Summary
שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.
Abstract
המטריצה תאית (ECM) ברקמות היא מסונתזת ונאספה על ידי תאים ליצירת סיבי 3D, רשת חלבון עם מוסדר היטב בקוטר סיבים, קומפוזיציה וארגון. בנוסף למתן תמיכה מבנית, התכונות הפיסיקליות וכימיות של ECM לשחק תפקיד חשוב בתהליכים תאיים רבים, כולל הידבקות, בידול, ואפופטוזיס. בvivo, ECM מורכב על ידי חשיפת הרכבה עצמית הנסתרת אתרים (fibrillogenesis) בתוך חלבונים . תהליך זה משתנה לחלבונים שונים, אבל fibrillogenesis פיברונקטין (FN) מאופיין היטב ומשמש כמערכת מודל להרכבת ECM תא בתיווך. באופן ספציפי, תאים משתמשים בקולטנים integrin על קרום התא כדי לאגד הדימרים FN וכוחות התכווצות-actomyosin נוצר כדי להתפתח ולחשוף את אתרי קישור להרכבה לסיבים לא מסיסים. תהליך בתיווך קולטן זה מאפשר לתאים כדי להרכיב ולארגן ECM מהסלולרי לSCA רקמהles. כאן, אנו מציגים שיטת הרכבה מכונה ביוזמת פני השטח (SIA), אשר משחזרת הרכבה מטריצת תא בתיווך באמצעות אינטראקציות חלבון פני השטח כדי להתפתח חלבוני ECM ולהרכיב אותם לסיבים לא מסיסים. ראשית, חלבוני ECM הם על adsorbed polydimethylsiloxane הידרופובי פני השטח (PDMS) שבו הם לפגל באופן חלקי (unfold) ולחשוף תחומים המחייבים נסתרים. אז חלבוני פרש מועברים במייקרו וnanopatterns המוגדרים היטב באמצעות הדפסת microcontact על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm). פירוק תרמי-מופעל של PIPAAm מוביל להרכבה ושחרורו של nanofibers מסיס חלבון ECM וננו בגיאומטריות מוגדרות היטב סופיים. ארכיטקטורות מורכבות אפשריות על ידי דפוסים הנדסיים מוגדר על בולי PDMS המשמשים להדפסת microcontact. בנוסף לFN, תהליך SIA ניתן להשתמש עם laminin, פיברינוגן וcollagens להקליד אני ורביעי כדי ליצור nanostruc ECM מרובה רכיביםטורס. לפיכך, SIA יכול לשמש מהנדס חומרים מבוסס חלבון ECM עם שליטה מדויקת על הרכב חלבון, סיבי הגיאומטריה ואדריכלות פיגום על מנת לשחזר את המבנה והרכב של ECM in vivo.
Introduction
המטריצה תאית (ECM) ברקמות מורכבת מחלבונים רב תכליתיים המעורבים בויסות פיסיקלית וכימית של תהליכים בתא מרובים, כולל הידבקות, התפשטות, התמיינות, ואפופטוזיס 1-3. ECM הוא מסונתז, התאסף, ומאורגן על ידי תאים ויש להם את סיבי החלבון המרכיבים את יצירות ייחודיות, גודל סיבים, גיאומטריות וארכיטקטורות המחוברים ביניהם משתנות עם סוג רקמה ושלב התפתחותי. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי ECM יכול לספק מאלפות רמזים שינחה את התאים ליצירת רקמות מהונדסות 4, המצביעה על כך משחזר ECM במונחים של הרכב ומבנה עשוי לאפשר הפיתוח של חומרי biomimetic עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.
