Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Bruke Surface-initiert Assembly

Published: April 17, 2014 doi: 10.3791/51176
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Carnegie Mellon University, 2Department of Materials Science and Engineering, Carnegie Mellon University

Summary

En fremgangsmåte for å oppnå nanofibre og komplekse nanostrukturer av ett eller flere ekstracellulære matriksproteiner er beskrevet. Denne metoden benytter protein-overflaten interaksjoner for å skape frittstående protein-baserte materialer med fleksibel sammensetning og arkitektur for anvendelse i en rekke vev tekniske og bioteknologiske anvendelser.

Abstract

Den ekstracellulære matriks (ECM) i vev er syntetisert og satt sammen av cellene for å danne en 3D-fibrillær, protein-nettverket med strengt regulert fiberdiameter, sammensetning og organisasjon. I tillegg til å gi strukturell støtte, de fysiske og kjemiske egenskapene til ECM spille en viktig rolle i flere cellulære prosesser, inkludert heft, differensiering og apoptose. In vivo, er ECM montert ved å utsette kryptisk selv-montering (fibrillogenesis) nettsteder innenfor proteiner . Denne prosessen varierer for forskjellige proteiner, men fibronektin (FN) fibrillogenesis er godt karakterisert, og tjener som et modellsystem for celle-mediert ECM sammenstillingen. Spesielt cellene bruker integrin reseptorer på cellemembranen å binde FN dimer og actomyosin generert kontraktile krefter til å utfolde seg og avsløre bindingssteder som skal samles i uløselig fiber. Denne reseptoren-mediert prosess gjør at celler til å sette sammen og organisere ECM fra mobil til vev scales. Her presenterer vi en metode kalt overflate initiert montering (SIA), som sammenfatter celle-mediert matrix montering ved hjelp av protein-overflaten interaksjoner å utfolde ECM proteiner og montere dem inn i uløselig fiber. Først, er ECM proteiner adsorbert på en hydrofob polydimethylsiloxane (PDMS) overflaten der de delvis denaturere (utfolde) og avsløre kryptiske bindende domener. De utspredte proteiner overføres deretter i godt definerte mikro-og nanopatterns gjennom microcontact utskrift på en termisk følsom poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) overflate. Termisk-utløst oppløsning av PIPAAm fører til sluttmontering og frigjøring av uløselige ECM protein nanofibers og nanostrukturer med veldefinerte geometrier. Komplekse arkitekturer er mulig ved ingeniør definerte mønstre på de PDMS frimerker brukes for microcontact utskrift. I tillegg til FN, kan SIA prosessen brukes med laminin, fibrinogen og kollagen type I og IV for å lage flerkomponent ECM nanostrucsjoner. Således kan SIA brukes til å konstruere ECM protein-baserte materialer med nøyaktig kontroll over proteinsammensetningen, fibergeometri og stillas-arkitektur for å rekapitulere strukturen og sammensetningen av ECM in vivo.

Introduction

Den ekstracellulære matrix (ECM) i vev består av flerfunksjonelle proteiner involvert i fysisk og kjemisk regulering av flere celle prosesser, inkludert heft, spredning, differensiering og apoptose 1-3. ECM er syntetisert, montert, og organisert av celler og de bærende protein fibriller har unike komposisjoner, fiber størrelse, geometrier og sammenhengende arkitekturer som varierer med vevstype og utviklingsstadiet. Nyere arbeider har vist at ECM kan gi lærerike signaler for å veilede celler til å danne utviklet vev 4, noe som tyder på at rekapitulere ECM i form av komposisjon og struktur kan muliggjøre utvikling av biomimetic materialer for tissue engineering og bioteknologi.

