Summary
Tek veya birden fazla hücre dışı matris proteinleri nanolifler ve karmaşık oluşturulan nano elde etmek için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında çeşitli kullanım için ayarlanabilir kompozisyon ve mimarisi ile serbest duran protein bazlı malzemeleri oluşturmak için protein-yüzey etkileşimlerini kullanır.
Abstract
Dokularda hücre dışı matris (ECM) sentezlenir ve sıkı bir şekilde düzenlenmiş elyaf çapı, kompozisyon ve organizasyonu ile 3D Fibrillar'ı, protein bir şebekenin oluşturulması için hücreler tarafından monte edilir. Yapısal destek sağlamaya ek olarak, ECM'nin fiziksel ve kimyasal özellikleri, yapışma, farklılaşma ve apoptoz dahil olmak üzere çok sayıda hücresel süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. In vivo, ECM proteinleri içindeki şifreli kendini düzeneği (fibrillogenesis) siteleri maruz bırakılması ile monte edilir . Bu işlem, farklı proteinler için değişir, ancak fibronektin (FN) fibrillogenesis iyi karakterize edilmiş ve hücre-aracılı ECM montajı için bir model sistem olarak hizmet vermektedir. Spesifik hücreler, çözünmeyen lifler halinde montaj için bağlanma siteleri açılmak ve ortaya çıkarmak için FN dimerler ve aktomizin oluşturulan kasılma kuvvetleri bağlamak için, hücre zarı üzerinde integrin reseptörleri kullanın. Bu reseptör-aracılı süreç doku SCA için hücresel gelen ECM montajı ve organize hücreleri sağlarles. Burada, biz ECM proteinleri açılmak ve çözünmez liflerin içine monte protein-yüzey etkileşimleri kullanılarak hücre-aracılı matris düzeneğini özetlediği bir yöntem olarak adlandırılan yüzey başlatılan aksamını (SIA), sunuyoruz. İlk olarak, ECM proteinleri kısmen (katlanmış) denatüre ve şifreli bağlayıcı etki ortaya hidrofobik bir polidimetilsiloksan (PDMS) bir yüzey üzerine adsorbe edilir. Katlanmamış proteinler, termal olarak duyarlı poli (N-izopropil) (PIPAAm) yüzey üzerine microcontact baskı yoluyla iyi tanımlanmış mikro ve nanopatterns aktarılır. PIPAAm Termik tetiklenen çözünme nihai montaj ve iyi tanımlanmış geometriye sahip çözünmez ECM protein nanoliflerden ve nano salınmasına yol açar. Karmaşık mimarileri microcontact baskı için kullanılan PDMS pulları mühendislik tanımlı desenleri ile mümkündür. FN ek olarak, SIA işlem laminin, fibrinojen ile birlikte kullanılabilir ve kollajen I ve IV, çok bileşenli ECM nanostruc oluşturmak tiptures. Bu nedenle, in vivo olarak SIA ECM'nin yapısı ve bileşimi özetlemek amacıyla protein bileşimi, lif geometrisi ve iskele yapı üzerinde kesin kontrol ile ECM protein esaslı malzemelerin mühendislik için kullanılabilir.
Introduction
Dokularda hücre dışı matris (ECM) yapışma, çoğalma, farklılaşma ve apoptoz 1-3 de dahil olmak üzere birden fazla hücre süreçlerinin fiziksel ve kimyasal düzenlenmesinde rol oynayan çok işlevli proteinler oluşmaktadır. ECM, sentezlenen monte ve hücreler tarafından düzenlenen ve kurucu protein fibrillerinin doku tipine ve gelişim evresine göre değişkenlik eşsiz kompozisyonlar, lif boyutu, geometri ve birbirine mimarileri var olduğu. Son çalışma ECM bileşimi ve yapısı açısından ECM recapitulating doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamaları için biomimetic malzemelerin geliştirilmesini sağlayabilecek düşündüren, mühendislik dokular 4 oluşturacak hücreleri rehberlik öğretici ipuçları sağlayabilir göstermiştir.
