Summary
Um método para obtenção de nanofibras e nanoestruturas de complexos de proteínas de matriz extracelular simples ou múltiplos é descrito. Este método utiliza as interações proteína de superfície para criar materiais à base de proteínas free-standing com composição sintonizável e arquitetura para o uso em uma variedade de aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.
Abstract
A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é sintetizada e montada pelas células para formar um fibrilar 3D, rede com proteína fortemente regulada diâmetro da fibra, da composição e organização. Além de proporcionar um suporte estrutural, as propriedades físicas e químicas do ECM desempenham um papel importante em vários processos celulares, incluindo adesão, diferenciação e apoptose. In vivo, a ECM é montado expondo críptico automontagem locais (fibrilogênese) dentro de proteínas . Este processo varia para diferentes proteínas, mas a fibronectina (FN) fibrilogênese é bem caracterizado, e serve como um sistema modelo para a montagem de ECM mediada por células. Especificamente, as células utilizam receptores de integrina sobre a membrana celular para ligar dímeros de FN e forças contrácteis gerado-actomiosina para desdobrar e expor os locais de ligação para a montagem em fibras insolúveis. Este processo mediado por receptores de células permite montar e organizar o ECM do tecido celular para scales. Aqui, apresentamos um método denominado montagem iniciou-superfície (SIA), que recapitula a montagem da matriz mediada por células usando interações proteína-superfície a se desdobrar proteínas da MEC e montá-las em fibras insolúveis. Primeiro, proteínas da MEC são adsorvidos um polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) superfície onde eles parcialmente desnaturar (desdobrar) e expor domínios de ligação enigmáticas. As proteínas desdobradas em seguida, são transferidos em bem definidas micro e nanopatterns através de impressão em uma microcontacto poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície. Dissolução termicamente acionado do PIPAAm leva à montagem final e liberação de proteínas insolúveis nanofibras ECM e nanoestruturas com geometrias bem definidas. Arquiteturas complexas são possíveis por padrões de engenharia definidos nos selos PDMS utilizados para impressão microcontact. Além disso a FN, o processo de PEI poderá ser usado com laminina, fibrinogénio e colagénios do tipo I e IV para criar multi-componente nanostruc ECMturas. Assim, o SIA pode ser utilizado para manipular os materiais à base de proteínas de ECM com o controlo preciso sobre a composição de proteína, fibra de geometria e arquitectura de andaime, a fim de recapitular a estrutura e composição da MEC in vivo.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) dos tecidos é composta de proteínas multifuncionais envolvidos na regulação física e química de vários processos celulares, incluindo adesão, proliferação, diferenciação e apoptose 1-3. O ECM é sintetizada, montado e organizado pelas células e as fibras de proteína constituintes têm composições únicas, tamanho da fibra, geometrias e arquiteturas interligadas que variam com o tipo de tecido e estágio de desenvolvimento. Trabalhos recentes têm demonstrado que o ECM pode fornecer pistas instrutivas para orientar células para formar tecidos artificiais 4, sugerindo que recapitulando a ECM em termos de composição e estrutura pode permitir o desenvolvimento de materiais biomiméticos para aplicações em engenharia de tecidos e biotecnologia.
Um número de métodos de fabrico têm sido desenvolvidos para manipular andaimes poliméricos que podem imitar aspectos da ECM em tecidos. Por exemplo, eletrofiação e separ faseção têm ambos demonstraram a capacidade para formar matrizes porosas de fibras com diâmetros que variam entre dezenas de micrómetros deslocamento de dezenas de nanómetros de 5-7. Ambas as técnicas têm também mostrado que as matrizes altamente porosas de nanofibras pode suportar a adesão de células e infiltração no andaime 8. No entanto, estas abordagens estão limitadas nas geometrias possíveis orientações de fibra, e 3D arquitecturas que podem ser criados. Electrospinning normalmente produz andaimes com fibras ou orientadas aleatoriamente ou altamente alinhadas ao passo que a separação de fase produz andaimes com fibras orientadas aleatoriamente. Também existem limitações sobre o material, com investigadores tipicamente utilizando polímeros sintéticos, tais como poli (ε-caprolactona) 8 e poli (ácido láctico-co-glicólico), 9, que são posteriormente revestidos com proteínas de ECM para promover a adesão celular. Biopolímeros naturais também são utilizados, incluindo o colágeno tipo I 10, 11 gelatina, fibrinogênio 12,quitosana 13 e 14 de seda, mas representam apenas um pequeno subconjunto das proteínas encontradas no tecido nativo. A maioria dos tecidos contêm um meio maior de proteínas da MEC e polissacarídeos incluindo a fibronectina (FN), laminina (LN), o colagénio tipo IV e ácido hialurónico que são difíceis ou impossíveis de fabricar utilizando nanofibras de métodos já existentes.