Det er utviklet en rekke metoder for fabrikasjon til ingeniør polymere stillaser som kan etterligne sider av ECM i vev. For eksempel electro og fase separasjon har begge vist evne til å danne porøse matrikser av fibre med diametere i området fra titalls mikrometer ned til titalls nanometer 5-7. Begge teknikker har også vist seg at meget porøse matrikser av nanofibers kan støtte celle adhesjon og infiltrasjon inn i stillaset 8.. Imidlertid er disse tilnærmingene begrenset i de mulige fiber geometrier, orienteringer og 3D-arkitekturer som kan opprettes. Electro vanligvis produserer stillaser med enten tilfeldig orienterte eller svært justert fibre mens fase separasjon produserer stillaser med tilfeldig orienterte fibre. Det er også begrensninger på materialet, med forskere vanligvis ved hjelp av syntetiske polymerer, slik som poly (ε-kaprolakton) 8 og poly (melkesyre-ko-glykolsyre) 9, som deretter blir belagt med ECM-proteiner for å fremme celleadhesjon. Naturlige biopolymerer blir også brukt, inkludert kollagen type I 10, gelatin 11, fibrinogen 12,kitosan 13 og silke 14, men representerer bare en liten del av de proteiner som finnes i det opprinnelige vev. De fleste vev inneholder et større miljøet av ECM-proteiner og polysakkarider inkludert fibronektin (FN), laminin (LN), kollagen type IV og hyaluronsyre som er vanskelig eller umulig å fremstille nanofibre ved hjelp av eksisterende metoder.

For å møte denne utfordringen, har vi fokusert vår forskningsinnsats på å etterligne måten cellene syntetisere, sette sammen og organisere ECM protein fibriller i sine omgivelser. Mens den spesifikke fibrillogenesis prosessen varierer for ulike ECM proteiner, vanligvis en konformasjonsendring i ECM protein molekylet er utløst av en enzymatisk eller reseptor-mediert interaksjon, som utsetter kryptiske selv montering nettsteder. Her bruker vi FN som et modellsystem for å bedre forstå fibrillogenesis prosessen. Kort, FN homodimers bindes til integrin-reseptorer på celleoverflaten via den RGD aminosyresekvens i den 10. type IIJeg gjentar enhet. Når bundet, de inte flytte fra hverandre via actomyosin sammentrekning og utfolde seg på Fn-dimer å avsløre kryptiske selv montering nettsteder. Eksponeringen av disse FN-FN bindingssteder gjør det mulig for FN dimer å montere inn et uløselig fibril rett på celleoverflaten 15. Arbeid i cellefrie systemer har vist at kryptiske FN-FN bindingssteder kan bli avslørt gjennom utfoldelse hjelp denatureringsmidler 16 eller overflatespenning på en luft-væske-solid grensesnitt 17-19. Imidlertid er de FN fibre laget av disse teknikker er begrenset til bestemte fiber størrelser og geometrier og er vanligvis bundet til en overflate.

Her beskriver vi en tilnærming kalt overflate initiert montering (SIA) 20 som overvinner disse begrensningene ved å utnytte protein-overflaten interaksjoner for å lage frittstående uløselige nanofibers, nanofabrics (2D ark) og andre nanostrukturer som består av ett eller flere ECM proteiner (Figur 1 ). I denne process, er ECM proteiner absorberes av en kompakt, globular konformasjon i løsning og delvis denaturert (utbrettet) på en mønstret, hydrofob polydimethylsiloxane (PDMS) stempel. ECM proteiner blir deretter overført i denne tilstanden på en termisk responsive poly (N-isopropylacrylamide) (PIPAAm) overflaten gjennom microcontact utskrift 22. Når hydratisert med 40 ° C vann i PIPAAm forblir et fast stoff, men når det ble avkjølt til 32 ° C den passerer gjennom en nedre kritisk temperatur løsning (LCST) hvor den blir hydrofil, sveller med vann og deretter oppløses og frigjør de sammensatte ECM nanostrukturer av av overflaten. SIA metoden gir kontroll over dimensjonene med nanometer-skala presisjon. Ved å kontrollere viktige parametere som sammensetning, fibergeometri, og arkitektur, er det mulig å rekapitulere mange egenskaper til ECM som finnes in vivo, og for å utvikle avanserte stillaser for vevet teknikk og bioteknologiske anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En. Fabrikasjon av Master Mold Bruke Fotolitografi