Üretim yöntemleri bir dizi dokuda ECM yönlerini taklit edebilen polimerik yapı iskelesi mühendislik için geliştirilmiştir. Örneğin, elektro ve faz separtirme hem aşağı mikrometre onlarca nanometre 5-7 onlarca arasında değişen çaplarda liflerin gözenekli matrisler oluşturmak için yeteneğini göstermişlerdir. Her iki teknik de nanoliflerden çok gözenekli matrisler, skafoldun 8 içine, hücre yapışmasını ve infiltrasyon destekleyebilir göstermiştir. Ancak, bu yaklaşım oluşturulabilir olası fiber geometrileri, yönelimleri ve 3D mimarileri sınırlıdır. Faz ayrılması rasgele yönelimli liflerden ile yapı iskelesi oluşturur ise Elektrospinning tipik olarak rasgele bir şekilde yerleştirilen veya yüksek oranda hizalanmış ya da elyaf ile iskeleleri üretir. Malzemeler üzerinde sınırlamalar araştırmacılar, tipik haliyle, örneğin poli ardından hücre yapışmasını geliştirmek için ECM proteinleri ile kaplanır (ε-kaprolakton) 8 ve poli (laktik-ko-glikolik asit) 9, olduğu gibi, sentetik polimerler kullanarak, vardır. Doğal biyopolimerler de, kolajen tip I 10, jelatin 11, fibrinojen 12 de dahil olmak üzere, kullanılırçitosan 13 ve 14 ipek, fakat yerli dokusunda bulunan proteinlerin sadece küçük bir alt kümesini temsil etmektedir. En dokular mevcut yöntemlerle nanoliflerini imal etmek zor veya imkansız olan fibronektin (FN), laminin (LN), kollajen tip IV ve hyaluronik asit içeren ECM protein ve polisakaritlerin daha büyük bir ortam içerir.
Bu sorunu çözmek için, hücrelerin birleşmesi ve çevreleri ECM protein fıbriller düzenlemek, sentez yolu taklit bizim araştırma çabalarını odaklanmıştır. Belirli fibrillogenesis süreci farklı ECM proteinleri için değişmekle birlikte, tipik olarak, ECM protein molekülünde yapısal bir değişiklik şifreli montajı çok siteleri ortaya bir enzimatik ya da reseptör aracılı etkileşim tarafından tetiklenir. Burada daha iyi fibrillogenesis süreci anlamak için bir model sistem olarak FN kullanın. Kısaca, FN homodimerleri 10 tip II olarak RGD amino asit dizisi vasıtasıyla hücre yüzeyi üzerindeki integrin alıcıları için bağlananBen birim tekrarlayın. Bir kez bağlı, integrinler aktomizin daralması yoluyla ayrı hareket ve şifreli öz-montaj siteleri maruz FN dimerlerini açılmak. Bu FN-FN bağlanma sitelerinin maruz doğru hücre yüzeyi 15 çözünmeyen bir fibril halinde birleştirmek için FN dimerler sağlar. Hücresiz sistemlerde çalışma şifreli FN-FN bağlanma yerleri, bir hava-sıvı-katı ara 17-19 at denatüranlar 16 ya da yüzey gerilimini kullanan açılımı ile ortaya edilebileceğini göstermiştir. Bununla birlikte, bu teknikler ile oluşturulan FN lifler belli bir lif boyutunda ve geometrileri ile sınırlıdır ve tipik olarak bir yüzey bağlanmıştır.
Burada serbest çözünmez nanoliflerini, nanofabrics (2D yaprak) ve (Şekil 1 tek veya çoklu ECM proteinlerinin oluşan diğer nanoyapıları oluşturmak için protein-yüzey etkileşimleri kullanarak bu kısıtlamaların üstesinden bir yaklaşım olarak adlandırılan yüzey başlatılan aksamını (SIA) 20 tarif .) Bu process, ECM proteinleri çözelti içinde, kompakt, küresel yapıdan adsorbe edildi ve kısmen bir model, hidrofobik polidimetilsiloksan (PDMS) üzerine damgası (katlanmamış) denatüre edilmiştir. ECM sonra proteinler 22 baskı microcontact ile termal duyarlı poli (N-izopropil) (PIPAAm) yüzey üzerine bu durumda transfer edilir. 40 ° C, su ile hidratlanmış zaman PIPAAm sağlam kalır, ancak 32 ° C'ye kadar soğutuldu zaman hidrofilik hale düşük bir kritik çözelti sıcaklığı (LCST) içinden geçer, su ile şişen ve çözünen, kapalı monte ECM oluşturulan nano serbest yüzey. SIA yöntemi nanometre ölçekli hassasiyetle boyutları üzerinde kontrol sağlar. Bu kompozisyon, lif geometrisi ve mimari gibi başlıca parametreleri kontrol olarak, bu in vivo bulunan ECM'nin birçok özellikleri özetlemek için ve doku mühendisliği ve biyoteknoloji uygulamalarında gelişmiş yapı iskelesi geliştirmek mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fotolitografi kullanma Usta Kalıp 1. Fabrikasyon
- ECM protein nanolifler, nanofabrics ve imal edilecek nanoyapılar ilk (CAD) yazılımı Bilgisayar Destekli Tasarım kullanılarak tasarlanmıştır. Bu CAD dosya daha sonra bir photomask aktarılır. Photomask tipi özellikleri çözünürlüğüne bağlı olacaktır; şeffaflığa dayalı bir photomask ile özellik için yeterli ~ 10 mikron aşağı boyutları. Küçük özellikleri 10 mikron cam photomask bir krom gerektirir <. Burada sunulan nanoliflerden ve nanoyapılarda Tüm şeffaflığa dayalı bir fotomaske kullanılarak imal ve böylece kalınlığı nanometre ölçekli ama yanal değildi boyutları edildi.
