Summary
A到从单个或多个细胞外基质蛋白得到纳米纤维和纳米结构复杂的方法进行描述。此方法使用蛋白质表面的相互作用与可调的组成和架构，在各种组织工程和生物技术应用创造自由站立蛋白质为基础的材料。
Abstract
细胞外基质（ECM）在组织中被合成，并通过细胞组装以形成一个三维纤维状蛋白质与网络紧密调节纤维的直径，组成和组织。除了 提供结构支撑，ECM的物理和化学性质在多种细胞过程，包括粘附，分化和凋亡中发挥重要作用， 在生物体内时，ECM是由蛋白质中暴露隐秘自组装（原纤维）位点组装。这个过程变化为不同的蛋白质，但纤连蛋白（FN）的原纤维是非常明确的，并作为细胞介导的ECM组件的模型系统。具体地，将细胞用对细胞膜整合素受体结合FN二聚体和肌动球蛋白生成的收缩力，以展开并暴露结合位点组装成不溶性纤维。该受体介导的过程使细胞从细胞聚集和组织的ECM来组织SCALES。在这里，我们提出了一个方法称为表面引发组装体（SIA），采用蛋白质表面的相互作用展开ECM蛋白和它们组装成不溶性的纤维，概括细胞介导的基质组装。首先，ECM蛋白吸附到疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）表面，他们部分变性（折叠）和揭露隐秘结合结构域。未折叠的蛋白质，然后转移中良好定义的微和纳米图案通过微接触印刷到热响应聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）表面。该PIPAAm的热引发溶解导致最终组装和不溶性的ECM蛋白的纳米纤维和纳米结构具有良好定义的几何形状的释放。复杂的架构是可以通过在用于微接触印刷的PDMS印章定义的工程模式。除了FN，新航过程中可以与层粘连蛋白，纤维蛋白原被使用和胶原蛋白I型和IV创建多组分的ECM nanostrucTures的。因此，SIA，可用于工程ECM蛋白质基材料，具有精确控制的蛋白质组合物，纤维的几何形状和脚手架架构中为了概括ECM的结构和组合物在体内 。
Introduction
细胞外基质（ECM）的组织是由参与多种细胞过程，包括黏附，增殖，分化和凋亡1-3的物理和化学调控的多功能蛋白质。 ECM的合成，组装，并通过细胞组织组成的蛋白质纤维具有独特的成分，纤维尺寸，几何形状和相互关联的架构，随组织类型和发展阶段。最近的工作已经证明，细胞外基质可以提供指导性线索来指导细胞形成工程化组织4，这表明扼要的ECM中的组成和结构方面可能使仿生材料的开发用于组织工程和生物技术的应用。
许多制造方法已开发工程师的聚合物支架，可在组织中模仿的ECM的各方面。例如，静电纺丝和相位组合模式振动性也都表现出以形成纤维的多孔基质具有直径范围从几十微米下降到几十纳米5-7的能力。这两种技术也已经表明，纳米纤维的高度多孔的基质可支持细胞粘附和浸润到支架8。然而，这些方法都在能够建立可能的纤维的几何形状，取向和三维结构的限制。静电通常会产生与支架或者进行定向或随机高度一致的纤维，而相分离产生的支架与随机取向的纤维。也有对这些材料的限制，研究人员通常采用的合成聚合物，如聚（ε-己内酯）8和聚（乳酸-共-乙醇酸）9，即其后涂ECM蛋白，以促进细胞粘附。天然生物聚合物也被使用，包括I型胶原10，明胶11，纤维蛋白原12，脱乙酰壳多糖13，和丝14，但是表示在天然组织中发现的蛋白质的仅一小部分。大多数组织中含有ECM蛋白质和多糖，包括纤连蛋白（FN），层粘连蛋白（LN），IV型胶原和透明质酸，很难或不可能制造用现有的方法的纳米纤维的较大的环境。
为了应对这一挑战，我们一直致力于我们对模仿的方式细胞合成，组装和组织细胞外基质蛋白纤维在其周围的研究工作。而具体原纤维形成过程而变化为不同的细胞外基质蛋白，通常在ECM蛋白质分子的构象变化是由酶或受体介导的相互作用，它公开晦涩自组装站点触发。这里我们使用FN作为一个模型系统，以更好地了解纤维形成过程。简言之，FN同源二聚体结合到通过RGD氨基酸序列在第10的II型整合素受体在细胞表面我重复单元。一旦绑定，则通过整合肌动球蛋白收缩移开，然后展开FN二聚体，露出神秘的自组装基地。这些FN-FN的结合位点的曝光使FN二聚体装配成不溶性纤维权利于细胞表面15。在无细胞系统中的工作已经证明，隐蔽FN-FN的结合位点可以通过使用变性剂16或表面张力在空气-液体-固体界面17-19展开的被揭示。然而，通过这些技术产生的FN纤维被限制在特定的纤维的尺寸和几何形状，并且通常结合到一个表面。
