Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

عزل مزدوج السلبية خلايا T αβ من الكلى

Published: May 16, 2014 doi: 10.3791/51192
Automatic Translation
1, 2, 2, 1
1Department of Pathology, Johns Hopkins University School of Medicine, 2Department of Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine

ERRATUM NOTICE

Summary

خلايا DNabT نادرة بين خلايا T الطرفية؛ ومع ذلك، فهي وفيرة في بعض الأنسجة اللمفاوية غير. صعوبة عزل خلايا T DN من الأنسجة اللمفاوية غير يعيق تحليلاتهم الفنية على الرغم من تزايد الاعتراف بأهمية الفسيولوجية المرضية. نحن تصف الرواية بروتوكول لعزل خلايا T DN العالية النقاء من الكلى الفئران.

Abstract

لا يوجد حاليا أي بروتوكول قياسي لعزل خلايا T DN من الأنسجة اللمفاوية غير على الرغم من مشاركتهم ذكرت على نحو متزايد في مختلف الاستجابات المناعية. خلايا T DN هي نوع من الخلايا المناعية الفريدة التي تورطت في تنظيم الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية والتسامح لallotransplants 1-6. خلايا T DN، ولكن، نادر في الدم المحيطي والأجهزة اللمفاوية الثانوية (الطحال والغدد الليمفاوية)، ولكن هم من سكان كبرى في الكلى طبيعية. القليل جدا هو المعروف عن وظيفتها الفسيولوجية المرضية 7 بسبب ندرة في الهامش. وصفنا مؤخرا تحليلا المظهري وظيفية شاملة لهذه الفئة من السكان في الكلى 8 في حالة مستقرة وخلال نقص التروية إصابة ضخه. تحليل DN T وظيفة الخلية سوف تتعزز بشكل كبير عن طريق وضع بروتوكول لعزلتهم من الكلى.

هنا، نحن تصف بروتوكول الرواية التي يسمح isolatioن من أساسها CD4 + CD8 + T خلايا نقي للغاية وخلايا T DN من الكلى الفئران. لفترة وجيزة، ونحن هضم أنسجة الكلى باستخدام كولاجيناز وعزل الخلايا وحيدات النوى الكلى (KMNC) من خلال الكثافة التدرج. ويتبع هذا من قبل اثنين من الخطوات لإثراء خلايا T المكونة للدم من 3٪ إلى 70٪ من KMNC. تتكون الخطوة الأولى من مجموعة مختارة إيجابية من الخلايا المكونة للدم باستخدام CD45 + عدة عزلة. في الخطوة الثانية، يتم عزل الخلايا T DN سلبا عن طريق إزالة الخلايا غير المرغوب باستخدام CD4، CD8، وMHC الدرجة الثانية الاجسام المضادة وCD1d α-galcer tetramer. هذه الاستراتيجية يؤدي إلى عدد سكانها أكثر من 90٪ نقية خلايا T DN. يستخدم تلطيخ السطح مع الأضداد المذكورة أعلاه يليها تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتأكيد نقاء.

Introduction

الطرفية αβTCR + CD3 + CD4 - CD8 - المزدوج السلبية وتنقسم الخلايا (DN) T إلى مجموعات فرعية مختلفة الظواهر التي تمتلك وظائف متميزة 1-4. فهم خلايا T DN سيئة ولكن على نحو متزايد بالتورط في الاستجابات المناعية المرضية في جسم المريض في نماذج الأمراض المختلفة 4-6.

خلايا T DN هي نوع من الخلايا المناعية الفريد الذي تورط على نحو متزايد في تنظيم مختلف الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية والتشكيل التسامح allotransplant. 4-6، 9 فهي نادرة في الدم المحيطي والأجهزة اللمفاوية الثانوية (الطحال والغدد الليمفاوية ). ومع ذلك، فهي سكان كبرى من الكلى والأمعاء الطبيعي الظهارة 10-12. القليل جدا هو المعروف عن وظيفتها 7 في الكلى في حالة مستقرة وتحت الظروف المرضية مثل إصابة الكلى الحاد (آكي) المرتبطة transpl الكلىالنمل.