  1. De ECM protein nanofibers, nanofabrics og nanostrukturer som skal fabrikkeres er første utformet ved hjelp av dataassistert konstruksjon (DAK) programvare. Denne CAD-fil blir så overført til en fotomaske. Den type fotomaske, vil avhenge av oppløsningen av funksjonene; med en åpenhet basert fotosjablonen tilstrekkelig for funksjonen størrelser ned til ~ 10 mikrometer. Mindre funksjoner <10 mikrometer vil kreve en krom på glass photomask. Alle de nanofibers og nanostrukturer som presenteres her ble fabrikkert ved hjelp av en åpenhet basert fotomaske, og dermed var nanometer-skala i tykkelse, men ikke lateral dimensjoner.
    Merk: Det er viktig å skille hvilke områder av fotomasken blir mørke (hindre UV-lys å passere gjennom), og som blir gjennomsiktig (tillate UV-lys å passere gjennom) i denne, sammen med den type av fotoresist (positiv eller negativ) , vil diktere den endelige topografi av master mold.
  2. For å begynne fremstillingen av kapteinen mugg, dehydrerer en 4 "silicon wafer ved å plassere den på en varmeplate innstilt på 150 ° C i 15 min.
  3. Sentrer wafer på vakuum chuck av en spin-coater. Hell SU8-2015 negative fotoresist på midten av skiven og fortsette å helle i konsentriske sirkler til omtrent to tredjedeler av skiven er dekket.
    Merk: Hold flaske SU8 nær wafer når helle å minimere dannelse av bobler.
  4. Programmere spincoater som følger:
    • Spread syklus: 500 rpm med en akselerasjon på 100 rpm / sek i 10 sek.
    • Sentrifuger: 4000 rpm med en akselerasjon av 100 rpm / sek for 30 sek.
    Merk: Denne oppskriften spincoating vil danne et fotoresistent lag som er ~ 10 mikrometer i tykkelse. Ved å endre den roterende hastighet eller SU8 formulering, kan tykkelsen justeres.
  5. Soft bake wafer ved å plassere den på en kokeplate satt til 95 ° C i 3 min.
  6. Expose wafer med UV-lys igjennomfotomasken for en total dose på 140 mJ / cm 2.
    Merk: SU8 er en negativ fotoresist derfor regioner hvor UV-lyset er i stand til å passere gjennom fotomasken forblir etter å ha utviklet og blir hevet funksjoner på masterformen.
  7. Post eksponering bake wafer ved å plassere den på en kokeplate satt til 95 ° C i 4 min.
  8. Utvikle wafer ved å plassere den i SU8 utvikler for 3 min. Etter tre minutter, skyll wafer med isopropyl alkohol. Dersom en hvit film fremstilles i løpet av skyllingen, vil skiven ikke er fullstendig utviklet, og det skal legges tilbake i fremkalleren for en annen 30 sek. Skyll igjen med isopropanol. Gjenta dette inntil en hvit film ikke dannes i løpet av isopropylalkohol skylling.
  9. Tørk skiven i en strøm av nitrogen, og plasser i en 150 mm petriskål for å beskytte mot støv.

2. Making the PDMS Frimerker

  1. Klargjør PDMS forpolymer ved å kombinere elastomer base og herder i en10:01 vekt / vekt-forhold. Vanligvis 80 g av base og 8 g herder brukes til å sikre at det er tilstrekkelig PDMS å dekke master mold i en 1 cm tykt lag.
  2. Bland og avgasse PDMS ved hjelp av en sentripetal mixer satt til følgende:
    • Mix: 2000 rpm i 2 min
    • Degas: 2000 rpm i 2 min.
  3. Dersom en blander er utilgjengelig blande PDMS for hånd i 10 minutter ved hjelp av en 10 ml serologisk pipette. Avgasse blandingen ved å plassere den i en vakuum-eksikator i 30 minutter for å fjerne bobler.
  4. Hell nok PDMS forpolymer over hovedformen (mønstrede silisiumskive) for å danne et 1 cm tykt lag. Cure PDMS ved baking ved 65 ° C i 4 timer eller ved romtemperatur i 48 timer.
  5. Når herdet, kan De regioner som inneholder mønstrene kuttes ut for å danne de PDMS frimerker. For å skille den funksjonen siden fra baksiden av PDMS stempel, kutte et hakk ut av ett av hjørnene på baksiden av stempelet.

