在硅橡胶膜拉伸微图案细胞

Summary

这个手稿提出了一种技术，使用单向拉伸应用或释放力对粘附细胞或组织中。

Abstract

的机械力作用在细胞和/或组织在许多过程中发挥着重要作用。我们已经开发出一种装置以拉伸细胞接种于聚二甲基硅氧烷（PDMS）膜，具有成像相容。这种技术是可重复的和通用性。将PDMS膜可微图案以限制细胞或组织到一个特定的几何形状。第一步是打印微图案上的PDMS膜用深紫外光的技术。将PDMS膜，然后装上一个机械担架。一室势必与生物相容性脂膜，使拉伸过程中滑翔的顶部。将细胞接种，并使其分散进行数小时的微图案。样品可以被拉伸和未拉伸多次与使用测微螺旋的。这需要不到一分钟的拉伸应用于其完整程度（约30％）。这里提出的技术并不包括机动设备，这是必需的快速和/或计算机控制的拉伸pplying反复伸展周期，但是这是可以实现的。拉伸的细胞或组织，感兴趣的可以用于与细胞的力量，细胞响应机械应力和组织形态发生的问题。此视频演示将展示如何避免可能出现的时候做这一类的看似简单的实验典型问题。

Introduction

在高等生物组成一个组织中的细胞受到机械张力和拉伸力无论是从外部环境还是从周围细胞^1,2到来。细胞必须适应并以维持组织的完整性抵御这些力量。这种力量也是在开发^3,4组织形态发生重要。在培养的细胞施加机械力是一种能够模仿一个组织可能会发生什么，但细胞形态和细胞变形^5,6的定量和独立控制。为此，一些技术可能被使用。人们可以对细胞按（整个细胞或它的一部分），例如，使用原子力显微镜或衍生物^7,8或伸展细胞生长在衬底上。

本文描述的方法演示了如何伸展镀细胞平面基板。在m该技术最初被开发，评估力量的作用发挥itotic哺乳动物细胞^9。有丝分裂细胞保持连接到所述衬底通过回缩纤维和拉伸的膜施加的力上的那些纤维，这反过来又引起有丝分裂纺锤体的旋转。结合粘合微图案和伸展的利益，是实现部队和单个细胞的形状的独立控制。它例如可伸展的卵形细胞变成完全各向同性的圆形形状，而单轴拉伸被施加。如果该细胞不制地图上微图案，单轴拉伸导致细胞的伸长，与具有长轴线与拉伸轴一致大多数细胞。它是那么难以分离的长轴对准和施加到所述单元的伸展的效果的效果。

该装置适用于任何活细胞成像，包括长的时间推移的荧光显微镜和药物可在实验过程中被加入。深UV的缩微方法¹⁰在Azioune细节被描述等 ¹¹上图案化的PDMS被描述在Azioune 等 ¹²本拉伸协议是卡普里等人 ¹³的视频版本

Protocol

1。 PDMS的钝化

1. 切下一块PDMS大约35毫米×20毫米从预先制成薄片（例如，GelPak，因为在材料的表中列出）。
2. 除去塑料的顶部和底部的保护层（如果需要）和使用镊子将PDMS在一个塑料（不是细胞培养物处理的）培养皿。
3. 用70％乙醇在30振荡/分洗涤PDMS 5分钟，在旋转器上。
4. 通过在其上流动的空气干燥的表面。
5. 照亮深紫外光（λ= 180纳米），用于在从约5厘米的紫外线灯泡的距离5分钟（见材料表灯参考，参数会因不同的灯）。
6. 制备200微升的每个PDMS片EDC / NHS溶液（这必须在使用前制备，因为溶液的反应性衰变小时的物质）。 1毫升0.05M的MES +0.5 M氯化钠缓冲液，pH 6.0，加入11.5毫克硫代NHS和19.2毫克的EDC。
7. 转让PDMS薄片从培养皿到培养皿中，还没有被照亮的盖子。这将确保该PDMS的周围是非常疏水的，并便于进行下一步。
8. 添加EDC / NHS溶液并孵育15分钟，在室温下进行。
9. 冲洗EDC / NHS的水。
10. 加PLL-G-PEG溶液（0.5 mg / ml的HEPES 10mM的pH值8.6）和从3小时至过夜，在室温下孵育。
11. 冲洗PLL-G-PEG水。钝化的PDMS（功能化与PLL-G-PEG）可以在4℃下保存数天