بسبب أدوار معقدة من الخلايا المناعية المختلفة في تنظيم الاستجابات المناعية بما في ذلك alloresponses، وتحديد دور كل لاعب هو حاسم في فهم alloresponses وتصميم علاجات جديدة. نظرا لأعداد كبيرة من الخلايا T DN الحاضر في ظل ظروف مرض الكلى والفسيولوجية المختلفة، من المرجح أن تلعب دورا حاسما في تنظيم الاستجابات المناعية والمناعة الذاتية في الفئران والبشر، وalloresponses في متلقي زرع خلايا T DN. على الرغم من تراكم الأدلة لا تزال متناثرة تورط خلايا T DN في كل المهام المسببة للأمراض والمثبطة للمناعة ولكن من المفهوم لماذا وكيف يعرضون وظيفة الضارة أو قمعية محددة وكيف يؤثر على البيئة لهم انها سيئة.

بسبب وفرة منخفضة في الكلى، وطرق تحسين العزلة ضرورية.

لا يوجد حاليا أي بروتوكول قياسي لعزل خلايا T من DN رانه الأنسجة اللمفاوية غير. يصف بروتوكول لدينا طريقة جديدة لعزل خلايا T DN من الكلى؛ ومع ذلك، يمكن أيضا أن تستخدم أسلوب لمختلف الأنسجة اللمفاوية غير.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد أدوات والثقافة وسائل الإعلام والكواشف

  1. الأدوات: إعداد الكواشف تحت ظروف معقمة واستخدام تحت غطاء تدفق الصفحي.
  2. تحضير 1 لتر من RPMI زراعة الأنسجة المتوسطة، إضافة 5٪ من مصل بقري جنيني، 2.1 غرام من بيكربونات، 10 مل الغلوتامات 100X، 10 ملغ من HEPES، 1 ملغ البيروفات الصوديوم و 10 مل من 100X البنسلين / الستربتوميسين.
    ملاحظة: الموصى بها الأنسجة مستنبت، RPMI، يرادف DMEM.
  3. إعداد 5٪ كولاجيناز "D" الحل (5 مل من كولاجيناز "D" إلى 9 مل من زراعة الأنسجة متوسطة).
  4. جعل الحل Percoll في ثلاثة تركيزات مختلفة: 100٪، 80٪ و 40٪. يتم حساب التركيزات التالية: 1 العينة. الحفاظ على حلول في درجة حرارة الغرفة.
    1. الحل Percoll: إضافة 9 مل من مخفف Percoll (من محلول المخزون)؛ إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 10X.
    2. الحل Percoll: إضافة 8 مل من Percoll 100٪؛ إضافة 2 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
    3. الحل Percoll:إضافة 4 مل من Percoll 80٪؛ إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني 1X.
  5. جعل 1 L من الخلايا مضان تنشيط الفرز (FACS) العازلة؛ إضافة 5 مل 10٪ BSA (0.1٪ BSA)، 1 مل 10٪ أزيد الصوديوم (0.1٪)، 2 مل EDTA وكيل، وجعل ما يصل إلى 1،000 مل مع برنامج تلفزيوني 1X.

2. إعداد الكلى الهضم

  1. بعد أن حصلت أي موافقة المؤسسية اللازمة، تضحية ويستنزف الفئران مع الأساليب القياسية واللوائح الحالية في أعقاب المبادئ التوجيهية ورعاية الحيوان.
    1. تخدير الفأر مع بنتوباربيتال (0.07 ملغ / كلغ).
    2. انتقل إلى استنزاف.
    3. ضع الماوس في موقف ضعيف على طاولة الجراحة.
    4. رش منطقة البطن مع الايثانول 70٪.
  2. إضافة 10 مل من كولاجيناز D الحل على طبق بيتري.
  3. إزالة وdecapsulate كلا الكليتين من كل فأر.
    1. فتح تجويف abdomimal من خلال جعل شق خط الوسط من خلال الجلد في البطن والصفاق من القص لالعانة.
    2. فضح الكلية اليسرى عن طريق تحريك الأمعاء أفقيا إلى الجانب.
    3. فصل بعناية الكبسولة غادر مع ملقط.
      ملاحظة: يظهر كبسولة باعتبارها طبقة شفافة المحيطة الكلى ومغطاة جزئيا الأنسجة الدهنية حول الكلية.
    4. إزالة الكلية اليسرى عن طريق خفض السفن عنيق باستخدام مقص جراحي.
    5. كرر نفس الإجراء في الكلى اليمنى.
      ملاحظة: الكلية اليمنى أكثر الجمجمة وأقرب إلى خط الوسط (pedicels هي أقصر).
  4. وضع الكلى في طبق بتري.
  5. قطع نسيج الكلى الى قطع صغيرة (1-2 ملم في البعد) باستخدام شفرة لتشكيل المعادن العادية ووضع القطع في حل كولاجيناز لمدة 30-45 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية (الشكل 1).

3. إعداد خلايا الكلى وحيدات النوى (KMNC) من الهضم الكلى

  1. الحصول على تعليق خلية في الكلىالهضم عن طريق تعطيل ميكانيكيا الأنسجة باستخدام مصفاة (70 ميكرون) و resuspend في 25 مل من زراعة الأنسجة المتوسطة والمزيج.
  2. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية لتكوير تعليق الخلية.
  3. إعادة تعليق بيليه في 4 مل من 40٪ Percoll حل وبلطف تراكب على 4 مل من 80٪ Percoll حل مع ماصة نقل البلاستيك، ببطء شديد وبعناية. وهذا يؤدي إلى مرحلتين يفصل بوضوح من خلال طبقة شفافة. على الجزء العلوي سوف يكون طبقة صفراء المقابلة لنسبة الدهون.
  4. أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع أجهزة الطرد المركزي في الفرامل تشغيل الوضع.
  5. إزالة بواسطة طموح الطبقة العليا الأصفر وسميكة (حوالي 1-2 مل).
  6. جمع فقط طبقة شفافة بيضاء طفيف من واجهة من مرحلتين مع ماصة نقل. نقل بعناية جدا هذا التعليق في أنبوب 15 مل المخروطية التي تحتوي على 2 مل من زراعة الأنسجة المتوسطة ثم قم بإضافة 13 مل من المتوسط ​​لجعل الحجم الكلي لل15 مل.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. resuspend والعينات في 1 مل من المتوسط.
  9. حساب عدد KMNC باستخدام الاستبعاد التريبان الأزرق على عدادة الكريات والتعبير عن النتائج على النحو أعداد KMNC لكل مل في الكلى.
  10. يغسل مرة واحدة على النحو الوارد أعلاه.

4. عزل المكونة للدم (CD45 +) الخلايا من KMNC (الخطوة الأولى)

  1. resuspend الخلايا تصل إلى 10 7 في 90 ميكرولتر من العازلة على التوالي.
  2. إضافة 10 ميكرولتر من بلي CD45 واحتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  3. إضافة 1 مل من المخزن المؤقت تشغيل لوقف رد الفعل. أجهزة الطرد المركزي في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية وresuspend في 500 ميكرولتر من العازلة على التوالي.
  4. إعداد العمود المغناطيسي عن طريق وضع في المغناطيس وشطف مع 3 مل من العازلة على التوالي.
  5. تمرير تعليق الخلية من خلال العمود المغناطيسي وجمع الخلايا غير المسماة التي تمر عبر العمود.
  6. غسل الخلايا ثلاث مرات مع 3 مل من runnالعازلة جي. ثم جمع النفايات السائلة.
  7. إزالة عمود من الفاصل وماصة 5 مل من العازلة على التوالي على الأعمدة وطرد جزء المسمى فورا. هذا جزء يحتوي على CD45 + الخلايا. عد الخلايا.
  8. لحساب العدد المطلق للخلايا T مجموعات فرعية مختلفة في الكلى مضاعفة العدد الإجمالي للKMNC من النسبة المئوية للخلايا إيجابية يحددها التدفق الخلوي (الشكل 2).