Tre. Microcontact Printing av ECM Patterns

  1. Rene 25 mm diameter glass dekkglass ved sonikering i 95% etanol i 1 time, og deretter tørke i en 65 ° C ovn.
  2. Klargjør PIPAAm løsning ved oppløsning PIPAAm i 1-butanol med en konsentrasjon på 10% (vekt / volum, typisk 1 g i 10 ml).
  3. Sentrere et glass dekkglass på vakuum chuck av spincoater og pipette 200 mL av PIPAAm løsning slik at hele glassoverflaten er dekket.
  4. Spincoat dekkglass på 6000 rpm i 1 min.
  5. Rens PDMS stempler ved sonikering i 50% etanol i 30 min, og deretter tørke under en strøm av nitrogen.
    Merk: Tørking og påfølgende trinn skal utføres i et biosikkerhet kabinett for å opprettholde sterilitet for applikasjoner hvor ECM nanostrukturer vil bli brukt med celler.
  6. Coat det mønstrede overflaten til hver PDMS stempel med 200 pl av proteinoppløsningen, typisk 50 mikrogram / ml i sterilt destillert vann til FN. Inkuber i 1 time ved romtemperatur.
    Merk: Ther belegning av volumet for en 1,5 cm 2 PDMS stempel og må bli justert, avhengig av størrelsen av PDMS stempel, ECM-proteiner anvendes og konsentrasjonen av ECM-proteiner i løsning.
  7. Vask PDMS stempler i destillert vann for å fjerne overskudd av protein og tørk grundig under en strøm av nitrogen.
    Merk: Enhver vann igjen på frimerket vil utløse tidlig oppløsning av PIPAAm belegg på dekkglass og forhindre skikkelig protein overføring.
  8. For steril fabrikasjon, plassere PIPAAm-belagt dekkglass inne i et lukket petriskål og sterilisere med UV-eksponering, 45 minutter under UV-lys i en biosikkerhet kabinettet er tilstrekkelig. Hvis steriliteten ikke er nødvendig dette trinnet kan utelates.
  9. Utfør microcontact utskrift ved å plassere den funksjonen siden av PDMS stempel i kontakt med PIPAAm-belagt dekkglass. Hvis det er nødvendig, bruker pinsett til å trykke lett på baksiden av stemplene for å fjerne eventuelle luftbobler og sikre jevn kontakt.
  10. Etter 5 kmn, skrelle av PDMS stempel fra dekkglass.
  11. På dette stadiet, kan ytterligere ECM proteiner være mønster for å skape mer komplekse og multikomponent strukturer. Opp til tre opplag har blitt bekreftet til å jobbe med denne prosessen, og flere kan være gjennomførbart.