מספר שיטות ייצור פותחו כדי להנדס פיגומים פולימריים שיכול לחקות היבטים של ECM ברקמות. לדוגמא, electrospinning ומפריד, שלבation שניהם הפגין היכולת ליצור מטריצות נקבוביות של סיבים בקטרים הנעים בין עשרות מיקרומטר עד עשרות ננומטרים 5-7. גם שני הטכניקות הראו כי מטריצות נקבוביות ביותר של nanofibers יכולות לתמוך הידבקות תא וחדיר לפיגום 8. עם זאת, גישות אלו מוגבלות בגיאומטריות סיבים, אוריינטציות ו3D הארכיטקטורות אפשריות שיכול להיות שנוצרו. Electrospinning בדרך כלל מייצר פיגומים בסיבים או בכיוון או מיושרים מאוד באופן אקראי ואילו הפרדת פאזות מייצרת פיגומים עם סיבים בכיוון באופן אקראי. יש גם מגבלות על החומרים, עם חוקרים בדרך כלל משתמשים בפולימרים סינטטיים, כגון פולי (ε-caprolactone) 8 ופולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) 9, כי הם מצופים לאחר מכן עם חלבוני ECM לקדם הידבקות תא. biopolymers הטבעית משמשות גם, לרבות סוג קולגן אני 10, ג'לטין 11, פיברינוגן 12,chitosan 13, ומשי 14, אבל מייצגים קבוצה קטנה בלבד של החלבונים הנמצאים ברקמות מקומיות. רוב הרקמות מכילות סביבה גדולה יותר של חלבוני ECM וסוכרים כוללים פיברונקטין (FN), laminin (LN), סוג IV קולגן וחומצה היאלורונית שקשים או בלתי אפשריים לפברק nanofibers תוך שימוש בשיטות קיימות.
כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מתמקדים מאמצי המחקר שלנו במחקו את הדרך בה תאים לסנתז, להרכיב ולארגן את סיבי חלבון ECM בסביבתם. בעוד תהליך fibrillogenesis הספציפי משתנה לחלבוני ECM שונים, בדרך כלל שינוי קונפורמציה במולקולת חלבון ECM מופעל על ידי האנזימטית או אינטראקציה קולטן בתיווך, אשר חושף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. כאן אנו משתמשים FN כמערכת מודל להבין את תהליך fibrillogenesis טוב יותר. בקצרה, homodimers FN להיקשר לקולטנים integrin על פני התא באמצעות רצף חומצות אמינו RGD בסוג 10th השניאני חוזר ליחידה. ברגע שחייב, integrins לנוע בנפרד באמצעות התכווצות actomyosin ולהתפתח הדימרים FN לחשוף אתרי הרכבה עצמית נסתרים. החשיפה של האתרים הללו FN-FN המחייבים מאפשרת הדימרים FN להרכיב ליפון מסיס תקין על פני תא 15. עבודה במערכות תא ללא הוכיחה שיכולים להתגלות אתרי FN-FN נסתרים מחייבים דרך התגלגלות באמצעות denaturants 16 או מתח פנים בנוזל מוצק אוויר ממשק 17-19. עם זאת, סיבי FN נוצרו על ידי טכניקות אלה מוגבלים לגדלי סיבים ספציפיים וגיאומטריות ומחויבות בדרך כלל למשטח.
כאן אנו מתארים הרכבה גישה שמכונה ביוזמת פני השטח (SIA) 20 שמתגברת על מגבלות אלה על ידי ניצול אינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור nanofibers חופשי עומד מסיס, nanofabrics (גיליונות 2D) ואחרים ננו מורכב מחלבוני ECM בודדים או מרובים (איור 1 ). בעמ 'זהrocess, חלבוני ECM הם adsorbed מקונפורמציה קומפקטית, כדורית בפתרון ומפוגל באופן חלקי (פרש) על גבי חותמת בדוגמת, polydimethylsiloxane הידרופובי (PDMS). אז חלבוני ECM מועברים במצב זה על פולי תרמית מגיבים (N-isopropylacrylamide) פני השטח (PIPAAm) באמצעות הדפסת microcontact 22. כאשר hydrated עם מים 40 ° C PIPAAm נותר מוצק, אבל כאשר התקררו 32 מעלות צלזיוס הוא עובר דרך טמפרטורה קריטית נמוך פתרון (LCST) שבו הוא הופך להיות הידרופילי, מתנפח עם מים ולאחר מכן מתמוסס, משחרר ננו ECM התאסף הנחה של על פני השטח. שיטת SIA מספקת שליטה על הממדים עם דיוק בקנה מידה ננומטרי. על ידי שליטה בפרמטרים מרכזיים כמו הרכב, גיאומטריה סיבים, ואדריכלות, אפשר לשחזר מאפיינים רבים של ECM מצאו in vivo ולפתח פיגומים מתקדמים עבור יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ייצור של עובש מאסטר באמצעות photolithography
- Nanofibers חלבון ECM, nanofabrics וננו להיות מפוברק נועדו ראשון באמצעות תכנון בעזרת מחשב תוכנה (CAD). קובץ CAD זה הוא הועבר לאחר מכן לphotomask. הסוג של photomask יהיה תלוי ברזולוציה של התכונות; עם photomask מבוסס שקיפות נאותה לגדלי תכונה עד ~ 10 מיקרומטר. תכונות קטנות <10 מיקרומטר ידרשו כרום על photomask זכוכית. כל nanofibers וננו שהוצג כאן היו מפוברק באמצעות photomask מבוסס שקיפות, וכך היו בקנה מידה ננומטרי בעובי אבל ממדים לא לרוחב.