在这里，我们描述了一种方法称为表面引发组装体（SIA）20是利用蛋白质表面的相互作用来创建独立的不溶性纳米纤维，nanofabrics（二维表）和一个或多个ECM蛋白组成（ 图1其它纳米结构克服了这些限制）。在这个Process，ECM蛋白质从溶液中一个紧凑的，球形构象吸附和部分变性（展开）上的图案化，疏水性聚二甲基硅氧烷（PDMS）的邮票。的ECM蛋白，然后在这种状态下转移到热响应聚（N-异丙基丙烯酰胺）（PIPAAm）表面通过微接触印刷22。当用40℃的水的水合的PIPAAm仍是固体，但是当冷却到32℃下其穿过其中它变成亲水性的低临界溶解温度（LCST），溶胀用水，然后溶解，释放出组装纳米结构的ECM销的表面上。新航方法提供了具有纳米级精度的尺寸控制。通过控制的关键参数，如组合物中，纤维的几何形状，和架构，它可以概括ECM的体内发现了许多属性和开发先进的支架用于组织工程和生物技术的应用。
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Protocol
1，制作母模使用光刻
- 细胞外基质蛋白纳米纤维，nanofabrics和纳米结构是捏造的，首先设计使用计算机辅助设计（CAD）软件。然后这个CAD文件被传送到一个光掩模。光罩的类型将取决于功能的决议;用透明度为基础的光罩足够的特征尺寸降低到〜10微米。较小的特点<10微米，需要在玻璃光掩膜铬。所有这里介绍的纳米纤维和纳米结构是使用一个透明的基于光掩模制造的，因而是纳米级的厚度，但不能横向尺寸。
注意：区分哪个光掩模的区域将成为暗是重要的（防止UV光通过），并且将是透明的（允许UV光穿过），因为这，随着光致抗蚀剂的类型（正或负） ，将决定主模的最终形貌。 - 以开始主模具的制造中，通过将其放置在热板上设定为150℃下进行15分钟脱水4“硅晶片。
- 围绕一个旋涂机的真空夹紧晶片。倾SU8-2015的负光致抗蚀剂到晶圆的中间，并继续在同心圆浇注直到大约三分之二晶片的覆盖。
注意：浇注时，尽量减少气泡的形成保持瓶SU8靠近晶片。 - 编程spincoater如下：
- 扩散周期：500 rpm的转速100转/秒，持续10秒的加速度。
- 旋转循环：4,000 rpm的转速100转/秒，持续30秒的加速度。
- 软通过将其放置在热板上设定为95℃，3分钟烘焙晶片。
- 通过与紫外线暴露晶圆光掩模为140毫焦耳/厘米2的总剂量。
注意：SU8是负光致抗蚀剂的区域，因此，其中UV光能够通过光掩模将保持显影后，成为在主模的凸起特征。 - 曝光后烘烤的晶片通过将其放置在热板上设置到95℃持续4分钟。
- 通过将其放置在SU8开发商为3分钟发展晶圆。 3分钟后，用异丙醇冲洗晶片。如果在白色膜的漂洗过程中产生的，该晶片没有发育完全，它应该被放回显影剂另外的30秒。用异丙醇再次冲洗。重复这个过程，直到一个白色的膜不异丙醇漂洗过程中形成。
- 干燥晶片中的氮和地点在150mm的培养皿流以防止灰尘。
2，制作的PDMS邮票
- 通过结合弹性体基体，并在固化剂制备的PDMS预聚物10:1 w / w的比值。通常80克基和8g固化剂的使用，以确保有足够的PDMS以覆盖母模在1厘米厚的一层。
- 混合脱泡用向心力搅拌机设置为以下的PDMS：
- 混合：2,000 rpm离心2分钟
- 脱气：2,000 rpm离心2分钟。
- 如果混频器是不可用的用10ml的血清吸液管通过手混合的PDMS 10分钟。通过将其放置在真空干燥器中30分钟，以除去气泡脱气混合物。
- 倒入足量的PDMS预聚物在母模（图案硅片），形成1厘米厚的一层。通过在65℃下烘烤4小时，或在室温下放置48小时固化的PDMS。
- 一旦固化，包含模式的区域可切出，形成PDMS印章。从PDMS压模的背面区分特征侧，切出缺口的邮票上的背面的一个角的。
3，微接触镨ECM模式的inting
- 干净25mm直径的玻璃盖玻片上通过超声处理在95％乙醇中1小时，然后干燥在65℃的烘箱中。