5. عزل DN T خلية CD45 + من إعداد حسب التحديد السلبية (الخطوة الثانية)

  1. إضافة 2.5 ميكرولتر (0.5 ملغ / مل، 1.25 ميكروغرام) من كل من الأجسام المضادة البيروكسيديز التالية: مكافحة CD4، ومكافحة CD8، ومكافحة التيسير مستقبلات (CD16/32)، ومكافحة MHC من الدرجة الثانية (IA ب)، ومكافحة CD1d PBS-57 tetramer لكل 10 خلايا المكونة للدم 7.
  2. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في غرفة باردة.
  3. إضافة 1 مل بلي مكافحة البيوتين.
  4. احتضان لمدة 30 دقيقة في غرفة باردة.
  5. وضع أنبوب في رانه مغناطيس، والشروع في استنزاف.
  6. عد خلايا قابلة للحياة لتحديد العدد الكلي للخلايا T DN في جزء السلبية باستخدام عدادة الكريات.
  7. تحقق النقاء من الخلايا T DN مع التدفق الخلوي عن طريق اتباع هذه الاستراتيجية النابضة: أول بوابة CD45 +، البوابة الثانية TCRαβ +. استبعاد CD1d + الخلايا. مؤامرة CD4 + CD8 + مقابل لتحديد الخلايا DN T (الشكل 3).
  8. مضاعفة العدد الإجمالي بالنسبة المئوية المحددة في النقاء.
    ملاحظة: استخدام هذه النتائج في بروتوكول يبلغ عدد سكانها أكثر من 90٪ نقية خلايا T DN.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

النوع البري C57BL / 6 (B6) الكلى يحتوي على حوالي 1،5-2،1 × 10 6 خلايا وحيدات النوى في الكلى. حوالي أقل من 10٪ هي المكونة للدم CD45 + الخلايا. لإعداد الخلايا وحيدات النوى الكلى (KMNC)، يتم قطع الكلى الى قطع صغيرة كما هو مبين في الشكل 1 متبوعا الهضم باستخدام 5٪ كولاجيناز.

ويعقب ذلك إجراء التدرج الكثافة الطرد المركزي لجمع KMNC طبقة (الشكل 2، اللوحة اليسرى). KMNC ثم تعرضوا لاختيار إيجابية باستخدام CD45 + بلي المغناطيسي كما هو موضح في القسم 4 (STEP I). خلايا العمود المنضم ثم تم مزال وتحليلها لCD45 + من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. هذه النتائج في إثراء CD45 + الخلايا لحوالي 80 إلى 95٪ كما تحليلها من قبل التدفق الخلوي (الشكل 2، لوحة المتوسطة). بين CD45 + الخلايا المكونة للدم المخصب، كان حوالي 40-60٪ αβ TCR + (لا تظهر البيانات)، حوالي 3كانت 0-60٪ خلايا T DN (الشكل 2، اللوحة اليمنى).

الخطوة النهائية المشاركة إخضاع CD45 + خلايا التخصيب لاختيار السلبية لتسمية وإزالة CD4 +، CD8 +، MHC الدرجة الثانية + + وCD16/32 الخلايا باستخدام MABS محددة البيوتين وبلي مكافحة البيوتين والأعمدة المغناطيسي. هذه النتيجة في العالية النقاء (90-95٪) خلايا T DN (الشكل 3). بعد هذا البروتوكول كان من الممكن الحصول على ما يصل إلى 0.5 × 10 6 لدم CD45 + الخلايا المسمى مغناطيسيا في الماوس (اثنان الكلى).

الشكل 1
الشكل 1. إعداد الكلى لعملية الهضم مع 5٪ من محلول كولاجيناز. يتم قطع الكلى الماوس الى قطع صغيرة من 1-2 ملم وضعت في كولاجيناز D الحل 5٪ لمدة 30 دقيقة لحفرestion. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
. الرقم 2 استراتيجية لإثراء CD45 + الخلايا المكونة للدم من الكلى من الزمن:. CD45 تلطيخ الكلى MNC قبل التخصيب باستخدام CD45 + عدة عن طريق الانتقاء الإيجابي المركز: CD45 تلطيخ الكلى MNC بعد التخصيب باستخدام CD45 + عدة عن طريق الانتقاء الإيجابي الحق.: CD4 CD8 والملف الشخصى αβTCR + خلايا CD45 + بين بوابات الخلايا مجموعات فرعية مختلفة من الخلايا التائية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا فايجوري.