Para enfrentar esse desafio, temos focado nossos esforços de pesquisa sobre imitando a forma como as células sintetizar, montar e organizar fibrilas da proteína ECM em seus arredores. Enquanto o processo de fibrilogénese específica varia para diferentes proteínas da MEC, tipicamente uma alteração conformacional na molécula de proteína da MEC é desencadeada por um enzimática ou interacção mediada por receptor, o que expõe locais de auto-montagem crípticos. Aqui usamos FN como um sistema modelo para entender melhor o processo fibrilogênese. Resumidamente, FN homodímeros se ligam a receptores de integrina sobre a superfície celular através da sequência de aminoácidos RGD no 10 tipo IIRepito unidade. Uma vez ligado, as integrinas se afastam via contração actomiosina e desdobrar os dímeros FN para expor sites de auto-montagem enigmáticas. A exposição a estes locais de ligação de NF-FN permite que os dímeros de FN para montar em uma fibrila insolúvel direita na superfície da célula 15. Trabalho em sistemas livres de células demonstrou que os sítios de ligação FN-FN enigmáticas pode ser revelado através de desdobramento usando desnaturantes 16 ou tensão superficial em um ponto sólido-líquido interface de ar 17-19. No entanto, as fibras de FN criada por estas técnicas são restritas para os tamanhos e geometrias de fibras específicas e está tipicamente ligado a uma superfície.
Aqui nós descrevemos um conjunto iniciou-superfície denominado abordagem (SIA) 20, que supera estas limitações, utilizando interações proteína de superfície para criar nanofibras sem pé insolúveis, nanofabrics (folhas 2D) e outras nanoestruturas compostas de proteínas individuais ou múltiplas de ECM (Figura 1 ). Neste process, proteínas da MEC são absorvidos a partir de uma conformação compacta, globular em solução e parcialmente desnaturado (desdobrado) em um, polidimetilsiloxano hidrofóbico (PDMS) selo padronizado. As proteínas são então transferidas ECM neste estado num poli resposta térmica (N-isopropilacrilamida) (PIPAAm) superfície através microcontact impressão 22. Quando hidratado com água de 40 ° C a PIPAAm continua a ser um sólido, mas, quando arrefecida a 32 ° C que passa através de uma temperatura crítica inferior de solução (TCIS), onde ela se torna hidrofílico, incha com água e, em seguida, dissolve-se, libertando as nanoestruturas ECM montados fora de a superfície. O método SIA fornece controle sobre as dimensões com precisão à escala nanométrica. Ao controlar os parâmetros-chave, tais como a composição, a geometria da fibra, e arquitetura, é possível recapitular muitas propriedades da ECM encontradas in vivo e desenvolver suportes avançados para aplicações de engenharia de tecidos e biotecnologia.
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Protocol
1. Fabricação de Molde Mestre usando fotolitografia
- As nanofibras de proteínas ECM, nanofabrics e nanoestruturas a ser fabricados são primeiramente projetados usando software Computer Aided Design (CAD). Este arquivo CAD é então transferido para um photomask. O tipo de fotomáscara dependerá da resolução das características; com um photomask baseada em transparência adequada para o recurso tamanhos até ~ 10 m. Características menores <10 m exigirá um cromo em photomask vidro. Todas as nanofibras e nanoestruturas aqui apresentados foram fabricados usando um photomask baseado em transparência e, portanto, foram à escala nanométrica de espessura, mas não dimensões laterais.