- 通过在10％的浓度（重量/体积，通常为1克配成10毫升）中的1 - 丁醇中溶解PIPAAm准备PIPAAm溶液。
- 居中的玻璃盖玻片上spincoater和移液管200微升的PIPAAm溶液中的真空吸盘，使整个玻璃表面被覆盖。
- 旋涂盖玻片在6000 rpm下离心1分钟。
- 通过超声处理在50％乙醇清洗。PDMS压模30分钟，然后在氮气流中干燥。
注：干燥和随后的步骤应在生物安全柜内进行，以保持无菌的应用场合ECM的纳米结构将与细胞使用。 - 用200μl的蛋白质溶液，在无菌蒸馏水中进行FN通常为50微克/毫升外套各PDMS的图案化表面的邮票。孵育1小时，在室温下进行。
注：TH被涂覆量为1.5 cm 2的PDMS压模，将需要取决于PDMS压模，用于对ECM蛋白质和在溶液中的细胞外基质蛋白的浓度的大小进行调整。 - 在蒸馏水中洗涤。PDMS压模，以彻底在氮气流除去过量的蛋白质和干燥。
注：留在了邮票的任何水都会触发PIPAAm涂层的过早解散盖玻片上，影响正常的蛋白质转移。 - 对于无菌生产，将PIPAAm涂盖玻片封闭的培养皿内，用灭菌的生物安全柜紫外线照射下，UV光45分钟就足够了。如果不需要无菌此步骤可以省略。
- 通过将PDMS压模的特性侧与PIPAAm涂覆的盖玻片接触进行微接触印刷。如果需要，使用镊子轻轻敲打在邮票背面，以消除任何气泡，并确保均匀接触。
- 经过5英里N，剥离PDMS印章从盖玻片。
- 在此阶段，另外的ECM蛋白可被图案化，以创建更复杂的多组分结构。最多3个印刷已经核实这一过程的工作，更可能是可行的。
ECM纳米纤维和纳米结构4。释放
- 将图案PIPAAm涂在盖玻片35毫米的培养皿中，并用相差显微镜检查图案逼真。取决于模式，CCD照相机，可能需要解决的图案的特征。荧光显微镜，也可用于检查所提供的ECM蛋白的荧光标记的图案。
- 加入3毫升40℃的蒸馏水的培养皿中，并让水逐渐冷却。
- 该PIPAAm层的溶解和ECM蛋白模式的释放可以用相差显微镜进行监测。如果应用程序不允许使用光学TEC的hniques，释放可以通过测量溶液的温度进行监测。通常，水被冷却至室温，远低于PIPAAm（32°C）的LCST，以确保对ECM蛋白的纳米结构已经被释放。
- 释放后，纳米纤维，nanofabrics和其他纳米结构漂浮在水中。将它们用于进一步的应用，他们需要被操纵。的确切方法将取决于实验目的，并且可以包括以下步骤，例如固定到另一个表面上，用显微操作器系统移动或在水凝胶包埋。
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Representative Results
新航能工程的ECM蛋白纳米纤维与精确控制光纤的尺寸。为了证明这一点，FN纳米纤维为50×20微米平面尺寸的阵列，图案到PIPAAm涂盖玻片（ 图2A）。获释后，纤维收缩，因为他们是在一个固有的预应力对PIPAAm面（ 图2B）图案时。新生力量纳米纤维的分析表明它们是单分散的预发行以50.19的平均长度±0.49微米的19.98±0.17微米，宽度（ 图2C）。尽管收缩明显，FN纤维释放后仍具有单分散的14.15，平均长度±0.92微米，宽度为2.65±0.32微米（ 图2D）。原子力显微术提供了与SIA释放的过程相关联的纤维的尺寸变化的更高分辨率的角度。值得注意的是，纤维预发布了的〜5nm的（ 图2E）具有均匀的厚度，而纤维释放后有几百纳米（ 图2F）量级的异质厚度。
使用SIA过程中，它可能建造多种ECM蛋白的纳米结构具有可调的大小，形状和组成（ 图3）。例如，FN纳米纤维最初20微米的宽度和1厘米的长度被图案化到一个PIPAAm涂覆的盖玻片。在冷却和PIPAAm溶解纳米纤维被释放形成长的螺纹（ 图3A）。另外，由于图案是由用于微接触印刷的PDMS压模的表面形貌所定义，它是可以设计复杂的细胞外基质蛋白的纳米结构。作为证明了概念，我们创建了多臂FN恒星保持其形状一般释放（ 图3B）之后。有趣的是，FN星的武器合同，如纳米纤维，但明星的身体保持它的大小。而FN是重要的，我们也想表明，SIA可与其他细胞外基质蛋白，如LN和多个ECM蛋白可结合到相同的结构。例如，我们设计了一个2-D nanofabric的FN和LN的正方形格子阵列（ 图3C）和正交互联的纳米纤维组成。预放开FN纳米纤维分别为20μm宽和LN纳米纤维为50微米宽。获释后两种类型的纳米纤维的收缩，但整体的互联互通和方形晶格结构维持。这些结果表明，SIA，可用于工程ECM材料具有各种组成和结构的。