4. Offentliggjøring av ECM Nanofibers og nanostrukturer

  1. Plasser mønstrede PIPAAm belagt dekkglass i en 35 mm petriskål og inspisere mønster troskap med fasekontrastmikroskopi. Avhengig av mønsteret, kan et CCD-kamera være nødvendig for å løse de funksjoner i mønsteret. Fluorescensmikroskopi kan også brukes for å inspisere et mønster, forutsatt at ECM-proteiner er fluorescensmerkede.
  2. Tilsett 3 ml 40 ° C destillert vann til petriskål og la vannet gradvis kult.
  3. Oppløsningen av PIPAAm laget og utgivelsen av ECM proteinmønsteret kan overvåkes ved hjelp av fase kontrast mikroskopi. Hvis applikasjonen ikke tillater bruk av optiske techniques, kan frigjøring måles ved å måle temperaturen løsning. Vanligvis er vann ble avkjølt til romtemperatur, godt under LCST av PIPAAm (32 ° C), for å sikre de ECM protein nanostrukturer er blitt frigitt.
  4. Etter utgivelsen, er nanofibers, nanofabrics og andre nanostrukturer som flyter i vann. Å bruke dem for videre søknader de trenger for å bli manipulert. Den nøyaktige metode vil avhenge av den eksperimentelle målet og kan omfatte trinn slik som å immobilisere på en annen overflate, beveger seg med en mikromanipulator-system eller innstøping i en hydrogel.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SIA er i stand til ingeniør ECM protein nanofibers med presis kontroll over fiberdimensjoner. For å demonstrere dette, ble matriser av FN nanofibers med planar dimensjoner på 50 x 20 mikrometer mønstret på en PIPAAm belagt dekkglass (Figur 2A). Ved utgivelsen, fibrene kontrakt fordi de var under en iboende pre-stress når mønstret på PIPAAm overflate (figur 2B). Analyse av FN nanofibers avslørte de var monodisperse pre-release med en gjennomsnittlig lengde på 50,19 ± 0,49 mikrometer og bredde på 19,98 ± 0,17 mikrometer (figur 2C). Til tross for kontrahering bart, FN fibre etter utgivelsen var fortsatt monodisperse med en gjennomsnittlig lengde på 14,15 ± 0,92 mikrometer og bredde på 2,65 ± 0,32 mikrometer (figur 2D). Atomic force mikros gitt en høyere oppløsning perspektiv av fiberdimensjonsendringer knyttet til SIA løslatelsesprosessen. Spesielt, fiber pre-release haddeen jevn tykkelse på ~ 5 nm (figur 2E), mens fibrene etter utsetting hadde en heterogen tykkelse i størrelsesorden av flere hundre nanometer (figur 2f).

Ved hjelp av SIA-prosessen er det mulig å konstruere en rekke ECM protein nanostrukturer med fleksibel størrelse, form og sammensetning (figur 3). For eksempel FN nanofibers utgangspunktet 20 mikrometer i bredden og 1 cm i lengde ble mønstret på en PIPAAm-belagt dekkglass. Ved kjøling og PIPAAm oppløsning nanofibers ble løslatt danner lange tråder (figur 3A). Videre, fordi mønsteret er definert av overflatetopografien av PDMS stempel brukes for microcontact trykk, er det mulig å konstruere komplekse ECM protein nanostrukturer. Som proof-of-concept, vi skapte flere bevæpnede FN stjerner som beholdt sin generelle form etter utgivelsen (Figur 3B). Interessant, armene til FN stjerne kontrakt som nanofibers menlegemet av stjernen beholdt sin størrelse. Mens FN er viktig, har vi også ønsket å vise at SIA fungerer med andre ECM-proteiner som LN, og at bare en ECM-proteiner som kan bli innlemmet i den samme struktur. For eksempel konstruerte vi en 2-D nanofabric bestående av ortogonale og sammenhengende nanofibers av FN og LN i et kvadratisk gitter array (figur 3C). Pre-slipp FN nanofibers var 20 mikrometer brede og LN nanofibers var 50 mikrometer brede. Ved utgivelsen begge typer nanofibers kontrakt, men den generelle tilkoblinger og firkantet gitterstrukturen ble opprettholdt. Disse resultater viser at SIA kan brukes til å konstruere ECM materialer med forskjellige sammensetninger og strukturer.

Forekomster av feilet SIA av ECM nanofibers er vist i figur 4.. Én årsak er feilaktig frigjøring av en ufullstendig mønster på grunn av dårlig overføring av ECM-proteiner til PIPAAm overflaten under microcontact trykking (figur 4A). Tilstedeværelsen av hull, uregelmessige kanter, og andre defekter vil skape nanofibers og nanostrukturer som er ufullstendige og utsatt for brudd og fragmentering ved løslatelse. Rapid oppløsning av PIPAAm kan også føre til dårlig mønster troskap etter utgivelsen (Figur 4B). For eksempel bruker romtemperatur 20 ° C DI vann allerede under LCST av PIPAAm i stedet for 40 ° C vann vil føre til at PIPAAm å raskt hovne opp og oppløses. Dette kan føre til at to problemer; (I) den raske ekspansjonen kan rive i stykker noen ECM nanofibers og (ii) rask ekspansjon kan føre til forstyrrelse av ordningen mønsteret etter utgivelsen.