הערה: חשוב להבחין אילו אזורים של photomask יהיו כהים (למנוע אור UV לעבור) ושיהיה שקוף (מאפשר אור UV לעבור) כמו זה, יחד עם הסוג של photoresist (חיובי או שלילי) , יכתיב את הטופוגרפיה הסופית של עובש האב. - כדי להתחיל ייצור של עובש האב, מייבש את פרוסות סיליקון 4 "על ידי הצבתו על פלטה חמה להגדיר ל-C ° 150 ל15 דקות.
- מרכז את רקיק על צ'אק הוואקום של ספין coater. יוצקים SU8-2015 photoresist השלילי על אמצע רקיק ותמשיך לשפוך במעגלים קונצנטריים, עד כשני שליש מהפרוסות מכוסה.
הערה: שמור את בקבוק קרוב SU8 לרקיק כאשר לשפוך כדי למזער את היווצרותן של בועות. - לתכנת את spincoater כדלקמן:
- מחזור התפשטות: סל"ד 500 עם האצת 100 סל"ד / שניות ל10 שניות.
- סחיטה: 4,000 סל"ד עם האצת 100 סל"ד / שניות ל30 שניות.
- רך לאפות את רקיק על ידי הצבתו על פלטה חמה שנקבעה ל95 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות.
- לחשוף את רקיק עם אור האולטרה סגול דרךphotomask למינון כולל של 140 mJ / 2 סנטימטר.
הערה: SU8 הוא photoresist שלילי ולכן האזורים בהם אור UV הוא מסוגל לעבור photomask יישארו לאחר הפיתוח ולהפוך לתכונות שהועלו על תבנית האב. - לאחר חשיפה לאפות את רקיק על ידי הצבתו על פלטה חמה להגדיר ל-C ° 95 למשך 4 דקות.
- לפתח את רקיק על ידי הצבתו במפתח SU8 במשך 3 דקות. לאחר 3 דקות, לשטוף את רקיק עם אלכוהול איזופרופיל. אם סרט לבן מופק במהלך השטיפה, רקיק אינו מפותח באופן מלא וזה צריך להיות ממוקם בגב המפתח ל30 שניות אחרת. לשטוף שוב עם אלכוהול איזופרופיל. חזור על תהליך זה עד שסרט לבן לא הטופס במהלך שטיפת אלכוהול איזופרופיל.
- ייבש את רקיק בזרם של חנקן ומניחים בצלחת פטרי 150 מ"מ כדי להגן מפני אבק.
2. ביצוע בולים PDMS
- הכן את prepolymer PDMS על ידי שילוב של בסיס אלסטומר וסוכן הריפוי ב10:01 יחס w / w. בדרך כלל 80 גרם של בסיס ו8 גרם של סוכן ריפוי נמצא בשימוש על מנת להבטיח שיש PDMS מספיק כדי לכסות את התבנית השנייה בשכבה בעובי 1 סנטימטר.
- מערבבים ודגת PDMS בעזרת מערבל הצנטריפטלי מוגדר הבא:
- מערבבים: 2,000 סל"ד 2 דקות
- דגה: 2,000 סל"ד במשך 2 דקות.