2。将PDMS的图案

1. 采取的PDMS片，将它放在一个人造石英光罩轴承的微特征的图案（ 见图1）。将PDMS侧轴承的PLL-G-PEG面临的光掩模的铬侧。
2. 通过光掩模在从约5厘米的紫外线灯泡的距离照射7分钟。
3. 加水到面膜+ PDMS和剥离PDMS缓缓摘下面具。
4. 孵育在pH为8.6 1小时在室温下50 mg / ml的HEPES缓冲液中纤连蛋白的溶液。它可以使用其他ECM蛋白，但这些都没有经过测试与此协议。
5. 漂洗用PBS。

3。安装设备

1. 安装之前钝化PDMS到拉伸装置（见讨论用于故障排除）。
   1. 附加的PDMS的一侧，以拉伸机的固定部分。
   2. 修复对方担架的移动部分不夹紧，太多的PDMS表。
2. 在厚厚的PDMS刺砍PDMS的矩形（22毫米×19毫米）和内切另一个矩形，以便有一个池（或帧），将保留的细胞和介质（ 见图2）。
3. 添加硅脂根据本PDMS池，并将其放置在硅橡胶片的顶部创建一个MEDIUM护池。该润滑脂将使池过的PDMS片滑翔拉伸过程。

4。构图细胞

1. 从50％汇合培养瓶中用维尔烯分离的细胞。
2. 计数细胞并重新悬浮于其中的200,000个细胞/ ml的浓度。
3. 加入1 ml的细胞悬液在池中（见讨论更多细节）。
4. 让细胞结合到图案为10-30分钟（取决于细胞类型，RPE-1细胞需时10分钟，HeLa细胞20分钟）。
5. 轻轻冲洗漂浮细胞与平衡介质（在培养箱平衡介质）。
6. 让细胞扩散，以图案的几个小时（RPE-1将需要至少2小时; HeLa细胞将需要3小时）。
7. 加盖玻片上池的顶部，避免在PDMS的休息蒸发和中泄漏。
8. 将装置放在倒置显微镜，并开始显像。避免使用油镜观测jectives，因为它不会由于聚焦问题的工作。

5。拉伸

1. 转动测微螺旋，而校正在x-，y-和z轴（主要x）的舞台的位置。平台位置需要校正以抵消PDMS的加宽和焦点的损失。 （请参阅“在伸展”的讨论段）。

Representative Results

在这个视频协议提出的技术允许在有丝分裂哺乳动物细胞的纤维回缩力的应用。实际上，在细胞分裂期间，在有丝分裂阶段，哺乳动物细胞缩回取的球的形状，并留下由膜包围薄肌动线，它们分别连接到基板上。这些电缆（回缩纤维），是细胞的几何形状在进入分裂的记忆。通过在PDMS薄膜的光掩模制作微图案与深紫外光（ 图1）允许细胞粘附的几何控制。通过拉伸衬底在中期的开始，一些这些回缩纤维被拉离体细胞，从而产生施加在有丝分裂细胞的皮质（ 图3）的机械力。这些力量却显示出了执政主轴⁹的方向。

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图1。人造水晶光罩轴承微图案的特点。  用于深紫外光图案A）典型的光掩模。它有10厘米×10厘米的二进制掩模和特征通常为约20μm宽的单细胞图案化，具有亚微米的分辨率。广场由肉眼可见的是看一个10倍的目标显微镜视场的大小。该爆破示出对应于单个单元图形（这里是光盘）的功能。特点是透明的，让深的UV B）通过将PDMS应用在光掩膜，同时小心避开泡沫的形成。钝化PDMS侧与光掩模的金属面接触。该微图案会被印在所有的PDMS。g1highres.jpg“目标=”_blank“>点击这里查看大图。