Figur 1
Figur 1. Skjematisk av SIA prosessen. (A) En silisiumskive er spincoated med SU8 negative fotoresist og eksponert for UV-lys gjennom en fotomaske. Ikke-eksponerte områder utvikles bort forlate et topografisk mønstret m aster formen. (B) PDMS forpolymer helles over hoved formen og herdet i 4 timer ved 65 ° C. (C) Etter herding, blir en PDMS stempel kuttet ut. (D) Dette stempel blir deretter inkubert med en ECM proteinløsning hvor proteinene adsorbere til stempelet i en delvis utfoldet konformasjon. (E) Stempelet skylles for å fjerne overskudd av protein, tørket og plassert i konform kontakt med en PIPAAm-belagte glass dekkglass. (F) Stempelet fjernes deretter etterlate mønstret ECM protein på PIPAAm belagt dekkglass, er mønsteret diktert av topografien i stempel. (G) Den dekkglass blir deretter plassert i en petriskål og dekket med 40 ° C vann og deretter avkjølt under LCST av PIPAAm (~ 32 ° C), noe som utløser oppløsningen av PIPAAm og utgivelsen av sammensatte ECM protein nanofibers og / eller nanostrukturer fra overflaten.

tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
Figur 2. Hjelp SIA til ingeniør populasjoner av monodisperse nanofibers. (A) En matrise med FN rektangler, 50 mikrometer i lengde og 20 mikrometer i bredde ble mønstret på PIPAAm overflaten. (B) Tilsetning av 40 ° C DI vann og etterfølgende avkjøling under LCST av PIPAAm utløste oppløsningen av PIPAAm og utgivelsen av Fn nanofibers. Ved utgivelsen, fibrene kontrakt som de er under en pre-stress når mønstret på PIPAAm overflaten. (C) Analyse av nanofiber dimensjoner pre-release avslører fibrene er monodisperse med en lengde og bredde på 50,19 ± 0,49 mikrometer og 19,98 ± 0,17 mikrometer, henholdsvis. (D) Ved utgivelsen nanofibers kontrahert men forble monodisperse med post-release lengde og bredde på 14,15 ± 0,92 mikrometer og 2,65 ± 0,32 mikrometer, henholdsvis. (E) AFM viste at de pre-release nanofibersvar ~ 5 nm tykt. (F) AFM av post-slipp nanofibers viste at tykkelsen er økt til flere hundre nanometer, mens lengden og bredden redusert. -Skala Bars er (A) 50 pm, og (B) 10 mikrometer.

Figur 3
Figur 3. Bruke SIA til ingeniør ECM protein nanofibers og nanostrukturer med tunbare størrelse, form og komposisjon. (A) fn nanofibers ble mønstret på en PIPAAm-belagt dekkglass som en cm i lengde og 20 mikrometer i bredden. Termisk utgivelsen resulterte i SIA av lange, intakte FN nanofibers med en redusert bredde på ~ 3 mikrometer. (B) Et eksempel på en mer komplisert multi-væpnet FN stjerne, representant for de ulike nanostrukturer som kan opprettes ved hjelp av SIA. Termisk frigjøring resulterte i kontraksjon av armene, men ikke den sentrale regionen av stjernen, hvor armene er koblet sammen. (C) Det er ogsåmulig å integrere flere ECM-proteiner inn i den samme struktur. For eksempel ble ortogonale, sammenhengende 20 mikrometer brede linjene i FN (rød) og 50 mikrometer brede linjer av LN (grønn) linjer integrert i en 2D nanofabric mønstret og deretter løslatt. Selv etter utgivelsen, mønsteret beholdt sin opprinnelige geometri og tilkoblinger. Scale barer er 50 mikrometer.