ECM纳米纤维的失败SIA的实例示于图4，其中一个原因是不正确的释放不完全的图案由于ECM蛋白中的微接触印刷（ 图4A不良转印到PIPAAm表面）。孔，边缘不规则等缺陷的存在将创建纳米纤维和纳米结构是不完整的，而且容易释放后断裂和碎片。 PIPAAm快速溶解也可以释放（ 图4B）后造成较差的图案逼真。例如，使用室温20℃去离子水已经低于PIPAAm的，而不是40℃的水的LCST将导致PIPAAm迅速溶胀和溶解。这可能会导致两个问题; （一）快速扩张可撕开一些细胞外基质的纳米纤维及（ii）快速扩张可能释放后引起的图案排列的破坏。
图1原理图新航的过程。（A）硅片用旋涂SU8负性光刻胶，并通过光掩模暴露在紫外线下。未曝光的区域被开发掉，留下一个地形图案米翠菊模具（B）的PDMS预聚物浇注在母模中并固化4小时，在65℃（C）的固化后，将PDMS压模切出（D）邮票，然后用一个ECM蛋白溶液孵育其中的蛋白质吸附到印模处于部分折叠构象（E）的邮票漂洗以除去过量的蛋白质，干燥，并置于与PIPAAm涂覆的玻璃盖玻片上共形接触（F）的邮票，然后除去留下在PIPAAm涂布盖玻片图案化的ECM蛋白中，图案是由印模的地形决定的。（G）的盖玻片，然后放置在培养皿中并覆盖有40℃的水，然后冷却PIPAAm（的LCST低于〜32 ℃），这将触发PIPAAm的溶解和组装的ECM蛋白的纳米纤维和/或纳米结构的表面的释放。
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图2。使用SIA来设计的单分散纳米纤维的群体（A）FN矩形的阵列，50μm的长度和20μm的宽度被图案化到PIPAAm面（B）增加的40℃去离子水和随后的冷却PIPAAm的LCST低于触发PIPAAm的溶解和FN纳米纤维的释放。获释后，纤维收缩，因为它们是根据预应力对PIPAAm表面图案时，纳米纤维尺寸（三）分析预发布揭示了纤维单分散与50.19±0.49微米的长度和宽度，19.98±0.17微米，分别为（D）获释后签约的纳米纤维，但仍具有单分散的14.15±0.92微米释放后的长度和宽度和2.65±0.32微米，分别为（E）原子力显微镜表明，预发行的纳米纤维分别为〜5nm厚。释放后的纳米纤维（F）的原子力显微镜表明，厚度增加至几百纳米，而长度和宽度减小。 - 比例尺是（A）为50μm和（B）10微米。
图3。使用SIA工程师的ECM蛋白的纳米纤维和纳米结构具有可调尺寸，形状，以及组合物（A）FN纳米纤维图案化到一个PIPAAm涂覆的盖玻片为1厘米的长度和宽度为20μm。热剥离导致的长期的，完整FN纳米纤维的SIA用〜3μm的宽度减小（B）的更复杂的多臂FN星，代表可以使用SIA被创建的各种纳米结构的一个例子。热释放导致手臂的收缩，但不是明星，这里的手臂连接在一起的中心区域（C）这也是可以将多个ECM蛋白整合到相同的结构。例如，正交，相互连接的20μm宽FN（红）线和LN（绿色）为50μm宽的线集成到一个2D nanofabric线被图案化，然后被释放。即使发布后，该模式保留了其最初的几何形状和互联互通。比例尺是50微米。
ECM蛋白图4。的问题，可能妨碍正常新航和蛋白质释放的PIPAAm表面的例子。（A）差微接触印刷到PIPAAm导致碎片和20μm宽FN线等缺陷防止连续新航FN纳米纤维，而是会导致形成许多更小的FN片段（B）迅速从PIPAAm衬底释放FN纳米纤维也可能影响最终的纤维排列。在这种情况下，水的T 20℃，已经低于PIPAAm的LCST，加入并引发快速溶解导致纳米纤维弹回，突破（30秒），并形成随机的，无组织的配置（52秒）。比例尺是50微米。
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Discussion