Not: (geçmesine UV ışığı engellemek) photomask bölgeleri karanlık olacak ayırt etmek önemlidir ve şeffaf olacağı, bu gibi (UV ışığı geçmesine izin verir), Fotorezist türü ile birlikte (pozitif veya negatif) , ana kalıp son topografyasını belirleyecektir. - Ana kalıbın imalat başlamak için, 15 dakika boyunca 150 ° C'ye ayarlanmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirerek, bir 4 "silikon gofret dihidrat.
- Bir spin-kaplayıcı içinde vakum mandreli üzerinde gofret ortalayın. Gofret ortasında üzerine SU8-2015 negatif photoresist'i dökün ve gofret yaklaşık üçte ikisi kaplıdır kadar eş çevrelerinde sağanak devam ediyor.
Not: kabarcık oluşumunu en aza indirmek için dökme işlemi sırasında gofrete SU8 yakın şişe tutun. - Aşağıdaki gibi spincoater Programı:
- Yayılması döngüsü: 10 sn için 100 devir / sn 'lik bir ivme ile 500 rpm.
- Spin döngüsü: 30 sn için 100 devir / sn 'lik bir ivme ile 4,000 rpm.
- Yumuşak 3 dakika boyunca 95 ° C'ye ayarlanmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirerek gofret fırında.
- Boyunca UV ışığı ile gofretin Açığa140 mJ / 2 cm, toplam doz için Işık maskesi.
Not: SU8 negatif fotodirenç bu nedenle UV ışığı photomask geçmesi mümkün bölgeler gelişmekte sonra kalır ve ana kalıp üzerinde yükseltilmiş özellikleri olacak. - 4 dakika boyunca 95 ° C'ye ayarlanmış bir sıcak plaka üzerine yerleştirerek gofretin fırında maruz Gönderin.
- 3 dakika boyunca SU8 geliştirici yerleştirerek gofret geliştirin. 3 dakika sonra, izopropil alkol ile gofret yıkayın. Beyaz film durulanması sırasında üretilen ise, gofret tam olarak gelişmiş değildir ve başka bir 30 saniye için geliştirici geri konulmalıdır. Izopropil alkol ile tekrar durulanır. Bir beyaz film izopropil alkol durulama sırasında meydana gelmez kadar bu işlemi tekrarlayın.
- Tozdan korumak için bir 150 mm petri kabına azot ve yer akımında gofret kurutun.
2.. PDMS Pullar yapma
- Elastomer taban birleştirme ve bir de sertleştirme maddesi ile ön-polimer hazırlamak PDMS10:01 w / w oranına sahiptir. Tipik olarak baz ve sertleştirme maddesi 8 g 80 g bir 1 cm kalınlığında bir tabaka halinde ana kalıp karşılamak için yeterli PDMS olmadığından emin olmak için kullanılır.
- Mix ve şu şekilde ayarlanmış bir merkezcil mikseri kullanarak PDMS degas:
- Karışım: 2 dakika boyunca 2000 rpm
- Degas: 2 dakika süreyle 2000 rpm.
- Bir mikser mevcut değilse, bir 10 mi serolojik bir pipet kullanarak 10 dakika boyunca elle PDMS karıştırın. Baloncukların çıkması için 30 dakika boyunca bir vakumlu desikatör içinde yerleştirerek edilen karışım gaz çıkışına.
- 1 cm kalınlığında bir tabaka oluşturmak üzere ana kalıp (desenli silikon yonga) üzerinden yeterli PDMS prepolimeri dökün. 48 saat süre ile, 4 saat, oda sıcaklığında ya da 65 ° C 'de pişirme ile PDMS Cure.
- Kürünü desenleri içeren bölgeler PDMS pul oluşturmak için kesilebilir. PDMS damga arkasından özelliği tarafı ayırt etmek için, damga ters köşelerinden biri bir çentik kesti.
3.. Microcontact PrECM Patterns inting
- 1 saat ve 65 ° C fırın içinde, daha sonra kuru için% 95 etanol içinde sonikasyon ile temizleyin, 25 mm çapında cam lameller.
- % 10 'lik bir konsantrasyonda (10 ml / h, tipik olarak 1 g) 1-bütanol içinde eritilmesi ile PIPAAm PIPAAm çözelti hazırlayın.
- Tüm cam yüzeyi kaplı, böylece PIPAAm çözeltisinin spincoater ve pipet 200 ul vakum mandreli üzerinde cam bir lamel ortalayın.
- 1 dakika için 6,000 rpm'de lamel Spincoat.