Figur 4
Figur 4 Eksempler på problemer som kan hindre riktig SIA og protein utgivelse fra PIPAAm overflaten.. (A) Dårlig microcontact utskrift av ECM proteiner på de PIPAAm resulterer i fragmentering og andre defekter i en 20 mikrometer brede FN linjen hindrer SIA av en kontinuerlig FN nanofiber og i stedet resulterer i dannelse mange mindre FN fragmenter. (B) Raskt å slippe FN nanofibers fra PIPAAm underlaget kan også påvirke det endelige fiber ordningen. I dette tilfelle vannt 20 ° C, som allerede er under LCST av PIPAAm, ble tilsatt, og utløses hurtig oppløsning forårsaker nanofibers til å sprette tilbake, bryter (30 sek), og å danne tilfeldige, uorganisert konfigurasjoner (52 sek). Scale barer er 50 mikrometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

SIA Metoden som presenteres her etterligner celle-mediert matrix montering og gjør det mulig for prosjektering av ECM protein nanofibers og nanostrukturer med fleksibel størrelse, organisering og sammensetning. Selv om ikke identisk med celle-generert ECM, skaper SIA ECM består av nanoskala protein fibriller 20 som gjennomgår reversibel / utbrettet under mekanisk belastning 21 og kan binde celler 20. Dette gir en unik mulighet for å bygge ECM proteinmaterialer som rekapitulere mange egenskaper til ECM som finnes in vivo. For eksempel kan ECM nanofibers fremstilles i bestemte lengder med en grad av kontroll umulig med andre teknikker. Vi viser evne til å lage sammensetninger av monodisperse nanofibers (figur 2) med nøyaktig kontroll av lengde og bredde pre-frigjøring (figur 2C) og post-frigjøring (figur 2D). Disse ECM nanofibers kan være hvilken som helst lengde, som demonstrert ved å fabrikkere FN nanofibrene i ~ 1 cm lengder (figur 3A). I motsetning til dette kan andre fremstillingsteknikker som electro og faseseparasjon lage nanofibers men ikke med nøyaktig styring av lengden, som produserer hovedsakelig kontinuerlige fibre. Disse teknikkene er også begrenset i fiber geometrier og organisasjon innenfor et stillas. SIA kan brukes til å bygge ECM nanostrukturer med vilkårlig plan geometri, for eksempel en stjerne (figur 3B), og i 2-D ark med vilkårlig styring av fiber organisasjon, for eksempel en nanofabric (figur 3C). Videre kan andre fremstillingsmetoder vanligvis bruker syntetiske materialer eller bare et begrenset antall av naturlige seg slik som chitosan og fibrin. Til sammenligning, gir SIA monteringen av nanofibers og nanostrukturer sammensatt fullstendig av ECM-proteiner som FN og LN, som ikke kan fremstilles med disse andre metoder.

Den kritiske trinn i SIA prosessen er termisk-utløste utgivelse fra the PIPAAm overflaten. For å sikre riktig utgivelsen, er det noen viktige skritt som bør vurderes. Først etter at microcontact utskrift trinnet, gjengivelsen av det overførte ECM mønsteret bør kontrolleres enten med fasekontrastmikroskopi eller fluorescens mikroskopi (hvis ECM proteiner er fluorescently merket). Hvis det er noen feil i proteinmønsteret på PIPAAm overflaten, så den påfølgende utgivelsen vil produsere nanostrukturer som inneholder disse defektene (som observert i figur 4A). Hvis en PDMS stempel gjentatte ganger produserer proteinmønsteret med defekter, er det sannsynlig at den micropatterned siden av PDMS stempel har blitt ripete eller inneholder feil og et nytt stempel og potensielt en ny mester mugg bør gjøres. I tillegg bør man være forsiktig når hydra protein mønstret, PIPAAm-belagt dekkglass. Vannet bør være ved eller nær 40 ° C og tillates å avkjøles langsomt. Hvis vannet ikke er varmt nok eller kjøler for raskt, vil den PIPAAm svelle ennd oppløse for raskt forårsaker ECM protein nanofibers og nanostrukturer for å være potensielt revet bortsett fra de kreftene og måfå løslatt slik at enhver strukturelt ligner den tørre, pre-lansert staten vil gå tapt (Figur 4B).

