления FN наноВолокна в ~ 1 длины см (рис. 3А). В противоположность этому, другие методы изготовления, такие как электроформования и разделение фаз может создать нановолокон, но не с точным контролем длины, производя в основном непрерывные волокна. Эти методы также ограничены в волоконно геометрии и организации в леске. SIA может быть использован для построения ECM наноструктур с произвольной плоской геометрии, например, звездочку (фиг.3В), а в 2-D листов с произвольным контролем организации волокон, таких как nanofabric (фиг.3С). Кроме того, другие методы изготовления обычно используют синтетические материалы или только ограниченное количество естественных таких как хитозана и фибрина. Для сравнения, SIA позволяет установку нановолокон и наноструктур, состоящих полностью из ECM белков, таких как FN и LN, которые не могут быть изготовлены с этими другими способами.
Важным шагом в процессе SIA является термически срабатывает освобождение от гоэ PIPAAm поверхность. Для обеспечения надлежащего релиз, есть несколько ключевых шагов, которые следует учитывать. Во-первых, после стадии микроконтактная печати, точность передаваемого рисунком ЕСМ должны быть проверены либо с помощью фазово-контрастного микроскопа или флуоресцентной микроскопии (если ECM белки флуоресцентно меченый). Если есть какие-либо дефекты в структуре белка на поверхности PIPAAm, то последующее освобождение будет производить наноструктуры, которые содержат эти дефекты (как это наблюдается на рисунке 4A). Если PDMS штамп неоднократно производит модели белка с дефектами, вполне вероятно, что micropatterned сторона штампа PDMS был поцарапан или содержит дефекты и новый штамп и потенциально новый мастер формы должны быть сделаны. Кроме того, следует позаботиться при гидратации белка с рисунком, покровное PIPAAm покрытием. Вода должна быть на или вблизи 40 ° С и дать остыть медленно. Если вода не достаточно тепло или охлаждает слишком быстро, PIPAAm увеличитсяй распустить слишком быстро вызывая ECM белка нановолокна и наноструктуры, которые будут потенциально раздирают от сил и бессистемно выпущен такой, что любая структурная организация напоминающие сухой, предварительно открытое состояние, будут потеряны (рис. 4В).
ECM белка нановолокна, наноструктуры и nanofabrics собранные с помощью SIA имеют много приложений в биомеханике, тканевой инженерии и биотехнологии. Например, последние данные показывают, что механические свойства ECM белка фибрилл регулирует свою биологическую функциональность 23. SIA идеально подходит для создания ECM белка нановолокон в очищенной форме для механического анализа. Для выполнения этих экспериментов, выпущенные ECM белка нановолокна можно манипулировать с помощью точных micropositioners а затем потянулся. Deravi др. недавно использовали этот подход, чтобы продемонстрировать, что FN нановолокна выдерживает до 8-кратных расширений и что они испытывают упругое, пластик, и улдождь жесткости режимы с увеличением напряжения 21. В тканевой инженерии, ECM белок на основе каркасов в форме гелей (например, коллаген типа я и фибрина) или decellularized ткани 4 широко используются. По сравнению с этими методами, преимущество SIA является возможность спроектировать каркасов с хорошо определенной архитектуры в 1-D волокон и 2-D листов (фиг.3С). Например, ранее мы показали, что кардиомиоциты могут быть высевали на FN нановолокон с образованием функциональных нитей сердечной мышцы 20. Это показывает, что нановолокна FN являются обязательными клеток, и что они могут направлять анизотропную сборку клеток в выровненных структур тканей. В 2-D nanofabrics могут имитировать состава и слоистую структуру базальной мембраны для применения в технике эпителиальных и эндотелиальных тканях. Кроме того, мы разрабатываем новые способы развертывания этих ECM нановолокон и nanofabrics в 3-D, встраивая их в гидрогеля матриц.Из способа, описанного в этой статье, можно использовать SIA инженер ECM основе белков, наноструктурных материалов для широкого круга применений.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Финансовая поддержка была оказана в JMS от NIH биомеханики в регенеративной медицине программы T32 подготовки (2T32EB003392), чтобы QJ от Дауд-ICES стипендий и АСФ из Нью-премии Новатор Директора NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P.
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K.
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