Nota: É importante distinguir quais as regiões da fotomáscara será escuro (luz UV para evitar a passar) e que vai ser transparente (permitir que a luz UV para passar através) como este, juntamente com o tipo de material fotosensitivo (positivo ou negativo) , vai ditar a topografia final do molde mestre. - Para iniciar o fabrico do molde mestre, desidratar uma bolacha 4 "de silício, colocando-o numa placa de aquecimento configurado para 150 ° C durante 15 min.
- Centralize o wafer sobre o chuck vácuo de um spin-coater. Despeje SU8-2015 fotorresistente negativo para o meio da bolacha e continuar vertendo em círculos concêntricos, até cerca de dois terços da bolacha é coberto.
Nota: Manter a garrafa de SU8 perto da bolacha quando vazar para minimizar a formação de bolhas. - Programar a spincoater como se segue:
- Ciclo Spread: 500 rpm com uma aceleração de 100 rpm / s por 10 s.
- Ciclo de centrifugação: 4000 rpm com uma aceleração de 100 rpm / seg para 30 seg.
- Mole cozer a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento configurado a 95 ° C durante 3 min.
- Expor o wafer com luz UV através defotomáscara para uma dose total de 140 mJ / cm 2.
Nota: SU8 é uma fotorresistência negativo, por conseguinte, as regiões onde a luz ultravioleta é capaz de passar através da foto-mascara permanecerá após o desenvolvimento e tornou características levantadas sobre o molde mestre. - Após a exposição cozer a bolacha, colocando-o numa placa de aquecimento configurado a 95 ° C durante 4 min.
- Desenvolver o wafer, colocando-o desenvolvedor SU8 por 3 min. Após 3 min, lavar o wafer com álcool isopropílico. Se uma película branca é produzido durante a lavagem, a pastilha não é totalmente desenvolvido e deve ser colocada de volta no revelador durante mais 30 seg. Enxágüe novamente com álcool isopropílico. Repita esse processo até que uma película branca não formar durante a lavagem álcool isopropílico.
- Seca-se a bolacha em uma corrente de azoto e em lugar de uma placa de petri de 150 milímetros para proteger da poeira.
2. Fazendo as PDMS selos
- Preparar o pré-polímero de PDMS, combinando a base de elastómero e de agente de cura numa10:1 w / w. Tipicamente, 80 g de base e 8 g de agente de cura são utilizados para garantir que há PDMS suficientes para cobrir o molde mestre de uma camada de 1 cm de espessura.
- Misture e degas do PDMS utilizando um misturador centrípeta definido para o seguinte:
- Misturar: 2000 rpm durante 2 min
- Desgaseifica: 2000 rpm durante 2 min.
- Se um misturador está indisponível misturar os PDMS com a mão por 10 min usando uma pipeta de 10 ml sorológica. Desgaseificar a mistura, colocando-o em um exsicador de vácuo durante 30 min para remover as bolhas.
- Despeje suficiente pré-polímero de PDMS sobre o molde mestre (pastilha de silício modelado) para formar uma camada de 1 cm de espessura. Curar o PDMS por cozedura a 65 ° C durante 4 horas ou à temperatura ambiente durante 48 horas.
- Uma vez curada, as regiões que contêm os padrões pode ser cortado para formar os selos PDMS. Para distinguir o lado do recurso na parte de trás do selo PDMS, cortar um entalhe de um dos cantos na parte de trás do selo.
3. Microcontact Printing de padrões de ECM
- Limpo lamelas de vidro 25 mm de diâmetro por sonicação em etanol a 95% durante 1 hora e em seguida seco num forno de 65 ° C.
- Preparar a solução PIPAAm dissolvendo PIPAAm em 1-butanol, a uma concentração de 10% (w / v, tipicamente 1 g em 10 ml).
- Centrar uma lamela de vidro sobre o mandril de vácuo dos spincoater e pipeta 200 uL da solução PIPAAm modo que a superfície de vidro inteiro é coberto.
- Spincoat a lamela a 6.000 rpm durante 1 min.
- Limpar os selos PDMS por sonicação em etanol a 50% durante 30 min e, em seguida, seca sob uma corrente de azoto.