- 30 dakika süre ile bir azot akımı altında, daha sonra kuru için% 50 etanol içinde sonikasyon ile PDMS pul temizleyin.
Not: Kurutma ve daha sonraki adımlar, ECM nano hücreleri ile kullanılacak olan uygulamalar için sterilliği korumak için bir biyo-güvenlik kabini içinde yapılmalıdır. - Coat her bir PDMS desenli yüzey, protein çözeltisinin 200 ul, FN için steril damıtılmış su içinde, genellikle 50 | ig / ml damga. Oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübe edilir.
Not: Thhacim kaplanmasıdır 1.5 cm 2 PDMS damga ve PDMS damga kullanılan ECM protein ve çözelti içindeki ECM protein konsantrasyonunun boyutuna bağlı olarak ayarlanması gerekir. - İyice bir azot akımı altında aşırı protein ve kuru çıkarmak için damıtılmış su içinde PDMS pul yıkayın.
Not: pulu üzerinde bırakılan su lamel PIPAAm kaplamanın erken çözülmesini tetikleyecek ve uygun protein transferini önleyecektir. - Steril imalat için, kapalı bir petri içinde PIPAAm kaplı lamelleri yerleştirin ve bir biyogüvenlik kabini UV maruz kalma, UV ışık altında 45 dakika kullanarak sterilize yeterlidir. Kısırlık gerekli değilse, bu adım ihmal edilebilir.
- PIPAAm kaplı lamel ile temas halinde olan PDMS damgasının özelliği yan yerleştirerek microcontact baskı yapın. Gerekirse, hava kabarcıkları ve düzgün bir temas sağlamak için pul arkasında hafifçe dokunun forseps kullanabilir.
- 5 mil sonran lamel PDMS damga soyulabilir.
- Bu aşamada, ek ECM proteinleri, daha karmaşık ve çok-bileşenli yapılar oluşturmak için desenli olabilir. 3 adede kadar baskılar bu süreç ile çalışmak için doğrulanmış, ve daha uygun olabilir.
ECM nanolifler ve Nanoyapıların 4. Yayın
- Bir 35 mm Petri kabı içerisinde desenli PIPAAm kaplanmış lamel ve faz kontrast mikroskopisi kullanılarak model aslına kontrol edin. Desenin bağlı olarak, bir CCD kamera Desenin özelliklerini çözmek için gerekli olabilir. Flüoresans mikroskobu da ECM proteinleri floresan etiketli sağlanan desen incelemek için kullanılabilir.
- Petri 40 ° C damıtık su ilave edin ve 3 ml su yavaş yavaş soğuk izin verir.
- PIPAAm tabakasının dağılması ile ECM protein desen serbest faz kontrast mikroskopisi kullanılarak izlenebilir. Uygulama optik tec kullanımına izin vermezsehniques, serbest çözelti sıcaklığının ölçülmesi ile izlenebilir. Tipik haliyle, su ECM protein nano yayımlanan sağlamak için, iyi PIPAAm (32 ° C) 'nin LCST'nin altında, oda sıcaklığına kadar soğutulur.
- Serbest bırakıldıktan sonra, nanolifler, nanofabrics ve diğer nano suda yüzen. Kullanmak için başka uygulamalar için manipüle edilmesi gerekir. Tam bir yaklaşım, deney amaç bağlıdır ve bu, başka bir yüzeyi üzerine hareketsiz bir mikromanipülatör sistemi ile hareket eden ya da bir hidrojel içinde gömme olarak adımları içerebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SIA fiber boyutları üzerinde tam kontrolü ile mühendislik ECM protein nanoliflerden yeteneğine sahiptir. Bunu göstermek için, 50 x 20 um boyutlar ile düzlemsel FN nanoliflerden dizileri, PIPAAm kaplı lamel (Şekil 2A) üzerine desenli edilmiştir. PIPAAm yüzey (Şekil 2B) desenli onlar içsel öncesi stres altında oldukları için serbest bırakılması üzerine, lifler sözleşmeli. FN nanoliflerden analizi de 50,19 arasında bir ortalama uzunluğa sahip tek dağılımlı yayın öncesi edildi ortaya ± 19.98 ± 0.17 um ve 0.49 um genişliği (Şekil 2C). Kayda değer müteahhitlik rağmen, FN lifler post-release hala 14,15 ortalama uzunluğu dağılımlı vardı ± 2.65 ± 0.32 mikron (Şekil 2B) 0.92 mikron ve genişliği. Atomik kuvvet mikroskobu SIA bırakma süreci ile ilgili lif boyutlu değişikliklerin daha yüksek çözünürlüklü bir bakış açısı sağlamıştır. Özellikle, lifler ön sürüm vardı~ 5 nm (Şekil 2E) üniform bir kalınlıkta lifler sonrası serbest birkaç yüz nanometre (Şekil 2F) sırasına heterojen kalınlığına sahip olmuştur.