ECM protein nanofibers, nanostrukturer og nanofabrics montert ved hjelp av SIA har mange programmer i biomekanikk, tissue engineering, og bioteknologi. For eksempel indikerer nyere bevis på at de mekaniske egenskapene til ECM protein fibriller styrer deres biologiske funksjonalitet 23. SIA er ideell for å skape ECM protein nanofibers i renset form for mekanisk analyse. For å utføre disse eksperimentene, kan frigjøres ECM protein nanofibers manipuleres ved hjelp av presisjons micropositioners og deretter strekkes. Deravi m.fl. har nylig brukt denne tilnærmingen til å vise at FN nanofibers tåler opp til åtte-fold utvidelser og at de gjennomgår elastisk plast, og stregn-stivne regimer med økende belastning 21. I tissue engineering, ECM protein basert stillasene i form av gels (f.eks, kollagen type I og fibrin) eller decellularized vev 4 er mye brukt. Sammenlignet med disse teknikkene, er fordelen med SIA evnen til å konstruere stillas med veldefinert arkitektur i en-D-fibre og 2-D ark (figur 3C). For eksempel har vi tidligere vist at kardiomyocytter kan bli seedet på FN nanofibers å danne funksjonelle tilnærmingene av hjertemuskelen 20. Dette viser at de FN nanofibers er cellebinding, og at de kan styre anisotrop montering av celler inn i innrettede vev strukturer. De to-D nanofabrics kan etterligne sammensetningen og laminar strukturen i kjelleren membran for bruk i prosjektering av epitel og endotel vev. Videre utvikler vi nye måter å distribuere disse ECM nanofibers og nanofabrics i 3-D ved å bygge dem innen hydrogel matriser.Fra den prosess som er beskrevet i denne artikkelen, er det mulig å bruke SIA til ingeniør ECM-protein-baserte, nanostrukturerte materialer for en lang rekke anvendelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Økonomisk støtte ble gitt til JMS fra NIH Biomechanics i regenerativ medisin T32 Training Program (2T32EB003392), til QJ fra Dowd-ICES Fellowship og til AWF fra NIH Director er nytt Innovator Award (1DP2HL117750).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm Polysciences 21458-10 40,000 Mw
Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) Dow Corning Mix 10 parts base with 1 part curing agent. 
Butanol
Fibronectin BD biosciences 354008 Human, 1mg
Laminin BD biosciences 354239 Ultrapure, mouse, 1mg
Negative Photoresist Microchem SU8-2015
SU8 Developer Microchem
Sonicator Branson M3510 Branson Ultrasonic Corporation CPN-952-318
Thinky ARE-250 Mixer Thinky Corporation
Spincoater Specialty Coating Systems G3P-8
Glass cover 25mm diameter, No 1.5 Fisher Scientific 12-545-86

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
  2. Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
  3. Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
  4. Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
  5. Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
  6. Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
  7. Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
  8. Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
  9. Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
  10. Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
  11. Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
  12. Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
  13. Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
  14. Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
  15. Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
  16. Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
  17. Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
  18. Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
  19. Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
  20. Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
  21. Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
  22. Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
  23. Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).

Tags

Bioteknologi Nanofibers Nanofabrics ekstracellulære matriks Proteiner Microcontact Printing Fibronectin Laminin Tissue Engineering poly (N-isopropylacrylamide) Surface-Initiert Assembly
ECM Protein Nanofibers og nanostrukturer Engineered Bruke Surface-initiert Assembly
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szymanski, J. M., Jallerat, Q.,… More

Szymanski, J. M., Jallerat, Q., Feinberg, A. W. ECM Protein Nanofibers and Nanostructures Engineered Using Surface-initiated Assembly. J. Vis. Exp. (86), e51176, doi:10.3791/51176 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter