تمتد خلايا Micropatterned على غشاء PDMS

Summary

يقدم هذا المخطوط تقنية لتطبيق أو إطلاق القوات على الخلايا أو الأنسجة الملتصقة باستخدام أحادي الاتجاه تمتد.

Abstract

القوى الميكانيكية المبذولة على الخلايا و / أو الأنسجة تلعب دورا رئيسيا في عمليات عديدة. قمنا بتطوير جهاز لتمتد الخلايا مطلي على PolyDiMethylSiloxane (PDMS) الغشاء، متوافقة مع التصوير. هذا الأسلوب هو استنساخه وتنوعا. يمكن micropatterned الغشاء PDMS من أجل حصر الخلايا أو الأنسجة لهندسة محددة. فإن الخطوة الأولى هي لطباعة micropatterns على الغشاء PDMS مع تقنية الأشعة فوق البنفسجية العميقة. الغشاء PDMS ثم يتم تركيبه على محفة الميكانيكية. A غرفة لا بد على رأس الغشاء مع الشحوم حيويا للسماح مزلق أثناء التمدد. هي المصنفة الخلايا ويسمح لنشر لعدة ساعات على micropatterns. يمكن أن تمتد العينة وغير المتمدد عدة مرات مع استخدام المسمار المصغر. يستغرق أقل من دقيقة لتطبيق تمتد إلى أقصى مداها (حوالي 30٪). لا تتضمن هذه التقنية المعروضة هنا جهاز بمحركات، وهو أمر ضروري لpplying دورات تمتد المتكررة بسرعة و / أو الكمبيوتر التي تسيطر عليها وتمتد، ولكن هذا يمكن تنفيذها. تمتد من الخلايا أو الأنسجة يمكن أن تكون ذات فائدة للأسئلة المتعلقة القوات الخلية، استجابة الخلية لإجهاد ميكانيكي أو التشكل الأنسجة. وهذا عرض فيديو تظهر كيفية تجنب المشاكل النموذجية التي قد تنشأ عند القيام هذا النوع من التجربة التي تبدو بسيطة.

Introduction

الخلايا تتكون الأنسجة في الكائنات العليا تخضع لتوترات الميكانيكية وقوات تمتد القادمة سواء من البيئة الخارجية أو من الخلايا المحيطة ^1،2. الخلايا يجب أن تتكيف مع ومقاومة هذه القوى من أجل الحفاظ على سلامة الأنسجة. هذه القوات مهمة للأنسجة التشكل خلال ^3،4 التنمية. تطبيق القوى الميكانيكية على الخلايا المستزرعة هو وسيلة لمحاكاة ما يمكن أن يحدث في الأنسجة، ولكن مع مراقبة كمية ومستقلة عن شكل الخلية وتشوه الخلايا ^5،6. لهذا، يمكن استخدام عدة تقنيات. يمكن للمرء أن تضغط على الخلايا (خلية كاملة أو جزء منه)، على سبيل المثال باستخدام AFM أو مشتقات ^7،8 أو تمتد الركيزة الخلايا تنمو على.

الطريقة الموضحة في هذه الورقة يوضح كيفية تمتد ركيزة الطائرة مطلي مع الخلايا. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل لتقييم دور القوات التي تمارس على مخلايا الثدييات itotic ^9. الخلايا الإنقسامية البقاء على اتصال من خلال الركيزة الألياف التراجع وتمتد الغشاء تمارس القوة على تلك الألياف، والتي أثارت بدورها دوران المغزل الإنقسامية. مصلحة الجمع بين micropatterns لاصقة وتمتد هو تحقيق مراقبة مستقلة من القوات وشكل الخلايا الفردية. فمن الممكن على سبيل المثال أن تمتد خلية بيضوي الشكل في شكل دائري تماما الخواص، في حين يتم تطبيق تمتد ذو محورين. إذا لم يتم platted الخلايا على micropatterns، ذو محورين تمتد النتائج في استطالة الخلية، مع معظم الخلايا وجود محور طويل تتماشى مع محور التمدد. ومن ثم من الصعب فصل أثر محاذاة المحور الطويل وتأثير امتداد تطبيقها على الخلايا.

الجهاز هو مناسبة لأي التصوير الخلية الحية، بما في ذلك وقت طويل مضي فلوري المجهر، والمخدرات يمكن أن تضاف أثناء التجربة. طريقة UVs وmicropatterning عميق ¹⁰وقد وصفت بالتفصيل في Azioune وآخرون وصفت ¹¹ الزخرفة على PDMS في Azioune وآخرون ¹² الحاضر تمتد البروتوكول هو نسخة من الفيديو كاربي وآخرون ¹³

Protocol

1. التخميل من PDMS

1. قطع قطعة من PDMS حوالي 35 ملم × 20 ملم من ورقة قدمت قبل (على سبيل المثال، GelPak، كما هو موضح في الجدول المواد).
2. إزالة الجزء العلوي والسفلي من طبقات واقية من البلاستيك (إذا لزم الأمر) واستخدام ملاقط لوضع PDMS في البلاستيك (وليس الثقافة الخلية المعالجة) طبق بيتري.
3. غسل PDMS مع الايثانول 70٪ لمدة 5 دقائق على محور دوار في 30 التذبذبات / دقيقة.
4. يجف السطح بواسطة الهواء المتدفقة على ذلك.
5. تضيء مع الأشعة فوق البنفسجية العميقة (λ = 180 نانومتر) لمدة 5 دقائق على مسافة من المصابيح فوق البنفسجية من حوالي 5 سم (انظر ورقة مواد مرجعية مصباح، وسوف تختلف المعلمات للمصابيح مختلفة).
6. إعداد 200 ميكرولتر من الحل EDC / NHS لكل PDMS قطعة (هذا يجب أن يكون مستعدا تماما قبل الاستخدام لأن التفاعل من الحل يضمحل في غضون ساعة). ل1 مل من 0.05 M MES + 0.5 M كلوريد الصوديوم العازلة في درجة الحموضة 6.0، إضافة 11.5 ملغ من سلفو-NHS و 19.2 ملغ من EDC.
7. نقلPDMS صحائف من طبق بيتري إلى غطاء طبق بتري، الذي لم مضيئة. وهذا يضمن أن محيط PDMS هي مسعور جدا وتسهيل الخطوة التالية.
8. إضافة الحل EDC / NHS واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
9. شطف EDC / NHS بالماء.
10. إضافة PLL-G-PEG حل (0.5 ملغ / مل في HEPES 10 ملي درجة الحموضة 8.6)، واحتضان بين عشية وضحاها من 3 إلى ساعة في درجة حرارة الغرفة.
11. شطف PLL-G-PEG بالماء. PDMS تخميلها (بين functionalized مع PLL-G-PEG) يمكن تخزينها لعدة أيام في 4 درجات مئوية.

2. الزخرفة من PDMS

1. تأخذ ورقة PDMS ووضعه على الضوئية الكوارتز الاصطناعية التي تحمل microfeatures عن الزخرفة (انظر الشكل 1). وضع الجانب PDMS تحمل PLL-G-PEG التي تواجه الجانب الكروم من الضوئية.
2. تضيء لمدة 7 دقائق عن طريق الضوئية على مسافة من المصابيح فوق البنفسجية من حوالي 5 سم.
3. إضافة الماء على قناع + PDMS وقشر PDMS ببطء بعيدا عن قناع.
4. احتضان مع الحل فبرونيكتين في 50 ملغ / مل في المنطقة العازلة HEPES في درجة الحموضة 8.6 لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. فمن الممكن استخدام البروتينات ECM الآخرين، ولكن هذه لم يتم اختبارها مع هذا البروتوكول.
5. شطف مع برنامج تلفزيوني.

3. تركيب جهاز

1. تحميل PDMS تخميلها سابقا على الجهاز تمتد (انظر مناقشة لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها).
   1. إرفاق جانب واحد من PDMS إلى جزء ثابت من نقالة.
   2. إصلاح الجانب الآخر إلى الجزء المتحرك من دون تحامل نقالة الكثير من ورقة PDMS.
2. قطع مستطيل من PDMS (22 ملم × 19 ملم) في PDMS طعنة سميكة وقطع مستطيل آخر داخل من أجل الحصول على بركة (أو الإطار) التي من شأنها الإبقاء على الخلايا وسائل الإعلام (انظر الشكل 2).
3. إضافة سيليكون الشحوم تحت هذا PDMS بركة ووضعه على رأس ورقة PDMS لإنشاء ميدالبوتاسيوم الاحتفاظ بركة. فإن الشحوم تسمح مزلق من تجمع أكثر من ورقة PDMS أثناء التمدد.

4. الزخرفة خلايا

1. فصل الخلايا من 50٪ confluency الثقافة قارورة مع Versene.
2. عد الخلايا و resuspend لهم بتركيز 200،000 خلية / مل.
3. إضافة 1 مل من تعليق خلية في بركة (انظر مناقشة للحصول على تفاصيل إضافية).
4. السماح للخلايا ربط أنماط 10-30 دقيقة (اعتمادا على نوع من الخلايا، RPE-1 الخلايا سوف يستغرق 10 دقيقة وخلايا هيلا 20 دقيقة).
5. بلطف تدفق الخلايا العائمة مع معايرتها المتوسطة (المتوسطة تتوازن في حاضنة).
6. السماح للخلايا تنتشر لساعة قليلة على أنماط (RPE-1 سوف تحتاج ما لا يقل عن 2 ساعة؛ خلايا هيلا سوف تحتاج 3 ساعة).
7. إضافة ساترة على رأس تجمع لتجنب تسرب التبخر والمتوسطة في حال وقوع PDMS.
8. وضع الجهاز على مجهر مقلوب وبدء التصوير. تجنب استخدام الغمر النفط أوبjectives لأنها سوف لا تعمل بسبب مشاكل التركيز.

5. تمديد

1. بدوره المسمار المصغر حين تصحيح الموقف في المرحلة س، ص، ض، ومحور (أساسا خ). موقف المرحلة يحتاج إلى تصحيح لمواجهة اتساع PDMS وفقدان التركيز. (انظر "خلال تمتد" الفقرة في المناقشة).

Representative Results

تقنية الواردة في هذا البروتوكول الفيديو يسمح تطبيق القوات على التراجع من ألياف خلايا الثدييات الإنقسامية. في الواقع، أثناء انقسام الخلية، في مرحلة الإنقسامية، خلايا الثدييات تتراجع لتأخذ شكل كرة وتترك وراءها الكابلات أكتين رقيقة تحيط بها غشاء التي تعلق على الركيزة. هذه الكابلات (ألياف التراجع)، هي ذكرى هندسة الخلية قبل الخوض في الانقسام. جعل micropatterns مع الأشعة فوق البنفسجية العميقة من خلال الضوئية على PDMS رقيقة (الشكل 1) يسمح للسيطرة هندسية من التصاق الخلية. التي تمتد الركيزة في بداية الطورية، تم سحب بعض من هذه الألياف التراجع بعيدا عن جسم الخلية، مما أدى إلى القوات الميكانيكية المطبقة على القشرة الخلية الإنقسامية في (الشكل 3). عرضت هذه القوى على الحكم اتجاه محور الدوران ^9.

جوري 1 "لل: محتوى العرض =" 6in "FO: SRC =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "سرك =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "العرض =" 600px ل"/>
الشكل 1. الكوارتز الاصطناعية الضوئية تحمل micropatterns الميزات.   A) الضوئية النموذجية المستخدمة في الزخرفة الأشعة فوق البنفسجية العميقة. فمن 10 سم × 10 سم قناع ثنائي والميزات هي عادة من حوالي 20 ميكرون واسع لتنميط خلية واحدة، مع قرار submicron. الساحات مرئية بالعين المجردة هي حجم 10X حقل المجهر موضوعيا. يظهر تضخم الميزات المقابلة لأنماط خلية واحدة (هنا أسطوانة). الميزات هي شفافة السماح UVs وعميقة بالمرور. B) يتم تطبيق PDMS على الضوئية مع تجنب بعناية تشكيل فقاعات. الجانب PDMS تخمل على اتصال مع الجانب المعدني للالضوئية. سيتم طباعة micropatterns جميع أنحاء PDMS.g1highres.jpg "الهدف =" _blank "> اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.

الشكل 2. حوض السباحة.   يتم تطبيقها على ورقة PDMS بركة PDMS. الشحوم تغطي محيط الجزء السفلي من حوض السباحة. قدرة تجمع حوالي 2 مل من وسائل الإعلام. يتم ملء حوض السباحة مع الثقافة المتوسطة (هنا يظهر الماء مع فلوريسئين باللون الأصفر). لتجنب التبخر، ساترة ويمكن أن يضاف على القمة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

A) قبل التمدد. هو مطلي الخلية على نمط البيضاوي. لتحقيق هذا، ويتم الزخرفة PDMS مع الضغوط التي تواجهها خلال الانطباع أنماط الجولة من خلال الضوئية. ويستخدم الضوئية موزعة (قطعة من القناع هو حوالي 1.5 سم وقطرها). لتجنب الانهيار قناع، استخدم نمط البيضاوي على الضوئية وطباعته على ورقة PDMS غير المتمدد. B) بعد التمدد. ويمتد الركيزة مثل يصبح نمط دائرة. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Discussion

على الرغم من أن هذه التقنية قد استخدمت عدة مرات ويتم اختبارها بدقة، وهناك العديد من الخطوات الحاسمة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل التجربة.

حول PDMS:

لهذا العمل، GelPak، ورقة PDMS رقيقة متوفرة تجاريا، استخدمت. بدلا من ذلك ورقة PDMS يمكن أن يلقي مباشرة من PDMS المزيج. ونحن نوصي باستخدام GelPak لأنه أكثر استنساخه، وأقل عرضة للكسر مقارنة PDMS العرف.

حول الجهاز:

الجهاز تمتد المستخدمة في هذا البروتوكول وقد تم تصميم "في البيت"، ولكن يمكن للمرء أيضا تطبيق هذه التقنية micropatterning على نقالات المتاحة تجاريا مثل فليكسسيل. خيارات حسب الطلب هي أكثر تنوعا وأرخص كثيرا.

تركيب الجهاز:

في تصاعد للPDMS يمكن أن يؤدي إلى كسر. كما أنه من السهل إلى عكس ذلك وليس هناك طريقة لمعرفة الجانب الذي هوالذي. إذا فرضت PDMS كثيرا، ويصبح أقصر وهذا يمكن أن يؤدي إلى كسر (مثل التوتر سوف تكون أكبر لنفس مسافة تمتد). تأكد من أن يتم شد البراغي جيدا أو أن ورقة PDMS تنزلق في أقرب وقت يبدأ التمدد أو في وقت لاحق أثناء التجربة.

إضافة الخلايا:

لفصل الخلايا من الركيزة ثقافة، فمن الأفضل استخدام EDTA 0.02٪ في برنامج تلفزيوني بدلا من التربسين. وسوف تسمح باستخدام EDTA إعادة الربط أسرع من الخلايا على الأنماط. عند إضافة خلايا إلى PDMS، فإنها يجب أن تكون مفصولة عن بعضها البعض بشكل جيد من أجل الحصول على خلايا فردية ملزمة للنمط. مرة واحدة هم في التعليق، ماصة لهم عدة مرات مع 200 ميكرولتر غيض، وهذا سوف تفريق المجاميع. ويجب أن يضاف حوالي 200،000 الخلايا على سطح 4 سم ² من أجل أن يكون ملزما لكل نمط. استخدام وحدة تخزين صغيرة وبالتالي فإن الخلايا تسقط بسرعة على السطح. إذا لم تكن هناك خلايا كافية، مستظل أي أنماط فارغة. يجب أن يتم مسح الخلايا غير المرفقة بها إزالة وسائل الإعلام بأسرع ما يكفي من الخلايا لا بد أن الأنماط. الوقت قبل دافق يمكن أن تختلف بين أنواع الخلايا ولكن 15 دقيقة بشكل عام بما فيه الكفاية للخلايا أن تبدأ المترتبة على الأنماط. إذا ترك الخلايا لنعلق لفترة طويلة جدا، وسوف المحتلة أنماط بنسبة 2 أو أكثر من الخلايا. يوصف هذه الخطوة في ^13.

خلال امتداد:

كن حذرا، في حين تمتد، لتجنب فقدان الموقف في المنطقة من الفائدة. في الواقع، خلال تمتد، فإن PDMS تصبح على نطاق أوسع، وموقف المرحلة يحتاج إلى إعادة تعديل للتعويض. مزيج من التوتر الجهاز وبرامج التحكم بمحركات المرحلة يمكن تطويرها لتعويض تلقائيا لهذا الغرض ^14. نقالة بسيطة وتنوعا دليل المقدمة هنا يمكن ترقيتها إلى تحقيق مثل هذا التعويض الآلي.

بو PDMSرأ يمكن أن تسرب إذا لم توضع الشحوم السيليكون بشكل صحيح في جميع أنحاء السطح. تأكد من اغلاق الإعداد بشكل صحيح عن طريق وضع برنامج تلفزيوني من الداخل ويراقب عن أي تسرب قبل خلايا الطلاء على ذلك.

لدينا نقالة يسمح تمتد من حوالي 30٪، ولكن نقالات مصممة خصيصا قد تسمح للحصول على درجة أعلى من التمدد. كن حذرا كما وارتفاع الضغط، وارتفاع هو خطر PDMS طبقة الانهيار.

القيود:

واحدة من القيود الرئيسية في تقنية المعروضة هنا هو عدم وجود السهل التلقائي تمتد / destretching باستخدام السيارات. ومع ذلك، فمن الممكن للتكيف على المحرك بدلا من المصغر المسمار اليدوي. هذا التنفيذ، إلى جانب وجود برمجة معينة من السيطرة المجهر يمكن أن تسمح بالتعويض عن عينة النزوح أثناء التمدد.

عيب آخر هو صعوبة وجود ارتفاع القرار التصوير، لأن استخدام الغمر أهداف النفط فيتقوم بإعداد الحركات الركيزة لينة عندما يتحرك الهدف بسرعة كبيرة. هذا يمكن حلها باستخدام الماء (ولكن بعد ذلك التبخر هي قضية لإجراء التجارب على المدى الطويل) أو زيت مائع جدا.

تعديلات والتطبيقات المستقبلية:

بالتعاون مع Yanlan ماو ونيك Tapon من معهد أبحاث السرطان (لندن، المملكة المتحدة)، وضعنا نسخة أخرى من نقالة والذي يسمح طبقتين من PDMS على رأس كل منهما الآخر، مع عينة يجري في الوسط، من أجل قرصة وتمتد الأنسجة كله.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141