SIA işlem kullanılarak da ayarlanabilir bir boyut, şekil, ve terkip içinde (Şekil 3) ile birlikte ECM protein Nano çeşitli mühendislik mümkündür. Örneğin, ilk olarak FN nanolifler uzunluğunda genişliği 20 mm ve 1 cm bir PIPAAm kaplı lamel üzerine desenli edilmiştir. Soğutma ve PIPAAm çözülme üzerine nanolifler uzun Konuları (Şekil 3A) oluşturan serbest bırakıldı. Model microcontact baskı için kullanılan PDMS pulu yüzey topografisi ile tanımlandığı için Bundan başka, bu kompleks ECM protein oluşturulan nano mühendislik mümkündür. -Kanıtlama kavram olarak, biz serbest (Şekil 3B) sonrasında genel şeklini muhafaza çok silahlı FN yıldızlı yarattı. İlginçtir, FN yıldızın kolları nanoliflerden gibi sözleşmeli amayıldızın vücut boyutunu korumuştur. FN önemli olmakla birlikte, aynı zamanda bu tür SIA LN gibi diğer ECM proteinleri ile ve birden fazla ECM proteinleri aynı yapısına dahil edilebilir çalıştığını göstermek istedik. Örneğin, bir kare kafes dizi (Şekil 3C) olarak FN ve LN dik ve birbirine nanoliflerden oluşan bir 2-B nanofabric mühendislik. Ön serbest FN nanolifler 20 mikron genişliğinde ve LN nanolifler 50 mikron genişliğinde idi. Serbest bırakılması üzerine nanoliflerden iki tip sözleşmeli ama genel birleştiricisi ve kare kafes yapısını korumuştur. Bu sonuçlar, SIA kompozisyonların ve yapıların çeşitli ECM mühendislik malzemeleri için kullanılabileceğini göstermektedir.
ECM nanoliflerden başarısız SIA örnekleri, Şekil 4 'de gösterilmiştir. Bir neden dolayı microcontact baskı (Şekil 4A esnasında PIPAAm yüzeyine ECM protein zayıf transferi için bir eksik Desenin yanlış sürümüdür.) Delikler, düzensiz kenarlı ve diğer kusurların varlığı eksik ve serbest bırakılması üzerine kırılma ve parçalanma eğilimli nanoliflerini ve nanoyapıları yaratacaktır. PIPAAm hızlı çözünme de serbest (Şekil 4B) sonra düşük aslına uygunluk model neden olabilir. Örneğin, daha önce yerine, 40 ° C su içinde PIPAAm LCST'nin altında 20 ° C DI suyun, oda sıcaklığı kullanılarak PIPAAm hızla kabarma ve eritmek için neden olur. Bu iki sorunlara neden olabilir; (I) hızlı genişleme bazı ECM nanoliflerini paramparça edebilir ve (ii) hızlı büyüme yayımlanmasından sonra desen düzenlemenin aksamalara neden olabilir.
Şekil 1. SIA işleminin şematik. (A) silikon gofret SU8 negatif fotorezist ile spincoated ve bir fotomaske ile UV ışığına maruz bırakılır. Sigara maruz kalan bölgeler topografik desenli m bırakarak uzak geliştirilmiştir aster kalıp. (B) ön-polimer PDMS mastar kalıp üzerine dökülmüş ve sertleştikten sonra 65 ° C (C), 4 saat boyunca sertleştirilir, bir PDMS damga kesilir. (D) damga daha sonra bir ECM protein çözeltisi ile inkübe edilir proteinler, kısmen açılmış bir konformasyonda damga adsorbe burada. (E) damga kurutuldu, fazla proteini uzaklaştırmak için durulanmış ve bir PIPAAm kaplamalı cam lamel ile konformal temas halinde yerleştirilir. (F) damga daha sonra geride bırakarak kaldırılır PIPAAm kaplanmış lamel desenli ECM protein, model damganın topografisi tarafından belirlenmektedir. (G) bir örtücü cam, daha sonra, bir Petri tabağı içine yerleştirildi ve 40 ° C su ile kaplandı ve daha sonra PIPAAm (en LCST'nin altında soğutulur ~ 32 PIPAAm çözünmesini ve yüzeyden monte ECM protein nanoliflerden ve / veya nano salınmasını tetikler ° C).