Nota: A secagem e passos subsequentes devem ser realizados numa câmara de biossegurança para manter a esterilidade para aplicações em que as nanoestruturas ECM serão utilizados com células. - Revestir a superfície padronizada de cada selo de PDMS com 200 ul da solução de proteína, tipicamente 50 ug / ml em água destilada estéril para FN. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente.
Nota: Thé o revestimento de volume é um PDMS selo 1,5 cm 2 e terá de ser ajustada, dependendo do tamanho do selo PDMS, a proteína da MEC utilizado e a concentração da proteína na solução de ECM. - Lave os selos PDMS em água destilada para remover o excesso de proteína e seco cuidadosamente sob uma corrente de azoto.
Nota: Qualquer água deixada sobre o selo irá desencadear a dissolução prematura do revestimento PIPAAm na lamela e evitar a transferência de proteína adequada. - Para a fabricação estéril, coloque as lamelas PIPAAm revestidos no interior de uma placa de Petri fechada e esterilizar utilizando a exposição UV, 45 min sob a luz UV em uma cabine de segurança biológica é suficiente. Se a esterilidade não é necessário este passo pode ser omitido.
- Executar impressão microcontact colocando lado a característica do selo PDMS em contato com a lamela PIPAAm-revestido. Se necessário, utilize uma pinça para bater levemente na parte de trás dos selos para remover as bolhas de ar e garantir o contato uniforme.
- Após 5 min, retire o selo PDMS da lamela.
- Nesta fase, as proteínas de ECM adicionais, pode ser modelado para criar estruturas mais complexas e de componentes múltiplos. Até 3 impressões foram verificados para trabalhar com este processo, e muito mais pode ser viável.
4. Lançamento de ECM nanofibras e Nanoestruturas
- Coloque o PIPAAm lamela revestida modelada em um 35 milímetros placa de Petri e fiscalizar a fidelidade padrão usando microscopia de contraste de fase. Dependendo do padrão, uma câmara CCD pode ser necessário, para resolver as características do padrão. A microscopia de fluorescência também pode ser utilizado para inspeccionar o padrão fornecidas as proteínas de ECM são marcadas por fluorescência.
- Adicionar 3 ml de água destilada, 40 ° C para a placa de petri e permite que a água a arrefecer gradualmente.
- A dissolução da camada PIPAAm e a libertação dos padrões de proteínas de ECM podem ser monitorizadas através de microscopia de contraste de fase. Se o aplicativo não permite o uso de tec ópticahniques, a libertação pode ser monitorizado através da medição da temperatura da solução. Tipicamente, a água é arrefecida até à temperatura ambiente, bem abaixo da TCIS de PIPAAm (32 ° C), para assegurar que as nanoestruturas de proteínas de ECM foram libertados.
- Após a liberação, as nanofibras, nanofabrics e outras nanoestruturas estão flutuando na água. Para usá-los para outras aplicações que necessitam para ser manipulado. A abordagem exacta dependerá do objectivo experimental e pode incluir passos tais como a imobilização para outra superfície, movendo-se com um sistema micromanipulador ou incorporação num hidrogel.
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Representative Results
SIA é capaz de ECM engenharia nanofibras de proteínas com um controle preciso sobre as dimensões das fibras. Para demonstrar isto, matrizes de nanofibras FN com dimensões planares de 50 x 20 um foram modelados para uma lamela PIPAAm revestido (Figura 2A). Após a liberação, as fibras contratados porque estavam sob uma pré-estresse inerente ao modeladas na superfície PIPAAm (Figura 2B). Análise das nanofibras FN revelou que foram pré-autorização monodisperso com um comprimento médio de 50,19 ± 0,49 ^ m e largura de 19,98 ± 0,17 mM (Figura 2C). Apesar de contrair sensivelmente, fibras FN pós-lançamento ainda estavam monodispersa com um comprimento médio de 14,15 ± 0,92 mM e largura de 2,65 ± 0,32 mM (Figura 2D). Microscopia de força atómica fornecida uma perspectiva de resolução mais elevada das fibras alteração dimensional associados com o processo de libertação da SIA. Notavelmente, as fibras pré-lançamento teveuma espessura uniforme de ~ 5 nm (Figura 2E), enquanto que as fibras pós-lançamento tinha uma espessura heterogênea da ordem de várias centenas de nanômetros (Figura 2F).
Usando o processo da SIA é possível construir uma variedade de ECM nanoestruturas de proteínas com tamanho ajustável, forma e composição (Figura 3). Por exemplo, nanofibras FN inicialmente 20 mM de largura e 1 cm de comprimento foram modelados para uma lamela PIPAAm-revestido. Após resfriamento e dissolução PIPAAm as nanofibras foram liberados formando fios longos (Figura 3A). Além disso, porque o padrão é definida pela topografia da superfície do selo do PDMS utilizado para impressão microcontact, é possível construir nanoestruturas complexos proteicos ECM. Como prova de conceito, criamos multi-armados estrelas FN que retiveram a sua forma geral após o lançamento (Figura 3B). Curiosamente, os braços da estrela FN contratado como as nanofibras, maso corpo da estrela mantido o seu tamanho. Enquanto FN é importante, também desejado para demonstrar que o SIA funciona com outras proteínas de ECM tais como LN e que várias proteínas de ECM podem ser incorporados na mesma estrutura. Por exemplo, nós projetamos uma nanofabric 2-D composto por nanofibras ortogonais e interligados de FN e LN em uma estrutura matriz quadrada (Figura 3C). Pré-lançamento as nanofibras FN foram 20 m de largura e as nanofibras LN foram 50 mm de largura. Após a liberação os dois tipos de nanofibras contratados, mas a interconectividade global ea estrutura de rede quadrada foi mantida. Estes resultados demonstram que a PEI pode ser utilizado para manipular os materiais de ECM com uma variedade de composições e estruturas.
Instâncias de falha SIA de nanofibras de ECM são mostrados na Figura 4. Uma causa é a libertação inadequada de um padrão incompleto devido à fraca transferência de proteínas de ECM com a superfície durante a impressão PIPAAm microcontact (Figura 4A). A presença de buracos, bordas irregulares, e outros defeitos criará nanofibras e nanoestruturas que são incompletas e propenso a quebra e fragmentação após a libertação. Dissolução rápida de PIPAAm também pode causar má padrão de fidelidade após o lançamento (Figura 4B). Por exemplo, usando a temperatura ambiente de 20 ° C, de água Dl já abaixo da TCIS de PIPAAm em vez de 40 ° C, a água irá causar a PIPAAm a inchar rapidamente e dissolvem-se. Isto pode causar problemas de dois; (I) a rápida expansão pode rasgar algumas nanofibras de ECM e (ii) expansão rápida pode causar o rompimento do arranjo padrão após o lançamento.
Figura 1. Esquemático do processo SIA. (A) Uma bolacha de silício é spincoated com SU8 fotorresistente negativo e exposto a luz UV através de uma fotomáscara. As regiões não expostas são desenvolvidos embora deixando um topograficamente modelada m molde áster. (B) de pré-polímero de PDMS é vertida sobre o molde mestre e curada durante 4 horas a 65 ° C. (C) Após a cura, um selo de PDMS é cortado. (D) O selo é então incubado com uma solução de proteínas de ECM onde as proteínas adsorvidas do carimbo numa conformação parcialmente desdobrado. de (E) O selo é lavado para remover o excesso de proteínas, seco, e colocado em contacto conformada com uma lamela de vidro PIPAAm revestido. (F) O selo é então removida, deixando atrás proteína da MEC modelado na lamela PIPAAm revestido, o padrão é ditada pela topografia do selo. (L) A lamela é então colocado numa placa de Petri e cobertos com água a 40 ° C e em seguida arrefecida abaixo da TCIS de PIPAAm (~ 32 ° C), o que desencadeia a dissolução do PIPAAm ea liberação de montados nanofibras de proteínas de ECM e / ou nanoestruturas a partir da superfície.
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Figura 2. Usando SIA para projetar as populações de nanofibras monodispersos. (A) Uma matriz de retângulos FN, 50 mm de comprimento e 20 mM de largura foram modelados na superfície do PIPAAm. (B) Adição de 40 ° C DI água e posterior resfriamento abaixo da LCST de PIPAAm provocou a dissolução do PIPAAm ea liberação das nanofibras FN. Após a libertação, as fibras contraído que se encontrem sob uma pré-tensão, quando modelado na superfície PIPAAm. (C) Análise de dimensões pré-nanofibras libertação revela as fibras são monodisperso com um comprimento e uma largura de 50,19 ± 0,49 mM e 19,98 ± 0,17 mM, respectivamente. (D) Após a liberação das nanofibras contratado, mas permaneceu monodispersa com comprimento pós-lançamento e largura de 14,15 ± 0,92 mM e 2,65 ± 0,32 mM, respectivamente. (E) AFM mostrou que as nanofibras de pré-lançamentoeram ~ 5 nm de espessura. (F) de AFM de nanofibras de pós de libertação mostraram que a espessura tinha aumentado para várias centenas de nanómetros, enquanto o comprimento e largura diminuída. Barras de escala são: (A) 50 mM e (B) de 10 um.
Figura 3. Usando SIA para engenheiro de nanofibras de proteínas de ECM e nanoestruturas com tamanho ajustável, forma e composição. (A) nanofibras FN foram modelados em uma lamela PIPAAm revestido de 1 cm de comprimento e 20 mM de largura. Libertação térmica resultou na SIA de comprimento, nanofibras FN intacto com uma largura reduzida de ~ 3 m. (B) Um exemplo de uma estrela de FN de braços múltiplos mais complicado, representativa das diversas nanoestruturas que podem ser criados utilizando o SIA. Liberação térmica resultou na contração dos braços, mas não a região central da estrela, onde os braços se uniram. (C) É tambémpossível integrar várias proteínas de ECM na mesma estrutura. Por exemplo, ortogonal, interligados 20 mM linhas largas de FN (vermelho) e 50 mM linhas largas de LN (verde) integrado linhas em um nanofabric 2D foram modelados e, em seguida, liberado. Mesmo após o lançamento, o padrão manteve a sua geometria inicial e interconectividade. As barras de escala são 50 mm.
Figura 4. Exemplos de problemas que podem impedir SIA adequada e liberação de proteínas da superfície do PIPAAm. (A) impressão microcontact Pobres de proteínas da MEC para os resultados PIPAAm em fragmentação e outros defeitos de um m de largura linha FN 20 impede que o SIA de um contínuo FN nanofibras e em vez resulta na formação de vários fragmentos menores. FN (B) de libertação rápida das nanofibras de FN a partir do substrato PIPAAm também pode afectar o arranjo de fibra final. Neste caso, a água de umt 20 ° C, já abaixo da TCIS de PIPAAm, foi adicionado e provocou a dissolução rápida fazendo com que as nanofibras para agarrar para trás, quebrar (30 seg) e formar aleatória, configurações desorganizados (52 seg). As barras de escala são 50 mm.
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Discussion
O método aqui apresentado SIA imita montagem matriz mediada por células e permite que a engenharia de proteínas ECM nanofibras e nanoestruturas com tamanho ajustável, organização e composição. Apesar de não ser idêntico ao ECM gerado pelo celular, SIA cria ECM composta de fibrilas da proteína em nanoescala 20 que sofrem de dobramento reversível / desdobramento durante tensão mecânica 21 e podem ligar células 20. Isto proporciona uma capacidade única para construir materiais proteicos que recapitulam ECM muitas propriedades da ECM encontradas in vivo. Por exemplo, nanofibras de ECM podem ser fabricados em comprimentos específicos com um nível de controle inviável com outras técnicas. Nós demonstramos a capacidade de criar matrizes de nanofibras monodispersos (Figura 2) com controle preciso de comprimento e largura de pré-lançamento (Figura 2C) e pós-lançamento (Figura 2D). Estas nanofibras de ECM podem ser de qualquer comprimento, tal como demonstrado por fabricar FN nanofibras de ~ 1 cm de comprimento (Figura 3A). Em contraste, outras técnicas de fabricação, tais como a separação de fases e de electrospinning podem criar nanofibras, mas não com o controlo preciso do comprimento, produzindo principalmente fibras contínuas. Essas técnicas também são limitados nas geometrias de fibra e organização dentro de um andaime. PEI pode ser utilizado para construir nanoestruturas de ECM com geometria plana arbitrário, tal como uma estrela (Figura 3B), e em folhas de 2-D, com controlo arbitrário de organização das fibras, como por exemplo um nanofabric (Figura 3C). Além disso, outros métodos de fabrico geralmente usam materiais sintéticos ou apenas um número limitado de os naturais, tais como quitosano e fibrina. Em comparação, o SIA permite a montagem de nanofibras e nanoestruturas compostos completamente das proteínas da MEC, como a FN e LN, que não podem ser fabricados com esses outros métodos.
O passo crítico no processo SIA é a liberação termicamente desencadeada a partir de diae PIPAAm superfície. Para garantir a liberação adequada, existem alguns passos fundamentais que devem ser considerados. Em primeiro lugar, após o passo de impressão microcontact, a fidelidade do padrão ECM transferido deve ser inspeccionada, usando microscopia de contraste de fase ou a microscopia de fluorescência (se as proteínas de ECM são fluorescentemente marcado). Se existem quaisquer defeitos no padrão de proteína na superfície do PIPAAm, em seguida, a subsequente libertação produzirá nanoestruturas que contêm estes defeitos (como observado na Figura 4A). Se um selo PDMS produz repetidamente padrões de proteínas com defeitos, é provável que o lado micropadronadas do selo PDMS foi arranhado ou contém defeitos e um novo selo e, potencialmente, um novo molde mestre deve ser feita. Além disso, cuidados devem ser tomados quando hidratação da proteína padronizada, lamela PIPAAm-revestido. A água deve ser igual ou próximo de 40 ° C e deixada a arrefecer lentamente. Se a água não está quente o suficiente ou esfria muito rapidamente, o PIPAAm vai inchar umnd dissolver muito rapidamente fazendo com que as nanofibras de proteínas de ECM e nanoestruturas de ser potencialmente dilacerada das forças e esmo libertado de tal modo que toda a organização estrutural que se assemelha ao estado seco, pré-divulgadas serão perdidos (Figura 4B).
Nanofibras de proteínas ECM, nanoestruturas e nanofabrics montados usando SIA tem muitas aplicações em biomecânica, engenharia de tecidos e biotecnologia. Por exemplo, a evidência recente indica que as propriedades mecânicas das fibras de proteínas de ECM regulam a respectiva funcionalidade biológica 23. SIA é ideal para criar nanofibras de proteínas de ECM em forma purificada para análise mecânica. Para realizar estes experimentos, divulgados nanofibras proteína ECM podem ser manipulados usando microposicionadores de precisão e depois esticado. Deravi et al recentemente usou essa abordagem para demonstrar que nanofibras FN pode suportar até extensões de 8 vezes e que passam por elástico, plástico e ruaregimes com a tensão crescente 21-enrijecimento chuva. Na engenharia de tecidos, proteína da MEC andaimes base sob a forma de geles (por exemplo, colagénio do tipo I e de fibrina) ou tecidos descelularizados 4 são amplamente utilizados. Em comparação com estas técnicas, a vantagem do SIA é a capacidade de engenharia andaimes com arquitectura bem definida em fibras 1-D e 2-D folhas (Figura 3C). Por exemplo, já anteriormente demonstrado que os cardiomiócitos podem ser semeadas em nanofibras de FN para formar fios funcionais do músculo cardíaco 20. Isso mostra que as nanofibras FN é obrigatório celular e que podem dirigir a montagem anisotrópica de células em estruturas de tecidos alinhados. Os nanofabrics 2-D pode imitar a estrutura de composição e laminar da membrana basal para aplicação em engenharia de tecidos epiteliais e endoteliais. Além disso, estamos desenvolvendo novas maneiras de implantar essas nanofibras de ECM e nanofabrics em 3-D, incorporando-os dentro de matrizes de hidrogel.A partir do processo descrito neste artigo, é possível a utilização de PEI para a engenharia de ECM à base de proteínas, materiais nanoestruturados para uma ampla variedade de aplicações.
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Disclosures
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
O apoio financeiro foi fornecido a JMS do NIH em Biomecânica Medicina Regenerativa Programa de Formação de T32 (2T32EB003392), a QJ do Fellowship Dowd-ICES e AWF de New Innovator Award do Diretor NIH (1DP2HL117750).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
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