图2。池。  一池的PDMS上应用PDMS片。油脂覆盖池底周边。池的容量是大约2毫升介质。池充满培养基（这里的水用荧光显示为黄色）。为了避免蒸发，盖玻片可以在上面添加。 点击这里查看大图 。

表面上）在拉伸相位对比图像。该信元被镀上一个椭圆形的图案。为了实现这一目标，所述图案形成，是用圆形图案压印过程中通过光掩模被拉伸的PDMS。阿破下来光掩模（片面膜的直径约1.5厘米）。为了避免打破口罩，请使用光罩一个椭圆形的图案和未拉伸的硅橡胶片材打印B）拉伸后。基材被拉伸，如图案变成了圆形。 点击这里查看大图 。

Discussion

虽然这种技术已经被使用无数次，并经过全面的测试，也有可能导致一个失败的实验的几个关键步骤。

关于PDMS：

对于这项工作，GelPak，市售的薄的PDMS片，使用。另外PDMS表可以从PDMS结构直接转换。我们建议使用GelPak，因为它是更具有可重复性，而且不太可能突破相比，定制的PDMS。

关于设备：

在这个协议中使用的拉伸装置的设计“内部”，但人们也可以应用缩微技术在诸如FLEXCELL市售担架。定制选项更加灵活和便宜不少。

安装设备：

将PDMS的安装可以导致断裂。这也很容易得到反效果，也没有办法告诉哪一方这。如果PDMS被钳位太多，它变得更短，这可能导致破坏（如张力将更大的伸展的距离相同）。确保螺丝已经拧好或硅橡胶片将尽快拉伸实验过程中开始或更高版本上滑动。

添加单元格：

用于从培养基质上脱离的细胞，最好是使用EDTA的0.02％在PBS中，而不是胰蛋白酶。用EDTA将允许对模式的细胞更快地重新绑定。当细胞被加入到硅橡胶，它们必须很好地彼此分开，以便获得单个细胞结合的图案。一旦它们在悬浮液中，吸取他们多次用200微升提示，这将打碎聚集。约200,000细胞必须以具有结合到每一个图案被添加到4cm ²的表面上。使用小音量，使细胞迅速下降到表面。如果没有足够多的细胞，米任何模式将保持为空。非贴壁细胞必须尽快足够的细胞被绑定到模式冲出媒体的去除。在冲洗之前的时间可以细胞类型之间有所不同，但15分钟通常是足够的细胞开始附着到图案。如果细胞被留下附着的时间过长，将图案通过2个或更多细胞占据。这个步骤在¹³进行说明。

在拉伸：

要格外小心，同时伸展，以避免失去感兴趣的区域的位置。的确，拉伸过程中，PDMS将变得更宽，并且在舞台的位置需要重新调整，以补偿。舞台的机动拉伸装置和软件控制的组合可以开发自动补偿这种效果^14。的简单和通用手册担架这里提出可以升级来实现这样的自动补偿。

将PDMS宝醇可以泄漏，如果硅脂没有被正确放置周围的表面。确保设置是通过把里面的PBS，看任何泄漏就可以了镀细胞前正确密封。

我们担架允许拉伸约30％，但定制设计的担架可以允许更高程度的拉伸。要小心，因为较高的压力，较高的是PDMS层断裂的风险。

局限性：

一个在这里提出的技术的主要局限性是使用电动机缺乏容易自动拉伸/ destretching。然而，也能够适应的致动器来代替手动测微螺钉。本实施方式中，加上显微镜控制的具体编程可以允许补偿位移样品在拉伸过程。

另一个缺点是具有高的分辨率成像的困难，因为使用油浸目标中当目标移动太快软基板duces运动。这可以通过使用水来解决（但随后蒸发是一个问题的长期实验）或非常流畅油。

修改和未来的应用：

在烟岚茅和尼克Tapon从癌症研究所（伦敦，英国）的合作，我们开发了另一种版本的担架允许PDMS两层彼此的顶部，与在中间的样品即，为了捏和伸展整个组织。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141