tp_upload/51176/51176fig2.jpg "/>
40 ° C DI suyun ve daha sonra soğutma Şekil 2. Tek dağılımlı nanoliflerden popülasyonlarının mühendis SIA kullanılması. (A) FN dikdörtgenler dizisi, genişliği 50 mm ve uzunluğu 20 um PIPAAm yüzeyi üzerine desenli edilmiştir. (B) Eklenen PIPAAm ve LCST'nin altında PIPAAm çözünmesini ve FN nanoliflerden salınımını tetikledi. PIPAAm yüzeye desenli ne zaman bir ön yük altında olduğu gibi serbest bırakılması üzerine, elyaflar daralmıştır. Nano boyutta (C) analiz öncesi serbest lifler, 50,19 ± 0,49 um'lik bir uzunluk ve genişliğe sahip olan tek dağılımlı ve 19.98 ± 0.17 ortaya koymaktadır sırasıyla um. (D) sırasıyla, serbest bırakılması üzerine nanolifler sözleşmeli ama 14.15 ± 0.92 um sonrası serbest uzunluğu ve genişliği ile tek dağılımlı kaldı ve 2.65 ± 0.32 mm. (E) AFM gösterdi yayım öncesi nanolifler~ 5 nm kalınlığında idi. post-release nanoliflerden (F) AFM uzunluğu ve genişliği azalırken kalınlığı birkaç yüz nanometre arttığını gösterdi. -Ölçek Barlar (A) 50 mikron ve (B) 10 mikron.
Şekil 3,. Ayarlanabilir bir boyut, şekil, ve bileşim ile ECM protein nanolifler ve oluşturulan nano mühendis SIA kullanılması. (A) FN nanolifler uzunluğunda 1 cm genişliğinde ve 20 um gibi bir PIPAAm kaplı lamel üzerine desenli edilmiştir. Termal bırakma ~ 3 mikron azaltılmış genişliği ile uzun, sağlam FN nanoliflerden SIA sonuçlandı. (B) daha karmaşık bir çok silahlı FN yıldızı, SIA kullanılarak oluşturulabilir çeşitli Nanoyapıların temsilcisi bir örnek. Isı salım kolların daralmasına yol açmıştır, ancak kollar biraraya yıldız, merkezi bölgesi. (C) Ayrıca değildiraynı yapı içine çoklu ECM proteinleri entegre etmek mümkündür. Örneğin, ortogonal, FN (kırmızı) birbirine 20 mikron genişliğinde hatları ve LN (yeşil) 50 mikron genişliğinde çizgiler 2D nanofabric entegre hatları desenli ve daha sonra serbest bırakıldı. Hatta yayımlanmasından sonra, desen onun ilk geometri ve birleştiricisi korudu. Ölçek çubukları 50 mikron.
PIPAAm parçalanma sonuçlara ve 20 mikron genişliğinde FN hattın diğer kusurların üzerine ECM proteinleri Şekil 4. PIPAAm yüzeyinden uygun SIA ve protein salınımını engelleyecek sorunların örnekleri. (A) Kötü microcontact baskı, sürekli SIA önler yerine FN nano ve birçok küçük FN fragmanları. (B) hızla PIPAAm substrattan FN nanoliflerini serbest aynı zamanda nihai fiber düzeneği etkileyebilir oluşumuyla sonuçlanır. Bu durumda su a'dat 20 ° C, zaten PIPAAm ve LCST'nin altında, ilave ve nanolifler, snap back kırmak (30 sn) ve rasgele, örgütsüz konfigürasyonları (52 sn) oluşmasına neden hızla erimesini tetikledi. Ölçek çubukları 50 mikron.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
SIA yöntem Burada taklit hücre-aracılı matriks aksamını sunulmaktadır ve ayarlanabilir boyut, organizasyon ve kompozisyon ile ECM protein nanoliflerden ve nano mühendislik sağlar. Hücre tarafından üretilen ECM özdeş olmasa da, SIA, mekanik gerilme sırasında açılımı 21 / geri katlama geçmesi ve hücreler 20 bağlanabilir, nano ölçekli protein fibrillerinin 20 oluşmaktadır ECM oluşturur. Bu, in vivo bulunan ECM birçok özellikleri özetlemek ECM protein malzemeleri oluşturmak için eşsiz bir yeteneği sağlar. Örneğin, ECM nanolifler diğer tekniklerle mümkün olmayan bir kontrol düzeyi ile, belirli uzunluklarda imal edilebilir. Biz monodisperse nanoliflerden dizileri uzunluğu hassas kontrolü ve genişlik ön-sürüm (Şekil 2C) ve post-sürüm (Şekil 2B) (Şekil 2) oluşturma yeteneğini göstermek. FN nano imal edilmesi ile gösterildiği gibi bu ECM nanolifler, herhangi bir uzunlukta olabilir~ 1 cm uzunlukta (Şekil 3A), içinde bulunan elyafın. Bunun aksine, bu tür Elektrospinning ve faz ayrılması gibi diğer üretim teknikleri çoğunlukla sürekli elyafın üretilmesi, uzunluğunun tam kontrolü ile nanoliflerini oluşturabilir, ancak olamaz. Bu teknikler ayrıca bir iskele içinde elyaf geometrileri ve organizasyon sınırlıdır. SIA bir yıldız (Şekil 3B) ve rasgele düzlemsel geometri, ECM ile oluşturulan nano oluşturmak için kullanılabilir ve böyle bir nanofabric (Şekil 3C) ve lif organizasyon rasgele kontrolü ile 2-B tabakalar, in. Bundan başka, başka üretim yöntemleri, genellikle, sentetik malzeme veya kitosan ve fibrin gibi doğal olanlar, sadece sınırlı sayıda kullanın. Buna karşılık, SIA gibi bu yöntemlerle imal edilemez FN ve LN gibi ECM proteinlerinin tam olarak oluşan nanoliflerden ve Nano montajını sağlar.