الرقم 3
. الرقم 3 الطهارة من الخلايا T DN معزولة من الزمن:. CD45 تلطيخ الكلى معزولة DN الخلايا التائية عن طريق الانتقاء السلبي المركز:. TCRαβ تلطيخ الكلى معزولة DN الخلايا التائية عن طريق الانتقاء السلبي اليمين: CD4 CD8 وتلطيخ بين خلايا T DN معزولة من قبل اختيار سلبية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 4
الرقم 4. الخلايا اللمفاوية في الكلى قبل التنقية. اليمين:. تلطيخ CD45 في أنسجة الكلى قبل تنقية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك اهتمام متزايد في خلايا T DN لأنها تورطه في ظروف مرضية مختلفة مثل اضطرابات المناعة الذاتية والسرطان والكسب غير المشروع والتسامح، وأمراض الكلى الأولية بما في ذلك إصابة الكلى الحاد (آكي)، التهاب كبيبات الكلى 8، 13. وبالتالي، هناك حاجة إلى فهم أفضل وتوصيف الوظائف الفسيولوجية المرضية للخلايا T DN. ولكن، حاليا هناك نقص في فهم وظيفة هذه الخلايا بالمقارنة مع CD4 والخلايا التائية CD8. وهناك سبب رئيسي هو قلة خلايا T DN في الأجهزة اللمفاوية الثانوية وصعوبة في الحصول على خلايا كافية للتحليل في المختبر والتجارب وبالتالي نقل بالتبني. وتقع خلايا T DN بالدرجة الأولى في الأنسجة اللمفاوية غير مثل الكلى 8 لكن عدم وجود وسائل موثوق بها لعزلتهم من الأعضاء الصلبة والتي تعوق الجهود الرامية إلى تحقيق وظيفتها. لذلك، لدينا بروتوكول رواية لعزل الخلايا التائية DNومن المتوقع أن تعجل البحوث في وظيفة الخلايا T و DN من الكلى. خلايا T DN تتراكم في الغدد الليمفاوية بأعداد كبيرة في فاس ناقصة (LPR) أو فصل المقال ناقص (GLD) الفئران وأنها يمكن أن تكون معزولة بسهولة من الأجهزة اللمفاوية 9، 14، 15، لكنه لا يزال تحديا لعزل هذه الخلايا عن غيرها من الأنسجة.

وفقا لهذا البروتوكول، والكليتين من اثنين من الفئران تسفر حوالي 0.5 × 10 6 خلايا المكونة للدم (CD45 +) ونحو 0.2 × 10 6 خلايا T DN. هذا العدد يكفي لأداء في الثقافة المختبر، المقايسات الفنية و / أو تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية. يجب تأكيد نقاء السكان الخلية DN T بواسطة التدفق الخلوي. يوفر هذا البروتوكول يبلغ عدد سكانها خلايا T DN التي يمكن أن تكون نقية مثل 98٪. في حين تم تصميم هذا البروتوكول لعزل خلايا T DN من الكلى، فإنه يمكن تعديلها لعزل خلايا T عن غيرها من الأجهزة غير اللمفاوية مثل كما القلب والغدة الدرقية الخ

منذ خلايا T DN تمثل عدد صغير من السكان، فمن الضروري في بعض الأحيان لزيادة الغلة عن طريق إجراء جولات إضافية لتنقية. ولكن إذا كنت بحاجة لعدد أكبر من الخلايا T DN (أعلى من 0.5 × 10 6 خلايا) نوصي أداء الفرز الفصل في أجل تقليل الوقت والتكلفة كاشف.