这里的新航法提出模仿细胞介导的基质组装，使之ECM蛋白纳米纤维和纳米结构工程与可调大小，组织和组成。虽然不完全相同的细胞产生的细胞外基质，新航造成细胞外基质蛋白纳米纤维20的经历可逆的折叠/内机械应变21展开，并能结合细胞20组成。这提供了构建的ECM蛋白的材料，概括ECM的体内发现了许多性能独特的能力。例如，细胞外基质的纳米纤维可以制造在特定的长度与控制不可行与其他技术的水平。我们展示了创造的单分散纳米纤维阵列（ 图2），控制精确长度和宽度预发布（ 图2C）和释放后（ 图2D）的能力。这些细胞外基质的纳米纤维可以是任何长度，具体表现为制造纳米FN纤维在约1cm的长度（ 图3A）。与此相反，如静电纺丝和相分离等的制造技术可以建立纳米纤维，但不与长度的精确控制，产生主要是连续的纤维。这些技术还局限在一个支架内纤维的几何形状和组织。 SIA可用于构建细胞外基质的纳米结构与任意平面的几何形状，例如星形（ 图3B），并且在任意控制纤维组织的二维表，如一个nanofabric（ 图3C）。另外，其它制造方法通常使用的合成材料或天然的，如脱乙酰壳多糖和纤维蛋白仅在有限的次数。相比之下，SIA使纳米纤维和纳米结构的ECM蛋白如FN和LN，其不能与这些其它方法制造的完全组成的组装。
在SIA过程中的关键步骤是从日热触发释放ËPIPAAm表面。为了确保适当的释放，也有应该考虑的几个关键步骤。首先，微接触印刷步骤后，所传输的ECM的图案的保真度应为用相位差显微镜或荧光显微镜（如ECM蛋白是荧光标记）检测。如果有在上PIPAAm表面的蛋白质图案任何缺陷，则随后的释放将产生包含这些缺陷（如在图4A中观察到的）的纳米结构。如果PDMS印章反复产生蛋白质模式有缺陷，这是有可能的PDMS印章的微图案侧被抓破或包含缺陷和新的印花和潜在的新的主模应作出。此外，应注意保湿图案的蛋白质，PIPAAm涂层盖玻片时服用。水应该是在或接近40℃，并使其缓慢冷却。如果水不够温暖或冷却过快，则PIPAAm会膨胀一第二溶解速度过快造成的ECM蛋白的纳米纤维和纳米结构可以潜在地撕开的力和随意地释放，使得任何组织结构类似的干燥，预释放状态将会丢失（ 图4B）。
细胞外基质蛋白纳米纤维，纳米结构和nanofabrics使用SIA组装在生物力学，组织工程和生物技术有很多应用。例如，最近的证据表明，细胞外基质蛋白的原纤维的机械特性支配它们的生物学功能23。新航非常适合于进行力学分析纯化的形式创建的ECM蛋白纳米纤维。要执行这些实验中，发布的ECM蛋白纳米纤维可以采用精密微定位器进行操作，然后拉伸。 Deravi 等人最近用这种方法来证明FN纳米纤维可承受高达8倍的扩展，他们接受弹性，塑性，和ST雨刚化制度与越来越大的压力21。在组织工程中，细胞外基质蛋白为基础的支架中的凝胶的形式（ 例如 ，I型胶原和纤维蛋白）或脱细胞组织4顷广泛使用。相比于这些技术，SIA的优点是对工程师支架具有良好定义的体系结构中的一维的纤维和二维表（ 图3C）的能力。例如，我们曾表明，心肌细胞可接种到FN纳米纤维，形成心肌20的功能链。这表明，该纳米纤维的FN是细胞结合，并且他们可以直接细胞的各向异性组装成对齐的组织结构。的2-D nanofabrics可以模仿基底膜中的上皮细胞和内皮组织工程应用的组成和层结构。此外，我们正在开发新的方法来通过水凝胶基质中嵌入他们的3-D部署这些细胞外基质的纳米纤维和nanofabrics。从本文中描述的过程中，它能够使用SIA工程师ECM蛋白质基，纳米结构材料用于各种各样的应用。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Acknowledgments
财政支持是来自美国国立卫生研究院主任的新的创新奖（1DP2HL117750）提供给JMS来自美国国立卫生研究院生物力学在再生医学T32训练计划（2T32EB003392），以QJ从多德 - ICES奖学金和AWF。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
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