SIA sürecinde kritik adım th termik tetiklenen sürümüdüre PIPAAm yüzey. Uygun bir şekilde bırakılmasını sağlamak için, dikkat edilmesi gereken birkaç önemli adım vardır. İlk olarak, microcontact baskı adımından sonra, transfer ECM desenin aslına (ECM proteinleri floresan etiketli ise) ya da faz kontrast mikroskopisi veya floresan mikroskobu kullanılarak kontrol edilmelidir. PIPAAm yüzeyi üzerinde protein desen herhangi bir hata varsa, daha sonra takip eden serbest bırakma (Şekil 4A'da görüldüğü gibi), bu kusurlar içeren oluşturulan nano üretecektir. PDMS damga defalarca kusurları ile protein kalıpları üretir, bu PDMS damga micropatterned tarafı çizik veya kusur ve yeni damgası içeren ve potansiyel yeni bir master kalıp yapılmalıdır edilmiş olması muhtemeldir. Desenli protein, PIPAAm kaplı lamel nemlendirici Buna ek olarak, dikkat edilmesi gerekir. Su 40 ° C ya da yakın olmalıdır ve yavaş yavaş soğumaya bırakıldı edilebilir. Su yeterince sıcak değildir ya da çok hızlı bir şekilde soğuduğu takdirde, PIPAAm şişecek olan birnd çok çabuk çözülür ECM protein nanolifler ve nanoyapılar potansiyel kuru, önceden yayımlanan devlet benzeyen herhangi bir yapısal organizasyon kayıp olacağı gibi (Şekil 4B) yayımlanan ayrı kuvvetler ve gelişigüzel yırtılmış neden olur.
ECM protein nanolifler, nano ve SIA kullanılarak monte nanofabrics biyomekanik, doku mühendisliği ve biyoteknoloji birçok uygulama var. Örneğin, son kanıtlar ECM protein fibrillerinin mekanik özellikleri, biyolojik özelliğe 23 tabi olduğunu göstermektedir. SIA ideal mekanik analiz için saflaştırılmış bir formda da ECM protein nanoliflerini oluşturmak için uygundur. Bu deneyler gerçekleştirmek için, serbest ECM protein nanolifler hassas micropositioners kullanılarak manipüle ve sonra gergin olabilir. Deravi ark geçenlerde FN nanolifler elastik, plastik geçmesi ve st 8 kat uzantıları kadar dayanabilir ve bu olduğunu göstermek için bu yaklaşımı kullanmışyağmur sertleşme artan gerginlik 21 rejimleri. Doku mühendisliği, ECM protein jeller biçiminde (örneğin, kolajen tip I ve fibrin) veya hücresizleştirilmiş doku 4 yaygın olarak kullanılan in iskele göre. Bu teknikler ile karşılaştırıldığında, SIA avantajı, 1-B ve 2 elyaf-D yaprak (Şekil 3C) iyi tanımlanmış mimarisi ile mühendislik iskele yeteneğidir. Örneğin, daha önce kardiyomiyositlerde kalp kasının 20 fonksiyonel ipliklerini oluşturmak için FN nanoliflerden üzerine tohumlanabilir göstermiştir. Bu FN nanolifler hücre bağlayıcı ve hizalanmış doku yapılarına hücrelerinin anizotropik montaj doğrudan olduğunu olduğunu göstermektedir. 2-D nanofabrics epitelyal ve endotelyal dokuların mühendisliği uygulama için bazal membran kompozisyonu ve lamine yapısı taklit edebilir. Ayrıca, biz hidrojel matrislerin içinde onları gömme 3-D bu ECM nanoliflerini ve nanofabrics dağıtmak için yeni yollar geliştiriyoruz.Bu makalede açıklanan sürecinden, bu geniş bir uygulama çeşitli ECM protein bazlı, nano yapılı malzeme mühendis SIA kullanmak mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Mali destek NIH Müdürü Yeni Yenilikçi Ödülü (1DP2HL117750) den Dowd-ICES Bursu QJ ve AWF için, Rejeneratif Tıp T32 Eğitim Programı (2T32EB003392) olarak NIH Biyomekanik gelen JMS sağlanmıştır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Poly(N-isopropylacrylamide) / PIPAAm | Polysciences | 21458-10 | 40,000 Mw |
| Sylgard 184 Silicone kit (PDMS) | Dow Corning | Mix 10 parts base with 1 part curing agent. | |
| Butanol | |||
| Fibronectin | BD biosciences | 354008 | Human, 1mg |
| Laminin | BD biosciences | 354239 | Ultrapure, mouse, 1mg |
| Negative Photoresist | Microchem | SU8-2015 | |
| SU8 Developer | Microchem | ||
| Sonicator Branson M3510 | Branson Ultrasonic Corporation | CPN-952-318 | |
| Thinky ARE-250 Mixer | Thinky Corporation | ||
| Spincoater | Specialty Coating Systems | G3P-8 | |
| Glass cover 25mm diameter, No 1.5 | Fisher Scientific | 12-545-86 |
References
- Geiger, B., Bershadsky, A., Pankov, R., Yamada, K. M. Transmembrane crosstalk between the extracellular matrix and the cytoskeleton. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 793-805 (2001).
- Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. Matrix Elasticity Directs Stem Cell Lineage Specification. Cell. 126, 677-689 (2006).
- Discher, D. E., Janmey, P., Wang, Y. -l Tissue Cells Feel and Respond to the Stiffness of Their Substrate. Science. 310, 1139-1143 (2005).
- Ott, H. C., et al. Perfusion-decellularized matrix: using nature's platform to engineer a bioartificial heart. Nat Med. 14, 213-221 (2008).
- Teo, W. E., Ramakrishna, S. A review on electrospinning design and nanofibre assemblies. Nanotechnology. 17, (2006).
- Reneker, D. H., Chun, I. Nanometre diameter fibres of polymer, produced by electrospinning. Nanotechnology. 7, 216-21 (1996).
- Ma, P. X., Zhang, R. Synthetic nano-scale fibrous extracellular matrix. Journal of Biomedical Materials Research. 46, 60-72 (1999).
- Yoshimoto, H., Shin, Y. M., Terai, H., Vacanti, J. P. A biodegradable nanofiber scaffold by electrospinning and its potential for bone tissue engineering. Biomaterials. 24, 2077-2082 (2003).
- Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. Electrospun nanofibrous structure: a novel scaffold for tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research. 60, 613-621 (2002).
- Matthews, J. A., Wnek, G. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Collagen Nanofibers. Biomacromolecules. 3, 232-238 (2002).
- Huang, Z. -M., Zhang, Y. Z., Ramakrishna, S., Lim, C. T. Electrospinning and mechanical characterization of gelatin nanofibers. Polymer. 45, 5361-5368 (2004).
- Wnek, G. E., Carr, M. E., Simpson, D. G., Bowlin, G. L. Electrospinning of Nanofiber Fibrinogen Structures. Nano Letters. 3, 213-216 (2002).
- Bhattarai, N., Edmondson, D., Veiseh, O., Matsen, F. A., Zhang, M. Electrospun chitosan-based nanofibers and their cellular compatibility. Biomaterials. 26, 6176-6184 (2005).
- Jin, H. -J., Chen, J., Karageorgiou, V., Altman, G. H., Kaplan, D. L. Human bone marrow stromal cell responses on electrospun silk fibroin mats. Biomaterials. 25, 1039-1047 (2004).
- Wierzbicka-Patynowski, I., Schwarzbauer, J. E. The ins and outs of fibronectin matrix assembly. Journal of Cell Science. 116, 3269-3276 (2003).
- Mosher, D. F., Johnson, R. B. In vitro formation of disulfide-bonded fibronectin multimers. Journal of Biological Chemistry. 258, 6595-6601 (1983).
- Little, W. C., Smith, M. L., Ebneter, U., Vogel, V. Assay to mechanically tune and optically probe fibrillar fibronectin conformations from fully relaxed to breakage. Matrix Biology. 27, 451-461 (2008).
- Ulmer, J., Geiger, B., Spatz, J. P. Force-induced fibronectin fibrillogenesis in vitro. Soft Matter. 4, 1998-2007 (2008).
- Klotzsch, E., et al. Fibronectin forms the most extensible biological fibers displaying switchable force-exposed cryptic binding sites. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. , (2009).
- Feinberg, A. W., Parker, K. K. Surface-Initiated Assembly of Protein Nanofabrics. Nano Letters. 10, 2184-2191 (2010).
- Deravi, L. F., et al. Differential Contributions of Conformation Extension and Domain Unfolding to Properties of Fibronectin Nanotextiles. Nano Letters. 12, 5587-5592 (2012).
- Shen, K., Qi, J., Kam, L. C. Microcontact Printing of Proteins for Cell Biology. J Vis Exp. , 1065 (2008).
- Vogel, V. Mechanotransduction Involving Multimodular Proteins: Converting Force into Biochemical Signals. Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure. 35, 459-488 (2006).