باختصار، يصف هذا البروتوكول طريقة جديدة لعزل خلايا T DN من الكلى. وتتكون من مستحضر (عن طريق الهضم وإثراء KMNC) الخطوة تليها اختيار الإيجابية والسلبية ثم اختيار لاستنزاف السكان الخلايا غير المرغوبة. وبالتالي، هناك الحد الأدنى من التلاعب المباشر للخلايا T DN أثناء عملية العزل. من الجدير بالذكر أن هناك البروتوكولات القائمة لعزل خلايا T DN من الدم المحيطي لدى الفئران والبشر ومن الأجهزة اللمفاوية الثانوية، مماثلة لتلك المستخدمة لعزل خلايا T التقليدية.

ove_content "> لأنه قد ثبت أن بعض الخلايا DN-T التعبير عن FCR γ، وهو خيار بديل هو عدم إدراج CD16/32 + في كوكتيل 16، 17. العزلة الناجحة من الخلايا T DN يتطلب اهتماما كبيرا بالتفاصيل. حاسمة بشكل خاص وتشمل الخطوات التالية: الهضم الأنسجة، وقطع من النسيج الكلوي إلى قطع صغيرة، وتحديد بشكل صحيح وجمع طبقة خفيفة في التدرج الكثافة عموما، ويلزم عدة جولات من الممارسة وبعض البراعة اليدوية لتحقيق النتيجة المرجوة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة في برنامج تلفزيوني (R21 AI095484). نشكر NHI مرفق الأساسية tetramer لCD1d tetramer.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Laminar flow hood  Baker Company, Inc Or equivalent equipment 
Centrifuge Beckman Coulter Or equivalent equipment 
Hemocytometer Electron Microscopy Sciences 63514-11
Atmosphere-controlled incubator Fisher Scientific  (37 °C with 5% CO2)
Analytical flow cytometer LSR II
RPMI 1640 Media Tech 10-040-CV
Collagenase D Roche 11088858001
Percoll  GE Healthcare 17-0891-01
Fetal bovine serum  Corning Cellgro 35-011-CV
0.1% sodium azide (NaN3) Sigma-Aldrich S2002
Buffer phosphate buffered saline (PBS) Corning Cellgro 21-040-CV
PBS 10x Mediatech 46-013-CM
EDTA buffer  Sigma-Aldrich E1161
LS columns  MiltenyiBiotec 130-042-401
CD45+ microbeads MiltenyiBiotec 6.78E-51
Biotin microbeads  MiltenyiBiotec 130-090-485
anti-CD45 (clone: 30-F11)  PerCP  eBioscience G1397
anti-CD45 (clone: 30-F11)  APC-Cy7 Biolegend 103116
anti-TCR Pacific Blue  (ab-chain, clone: H57-597) Invitrogen HM3628
anti-CD4 PE eBioscience 12-0043
anti-CD8 FITC eBioscience 8011-0087
anti-CD4 biotinylated (GK1.5) BD 553728
anti-CD8 biotinylated  (clone 53-6.7) BD 553029
anti-MHC class II (I-A b) biotinylated BD 553609
AutoMACS Running Buffer - MACS Separation Buffer  MIlteny I Biotec 130-091-221
C57BL/6J mice Jackson Labs 000664 Kidneys - Lymph Nodes
Petri dish  BD Biosciences 356517
70 μm filter  Fisher Scientific 22363548
Plunger  Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 50 ml Bioexpress C-3394-3 Or equivalent equipment 
GeneMate Tubes 15 ml Bioexpress C-3394-1 Or equivalent equipment 
CD1d α-galcer tetramer NHI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, Z. X., Yang, L., Young, K. J., DuTemple, B., Zhang, L. Identification of a previously unknown antigen-specific regulatory T cell and its mechanism of suppression. Nat Med. 6, 782-789 (2000).
  2. Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, Z., Ohashi, P. S., Zhang, L. The immune regulatory function of lymphoproliferative double negative T cells in vitro and in vivo. J Exp Med. 196, 261-267 (2002).
  3. Ford McIntyre, M. S., Young, K. J., Gao, J., Joe, B., Zhang, L. Cutting edge: in vivo trogocytosis as a mechanism of double negative regulatory T cell-mediated antigen-specific suppression. J Immunol. 181, 2271-2275 (2008).
  4. Young, K. J., Yang, L., Phillips, M. J., Zhang, L. Donor-lymphocyte infusion induces transplantation tolerance by activating systemic and graft-infiltrating double-negative regulatory T cells. Blood. 100, 3408-3414 (2002).