- אם מערבל אינו זמין לערבב PDMS ביד עבור 10 דקות באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מיליליטר. דגה את התערובת על ידי הצבתו בייבוש ואקום ל30 דקות כדי להסיר בועות.
- יוצקים prepolymer PDMS מספיק על עובש האב (פרוסות סיליקון בדוגמת) כדי ליצור שכבה בעובי 1 סנטימטר. Cure PDMS על ידי אפייה ב65 מעלות צלזיוס למשך 4 שעות או בטמפרטורת חדר למשך 48 שעות.
- ברגע שנרפא, ניתן לחתוך את האזורים המכילים את התבניות כדי ליצור את חותמות PDMS. כדי להבדיל בין צד התכונה מהישבן של חותמת PDMS, לחתוך חריץ מאחת הפינות בצד האחורי של הבול.
3. Microcontact Printing של דפוסי ECM
- coverslips זכוכית קוטר 25 מ"מ נקי על ידי sonication ב95% אתנול עבור שעה 1 ולאחר מכן יבשה בתנור 65 מעלות צלזיוס.
- הכן את פתרון PIPAAm ידי המסת PIPAAm ב1-butanol בריכוז של 10% (w / v, 1 גרם בדרך כלל ב10 מיליליטר).
- מרכז coverslip זכוכית על צ'אק הוואקום של spincoater ופיפטה 200 μl של פתרון PIPAAm כך שכל משטח הזכוכית מכוסה.
- Spincoat coverslip ב6,000 סל"ד דקות 1.
- נקה את בולי PDMS על ידי sonication ב50% אתנול ל30 דקות ולאחר מכן יבשה תחת זרם של חנקן.
הערה: ייבוש והשלבים הבאים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגי כדי לשמור על סטריליות ליישומים שבם ננו ECM ישמש בתאים. - מעייל את פני השטח בדוגמתו של כל PDMS להחתים עם 200 μl של פתרון החלבון, בדרך כלל 50 מיקרוגרם / מיליליטר במים מזוקקים סטריליים לFN. דגירה עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
הערה: ההוא ציפוי הנפח הוא לחותמת PDMS 1.5 2 סנטימטר וצריכה להיות מותאם בהתאם לגודל של בול PDMS, חלבון ECM משמש ואת הריכוז של חלבון ECM בתמיסה. - שטוף את בולי PDMS במים מזוקקים כדי להסיר חלבון ויבש עודפים ביסודיות תחת זרם של חנקן.
הערה: כל מים שנשארו על החותמת יפעילו את הפירוק המוקדם של ציפוי PIPAAm על coverslip ולמנוע העברת חלבון תקינה. - עבור ייצור סטרילי, הנח את coverslips מצופה PIPAAm בתוך צלחת פטרי סגורה ולעקר באמצעות חשיפה לקרינת UV, 45 דקות תחת אור UV בארון בטיחות ביולוגי הוא מספיק. אם אין צורך בסטריליות ניתן להשמיט את הצעד הזה.
- לבצע הדפסת microcontact על ידי הצבת בצד התכונה של חותמת PDMS במגע עם coverslip מצופה PIPAAm. במידת צורך, להשתמש במלקחיים כדי לנצל באורח קל בצד האחורי של הבולים כדי להסיר כל בועות אוויר ולהבטיח מגע אחיד.
- לאחר 5 ק"מn, לקלף את חותמת PDMS מcoverslip.
- בשלב זה, ניתן בדוגמת חלבוני ECM נוספים כדי ליצור מבנים מורכבים יותר וmulticomponent. עד 3 הדפסות אומתו לעבוד עם תהליך זה, ועוד יכול להיות ריאלי.
4. שחרור ECM Nanofibers וננו
- מקום coverslip PIPAAm הדוגמת המצופה בצלחת פטרי 35 מ"מ ולבדוק את נאמנות הדפוס באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. בהתאם לדגם, מצלמת CCD עשויה להיות נחוצה כדי לפתור את התכונות של הדפוס. גם מיקרוסקופ פלואורסצנטי יכול לשמש כדי לבדוק את הדפוס סיפק את חלבוני ECM שכותרתו fluorescently.
- הוסף 3 מיליליטר של מים 40 ° C מזוקקים לצלחת פטרי ולאפשר למים קרירים בהדרגה.
- פירוקה של שכבת PIPAAm ושחרורו של דפוסי חלבון ECM ניתן לנטר באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. אם היישום אינו מאפשר השימוש בטק האופטיhniques, השחרור יכול להיות במעקב על ידי מדידת טמפרטורת הפתרון. בדרך כלל, המים מקוררים לטמפרטורת חדר, גם מתחת לLCST של PIPAAm (32 מעלות צלזיוס), כדי להבטיח את ננו חלבון ECM כבר פורסם.
- לאחר שחרורו, nanofibers, nanofabrics וננו האחר צפים במים. כדי להשתמש בם ליישומים נוספים שהם צריכים לטפל. הגישה המדויקת תהיה תלויה במטרה הניסיונית ועשויה לכלול צעדים כגון לשתק על משטח אחר, נעו עם מערכת micromanipulator או ההטבעה בהידרוג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SIA מסוגל nanofibers חלבון ECM ההנדסה עם שליטה מדויקת ממדי סיבים. כדי להמחיש זאת, מערכים של nanofibers FN עם ממדים מישוריים של 50 x 20 מיקרומטר היו בדוגמת על coverslip PIPAAm המצופה (איור 2 א). עם השחרור, הסיבים התכווצו בגלל שהם היו מתחת לפני מתח טבוע כאשר בדוגמת על פני השטח PIPAAm (איור 2). ניתוח של nanofibers FN גילה הם היו טרום שחרור monodisperse עם אורך ממוצע של 50.19 ± 0.49 מיקרומטר ורוחב של 19.98 ± 0.17 מיקרומטר (איור 2 ג). למרות כיווץ ניכר, סיבי FN לאחר השחרור היו עדיין monodisperse עם אורך ממוצע של 14.15 ± 0.92 מיקרומטר ורוחב של 2.65 ± 0.32 מיקרומטר (איור 2 ד). מיקרוסקופ כוח אטומי סיפק נקודת מבט ברזולוציה גבוהה יותר של השינויים ממדיים סיבים הקשורים בתהליך שחרור SIA. יש לציין, סיבים היו טרום שחרורעובי אחיד של 5 ~ ננומטר (איור 2E) ואילו סיבים לאחר שחרור עובי הטרוגנית על בסדר הגודל של כמה מאה ננומטרים (איור 2F).
באמצעות תהליך SIA אפשר להנדס מגוון רחב של ננו חלבון ECM עם גודל מתכונן, צורה וקומפוזיציה (איור 3). לדוגמא, nanofibers FN תחילה 20 מיקרומטר רוחב ו 1 סנטימטר באורך היה בדוגמת על coverslip מצופה PIPAAm. לאחר הקירור ופירוק PIPAAm nanofibers שוחררו ויצר אשכולות ארוכים (איור 3 א). יתר על כן, משום שהדפוס מוגדר על ידי הטופוגרפיה של חותמת PDMS המשמשת להדפסת microcontact פני השטח, זה אפשרי להנדס ננו חלבון ECM המורכב. כהוכחה של קונספט, יצרנו כוכבי FN רב חמושים ששמרו על צורתם הכללית לאחר שחרורו (איור 3). מעניין, את זרועותיו של כוכב FN נדבקו כמו nanofibers אבלגופתו של הכוכב נשמרה הגודל שלה. בעוד FN הוא חשוב, אנחנו גם רוצים להוכיח שSIA עובד עם חלבוני ECM אחרים כגון LN וכי ניתן לשלב חלבוני ECM מרובים לאותו המבנה. לדוגמא, אנו מהונדסים nanofabric 2-D מורכב מnanofibers מאונך וביניהם של FN וLN במערך סריג מרובע (איור 3 ג). טרום לשחרר nanofibers FN היו 20 מיקרומטר רחב וnanofibers LN היו רחב 50 מיקרומטר. עם השחרור שני הסוגים של nanofibers נדבקו אבל הקישוריות הכוללת ומבנה סריג מרובע נשמרו. תוצאות אלו מראות כי SIA יכול לשמש מהנדס חומרי ECM עם מגוון רחב של יצירות ובמבנים.
מקרים של SIA הכושל של nanofibers ECM מוצגים באיור 4. סיבה אחת היא שחרור בלתי הולם בדפוס בחסר בשל העברה לקויה של חלבון ECM אל פני השטח PIPAAm במהלך הדפסת microcontact (איור 4 א). נוכחותם של חורים, קצוות לא סדירים, ופגמים אחרים תיצור nanofibers וננו שאינם שלמים ונוטים לשבירה ופיצול עם שחרור. פירוק מהיר של PIPAAm יכול גם לגרום לנאמנות דפוס גרועות לאחר שחרורו (איור 4). לדוגמא, שימוש בטמפרטורת חדר 20 מים די מעלות צלזיוס כבר מתחת LCST של PIPAAm במקום 40 ° C מים תגרום PIPAAm להתנפח במהירות ומתמוסס. זה יכול לגרום לשתי בעיות; (I) ההתרחבות המהירה יכולה לקרוע לגזרים כמה nanofibers ECM וכן (ii) התרחבות מהירה יכולה לגרום לשיבוש של סדר הדפוס לאחר שחרור.
איור 1. סכמטי של תהליך SIA. () פרוסה סיליקון היא spincoated עם photoresist השלילי SU8 וחשיפה לאור UV באמצעות photomask. אזורים שאינם חשופים מפותחים משם והשאירו מ 'בדוגמת טופוגרפית עובש אסטר. (B) prepolymer PDMS הוא שפך על עובש האב ונרפא במשך 4 שעות ב65 ° C. (ג) לאחר הריפוי, חותמת PDMS היא לחתוך החוצה. (ד ') החותמת מכן הודגרו עם פתרון חלבון ECM שבו החלבונים לספוג לחותמת בקונפורמציה פרש באופן חלקי. (E) החותמת היא שטפה כדי להסיר עודף חלבון, מיובש, והניחה במגע קונפורמי עם coverslip זכוכית מצופה-PIPAAm. (F) חותמת מוסר מכן והותיר אחריו חלבון ECM בדוגמת על coverslip PIPAAm המצופה, הדפוס מוכתב על ידי הטופוגרפיה של הבול. (G) coverslip ממוקם אז בצלחת פטרי ומכוסה במי 40 מעלות צלזיוס ולאחר מכן מקורר מתחת LCST של PIPAAm (~ 32 ° C), אשר מפעיל את פירוקה של PIPAAm ואת שחרורו של nanofibers התאסף ECM חלבון ו / או ננו מפני השטח.
"/> Tp_upload/51176/51176fig2.jpg
תוספת איור 2. באמצעות SIA להנדס אוכלוסיות של nanofibers monodisperse. () מערך של מלבנים FN, 50 מיקרומטר בהאורך ולרוחב ב20 מיקרומטר היה בדוגמת על גבי משטח PIPAAm. (ב) ל40 ° C מים DI והקירור הבא מתחת LCST של PIPAAm הפעיל את פירוקה של PIPAAm ושחרורו של nanofibers FN. עם השחרור, הסיבים נדבקו כפי שהם נמצאים תחת לחץ שלפני, כאשר בדוגמת על פני השטח PIPAAm. (ג) ניתוח של ממדי nanofiber מראש לשחרר חושף את הסיבים הם monodisperse עם אורך ורוחב של 50.19 ± 0.49 מיקרומטר ו19.98 ± 0.17 מיקרומטר, בהתאמה. (ד ') עם שחרור nanofibers נדבק אך נשאר monodisperse עם אורך לאחר השחרור ורוחב של 14.15 ± 0.92 מיקרומטר ו2.65 ± 0.32 מיקרומטר, בהתאמה. AFM (E) הראה כי nanofibers טרום השחרורהיו ~ 5 ננומטר עבה. AFM (F) של nanofibers לאחר השחרור הראה כי העובי עלה לכמה מאה ננומטרים בעוד את האורך ורוחב ירד. בקנה מידת ברים הם () מיקרומטר 50 ו (ב) 10 מיקרומטר.
nanofibers FN איור 3. באמצעות SIA להנדס nanofibers ECM החלבון וננו עם גודל מתכונן, צורה וקומפוזיציה. (א) היה בדוגמת על coverslip מצופה PIPAAm כמו 1 סנטימטר באורך ו20 מיקרומטר רוחב. שחרור תרמי הביא SIA של nanofibers FN הארוך, שלם עם רוחב מופחת של ~ 3 מיקרומטר. (ב) דוגמא של כוכב מסובך יותר רב חמוש FN, נציג של ננו המגוון שניתן ליצור באמצעות SIA. שחרור תרמי הביא להתכווצות של כלי הנשק, אך לא באזור של הכוכב, שבו זרועות חברו יחדיו המרכזי. (ג) זה גםניתן לשלב חלבוני ECM מרובים לאותו המבנה. לדוגמא, מאונך, 20 מיקרומטר קווים ביניהם רחבים של FN (אדום) ו50 מיקרומטר קווים רחבים של LN (ירוק) קווים ישולבו nanofabric 2D היו בדוגמת ולאחר מכן שוחרר. גם לאחר שחרורו, הדפוס נשמר הגיאומטריה הראשונית שלה וקישוריות. ברים סולם הם 50 מיקרומטר.
איור 4. דוגמאות לבעיות שעלולות למנוע SIA נכון ושחרור חלבון ממשטח PIPAAm. () הדפסת microcontact ירודה של חלבוני ECM על תוצאות PIPAAm בפיצול ופגמים אחרים של 20 מיקרומטר שורה FN רחב מונעת SIA של רציף nanofiber FN ובמקום תוצאה היא היווצרות רבים שברים קטנים יותר FN. (ב ') במהירות שחרור nanofibers FN ממצע PIPAAm עשויים להשפיע גם על סידור הסיבים הסופי. במקרה זה מיםלא 20 ° C, כבר מתחת לLCST של PIPAAm, נוספו ומופעל על פירוק מהיר גורם nanofibers לצמד חזרה, לשבור (30 שניות) ויוצר תצורות מאורגנות (שניות 52) אקראיות,. ברים סולם הם 50 מיקרומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
שיטת SIA מוצגת כאן מחקה הרכבה מטריצת תא בתיווך ומאפשרת להנדסה של nanofibers חלבון ECM וננו עם גודל מתכונן, ארגון וקומפוזיציה. אמנם לא זהה לECM-תא שנוצר, SIA יוצר ECM מורכב מסיבי חלבון ננו 20 שעוברים קיפול הפיך / התגלגלות במהלך מאמץ מכאני 21 ויכולים להיקשר לתאים 20. זה מספק יכולת ייחודית לבנות חומרי חלבון ECM כי לשחזר מאפיינים רבים של ECM מצאו in vivo. לדוגמא, יכול להיות מפוברק nanofibers ECM באורכים ספציפיים עם רמת השליטה מעשית עם טכניקות אחרות. אנחנו מדגימים את היכולת ליצור מערכים של nanofibers monodisperse (איור 2) עם שליטה מדויקת של אורך ומראש לשחרר רוחב (איור 2 ג) ולאחר שחרור (איור 2 ד). nanofibers ECM אלה יכול להיות בכל אורך, כפי שהודגם על ידי בודה ננו FNסיבים באורכים ~ 1 סנטימטר (איור 3 א). לעומת זאת, טכניקות ייצור אחרות כגון electrospinning והפרדת פאזות יכולות ליצור nanofibers אבל לא עם השליטה המדויקת של אורך, ייצור סיבים בעיקר מתמשכים. טכניקות גם הן מוגבלות בגיאומטריות הסיבים וארגון בתוך פיגום. SIA יכול לשמש כדי לבנות ננו ECM עם גיאומטריה מישוריים שרירותית, כגון כוכב (איור 3 ב), ובגיליונות 2-D עם שליטה שרירותית של ארגון סיבים, כגון nanofabric (איור 3 ג). יתר על כן, שיטות ייצור אחרות בדרך כלל להשתמש בחומרים סינטטיים או רק מספר מוגבל של אלה טבעיים כגון chitosan והפיברין. לשם השוואה, SIA מאפשר ההרכבה של nanofibers וננו המורכב לחלוטין של חלבוני ECM כגון FN וLN, שלא יכול להיות מפוברק עם שיטות אחרות אלה.
השלב הקריטי בתהליך SIA הוא מהדורת תרמית-מופעלת מהמשטח הדואר PIPAAm. כדי להבטיח את השחרור ראוי, יש כמה שלבים עיקריים שיש לשקול. ראשית, לאחר שלב הדפסת microcontact, הנאמנות של דפוס ECM הועבר יש לבדוק גם באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב או מיקרוסקופ פלואורסצנטי (אם חלבוני ECM מתויגים fluorescently). אם יש פגמים בדפוס החלבון על פני השטח PIPAAm, ולאחר מכן השחרור לאחר מכן יהיה לייצר ננו המכיל פגמים אלה (כפי שנצפה באיור 4 א). אם חותמת PDMS מייצרת שוב ושוב דפוסי חלבון עם מומים, סביר שצד micropatterned של חותמת PDMS כבר שרוט או מכיל פגמים וחותמת חדשה ואפשרות עובש מתאר חדש צריך להיעשות. בנוסף, יש לנקוט זהירות בעת לחות חלבון דוגמת, coverslip מצופה PIPAAm. המים צריכים להיות ליד או 40 ° C ולאפשר להתקרר באיטיות. אם המים לא חם מספיק או מתקררים מהר מדי, PIPAAm יתנפחnd מתמוסס מהר מדי וגרם nanofibers חלבון ECM וננו להיות פוטנציאל נקרעו לגזרים מהכוחות ואקראי שוחררו כך שכל ארגון מבני דומה למצב היבש, שוחרר מראש ייאבד (איור 4).
nanofibers חלבון ECM, ננו וnanofabrics התאסף באמצעות SIA יש יישומים רבים ביומכניקה, הנדסת רקמות, וביוטכנולוגיה. לדוגמא, הראיות האחרונות עולה כי התכונות מכאניות של סיבי חלבון ECM מסדירה פונקציונליות הביולוגי שלהם 23. SIA הוא אידיאלי כדי ליצור nanofibers חלבון ECM בצורה מטוהרת לניתוח מכאני. כדי לבצע ניסויים אלו, ניתן להשפיע nanofibers חלבון ECM שוחרר באמצעות micropositioners דיוק ולאחר מכן נמתח. Deravi et al השתמשו לאחרונה בגישה זו כדי להוכיח כי nanofibers FN יכול לעמוד עד הרחבות פי 8 ושהם עוברים אלסטי, פלסטיק, וstמשטרים עם מתח גובר 21 התקשות-גשם. בהנדסת רקמות, חלבון ECM פיגומים מבוסס בצורה של ג'לים (לדוגמא, סוג קולגן אני והפיברין) או רקמות decellularized 4 נמצאים בשימוש נרחב. בהשוואה לטכניקות אלה, היתרון של SIA הוא היכולת להנדס פיגומים עם ארכיטקטורה מוגדרת היטב בסיבי 1-D וגיליונות 2-D (איור 3 ג). לדוגמא, יש לנו הראינו בעבר כי ניתן זורעים שריר לב אל nanofibers FN כדי ליצור גדילים תפקודיים של שריר לב 20. זה מראה כי nanofibers FN הוא תא מחייב וכי הם יכולים לכוון את ההרכבה איזוטרופי של תאים לתוך מבני רקמות מיושרים. Nanofabrics 2-D יכול לחקות את מבנה הרכב ועלעלים של הקרום במרתף ליישום בהנדסת רקמות אפיתל ואנדותל. יתר על כן, אנו מפתחים דרכים חדשות לפריסת nanofibers ECM אלה וnanofabrics ב 3-D על ידי הטבעתם בתוך מטריצות הידרוג'ל.מהתהליך שתואר במאמר זה, ניתן להשתמש SIA להנדס, חומרי nanostructured מבוסס חלבון ECM עבור מגוון רחב של יישומים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
העניקה תמיכה כספית לJMS מיומכניקה NIH בתכנית רפואת רגנרטיבית T32 הדרכה (2T32EB003392), לQJ ממלגת דאוד-ICES וAWF מפרס ממציא ניו המנהל של NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P.
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K.
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