  5. Chen, W., Ford, M. S., Young, K. J., Zhang, L. Infusion of in vitro-generated DN T regulatory cells induces permanent cardiac allograft survival in mice. Transplant Proc. 35, 2479-2480 (2003).
  6. Young, K. J., DuTemple, B., Phillips, M. J., Zhang, L. Inhibition of graft-versus-host disease by double-negative regulatory T cells. J Immunol. 171, 134-141 (2003).
  7. Mohamood, A. S., et al. Gld mutation of Fas ligand increases the frequency and up-regulates cell survival genes in CD25+CD4+ TR cells. Int Immunol. 18, 1265-1277 (2006).
  8. Ascon, D. B., et al. Normal mouse kidneys contain activated and CD3+CD4- CD8- double-negative T lymphocytes with a distinct TCR repertoire. J Leukoc Biol. 84, 1400-1409 (2008).
  9. Hamad, A. R., et al. B220+ double-negative T cells suppress polyclonal T cell activation by a Fas-independent mechanism that involves inhibition of IL-2 production. J Immunol. 171, 2421-2426 (2003).
  10. Rabb, H., et al. Pathophysiological role of T lymphocytes in renal ischemia-reperfusion injury in mice. Am J Physiol-Renal. 279, 525-531 (2000).
  11. Burne, M. J., et al. Identification of the CD4(+) T cell as a major pathogenic factor in ischemic acute renal failure. J Clin Invest. 108, 1283-1290 (2001).
  12. Yokota, N., Daniels, F., Crosson, J., Rabb, H. Protective effect of T cell depletion in murine renal ischemia-reperfusion injury. Transplantation. 74, 759-763 (2002).
  13. Crispin, J. C., et al. Expanded double negative T cells in patients with systemic lupus erythematosus produce IL-17 and infiltrate the kidneys. J Immunol. 181, 8761-8766 (2008).
  14. Igarashi, S., Takiguchi, M., Kariyone, A., Kano, K. Phenotypic and functional analyses on T-cell subsets in lymph nodes of MRL/Mp-lpr/lpr mice. Int Arch Allergy Appl Immunol. 86, 249-255 (1988).
  15. Dowdell, K. C., et al. Somatic FAS mutations are common in patients with genetically undefined autoimmune lymphoproliferative syndrome. Blood. 115, 5164-5169 (2010).
  16. Juvet, S. C., et al. FcRgamma promotes T cell apoptosis in Fas-deficient mice. J Autoimmun. 42, 80-93 (2013).
  17. Thomson, C. W., et al. FcR gamma presence in TCR complex of double-negative T cells is critical for their regulatory function. J Immunol. 177, 2250-2257 (2006).

Tags

علم المناعة، العدد 87، سلبي مزدوج (DN) αβ، وخلايا T، CD45 + T العزلة الخلية، والخلايا الليمفاوية الكلى والأنسجة غير اللمفاوية، الخلايا التائية تنقية، نقص التروية إعادة إشباع الخلايا الإصابات، إصابات الكلى الحادة، الأنسجة المقيم الخلايا اللمفاوية، اضطرابات التكاثرية اللمفية، الذئبة الحمامية

Erratum

Formal Correction: Erratum: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney
Posted by JoVE Editors on 02/10/2016. Citeable Link.

A correction was made to: Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney.

There was an error with an author's name. The author's given name had a typo, this was corrected to:

Samatha Bandapelle

instead of:

Samantha Bandapelle

عزل مزدوج السلبية خلايا T αβ من الكلى
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martina, M. N., Bandapalle, S.,… More

Martina, M. N., Bandapalle, S., Rabb, H., Hamad, A. R. Isolation of Double Negative αβ T Cells from the Kidney. J. Vis. Exp. (87), e51192, doi:10.3791/51192 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter