Strækker micropatterned Celler på en PDMS Membrane

Summary

Dette håndskrift præsenterer en teknik til at anvende eller frigive kræfter på vedhængende celler eller væv ved hjælp ensrettet strækning.

Abstract

Mekaniske kræfter, der udøves på celler og / eller væv spiller en vigtig rolle i en lang række processer. Vi har udviklet et apparat til at strække celler udpladet på en polydimethylsiloxan (PDMS) membran, der er forenelig med billeddannelse. Denne teknik er reproducerbar og alsidig. PDMS membran kan micropatterned for at begrænse celler eller væv til en bestemt geometri. Det første skridt er at udskrive micropatterns på PDMS membran med en dyb UV teknik. PDMS membran derpå monteret på en mekanisk båre. Et kammer er bundet på toppen af ​​membranen med biokompatible fedt for at tillade glidende under stræk. Cellerne podes og får lov til at sprede sig i flere timer på micropatterns. Prøven kan strækkes og ustrakte flere gange med brug af en mikrometrisk skrue. Det tager mindre end et minut til at anvende den strækning i sin fulde udstrækning (ca. 30%). Den teknik, der præsenteres her ikke omfatter en motordrevet enhed, som er nødvendig for enpplying gentagne stretch cykler hurtigere og / eller computerstyret strække, men dette kan gennemføres. Strækker af celler eller væv kan være af interesse for spørgsmål vedrørende celle styrker, celle respons på mekanisk stress eller vævsmorfogenese. Denne video præsentation vil vise, hvordan man kan undgå typiske problemer, der kan opstå, når du laver denne type tilsyneladende simpelt eksperiment.

Introduction

Cellerne komponere et væv i højere organismer er underlagt mekaniske spændinger og strækker kræfter kommer enten fra det eksterne miljø eller fra de omkringliggende celler ^1,2. Cellerne skal tilpasse sig og modstå disse kræfter for at bevare væv integritet. Sådanne kræfter er også vigtigt for væv morfogenese under udvikling ^3,4. Anvende mekaniske kræfter på dyrkede celler er en måde at efterligne, hvad der kan ske i et væv, men med en kvantitativ og uafhængig kontrol af cellens form og celle deformation ^5,6. Til dette, kan adskillige teknikker anvendes. Man kan trykke på cellerne (hele cellen eller en del af det), for eksempel ved hjælp af AFM eller derivater ^7,8 eller strække underlaget cellerne vokser på.

Det er beskrevet i dette papir metode viser, hvordan man strække en plan substrat belagt med celler. Denne teknik blev oprindeligt udviklet til at vurdere rollen af ​​kræfter, der udøves på mitotic pattedyrceller ^9. Mitotiske celler holde forbindelsen til underlaget gennem tilbagetrækningselementer fibre og strækker membranen udøves en kraft på de fibre, der til gengæld gav anledning rotation mitotiske spindel. Interessen for at kombinere klæbende micropatterns og stretching er at opnå en uafhængig kontrol af kræfter og form af de enkelte celler. Det er for eksempel muligt at strække ægformede celle, i en helt isotropisk rund form, mens uniaksial strækning anvendes. Hvis cellerne ikke er flettede på micropatterns énakset strækning resulterer i celleforlængelse med de fleste celler, der har en længdeakse på linie med stretch akse. Det er da vanskeligt at adskille virkningerne af den lange akse tilpasning og virkningen af ​​strækningen påføres cellerne.

Enheden er velegnet til alle levende celler, herunder lang tid bortfalder fluorescerende mikroskopi, og stoffer kan tilføjes under eksperimentet. Den dybe UVs micropatterning metode ¹⁰blev beskrevet i detaljer i Azioune et al. ^11. Patterning på PDMS blev beskrevet i Azioune et al. ^12. Den nuværende strækker protokol er en video-version af Carpi et al. ^13.

Protocol

1.. Passivering af PDMS

1. Klip et stykke PDMS cirka 35 mm x 20 mm fra en pre lavet plade (f.eks GelPak, som angivet i tabellen af ​​materialer).
2. Fjern de øverste og de nederste beskyttende lag af plast (om nødvendigt) og anvende en pincet til at placere PDMS i en plast (ikke cellekultur behandlet) petriskål.
3. Vask PDMS med 70% ethanol i 5 minutter på en rotator ved 30 svingninger / min.
4. At tørre overfladen ved strømmende luft på det.
5. Belyse med dyb UV (λ = 180 nm) i 5 minutter i en afstand fra UV pærer på omkring 5 cm (se Materialer ark til lampe reference parametre vil variere for forskellige lyskilder).
6. Forbered 200 pi EDC / NHS løsning for hvert PDMS stykke (dette skal fremstilles umiddelbart inden brug, fordi reaktiviteten af ​​løsningen henfalder i løbet af timer). Til 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCI-buffer ved pH 6,0, tilsættes 11,5 mg Sulfo-NHS og 19,2 mg EDC.
7. OverførPDMS plader fra petriskålen til låget af petriskålen, som ikke er blevet belyst. Dette vil sikre, at omgivelserne af PDMS er meget hydrofobe og lette det næste trin.
8. Tilføj EDC / NHS-opløsning og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
9. Skyl EDC / NHS med vand.
10. Tilføj PLL-g-PEG-opløsning (0,5 mg / ml i HEPES 10 mM pH 8,6) og inkuberes fra 3 timer til natten over ved stuetemperatur.
11. Skyl PLL-g-PEG med vand. Passiveret PDMS (funktionaliseret med PLL-g-PEG) kan opbevares i flere dage ved 4 ° C.

2. Mønstret af PDMS

1. Tag en PDMS ark og placere den på en syntetisk kvarts fotomaske bærer microfeatures for mønster (se figur 1). Placer PDMS side bærer PLL-g-PEG vender krom side af fotomasken.
2. Belyse for 7 min gennem fotomasken i en afstand fra UV pærer på omkring 5 cm.
3. Tilsæt vand på masken + PDMS og skræl PDMS langsomt masken.
4. Inkuberes med fibronectin opløsning ved 50 mg / ml i HEPES-buffer ved pH 8,6 i 1 time ved stuetemperatur. Det er muligt at anvende andre ECM-proteiner, men disse er ikke blevet testet med denne protokol.
5. Skyl med PBS.

3. Montering af enheden

1. Monter de tidligere passiverede PDMS på stretching enhed (se Diskussion til fejlfinding).
   1. Fastgør den ene side af PDMS til den faste del af båren.
   2. Lave den anden side til den mobile del af båren uden fastspænding for meget af PDMS ark.
2. Skær et rektangel PDMS (22 mm x 19 mm) i en tyk PDMS stik og skære et rektangel inde for at have en pulje (eller ramme), der vil bevare de celler og medier (se figur 2).
3. Tilføj silicone fedt under denne PDMS pool og placere den på toppen af ​​PDMS ark til at oprette et MEDium fastholde pool. Fedtet vil gøre det muligt gliding af puljen over PDMS arket under strækning.

4.. Mønstring cellerne

1. Frigør de celler fra en 50% sammenflydning kultur kolbe med Versene.
2. Tæl celler og resuspender dem i en koncentration på 200.000 celler / ml.
3. Tilsæt 1 ml cellesuspension i puljen (se diskussionen for yderligere detaljer).
4. Lad cellerne binder til mønstre for 10-30 min (afhængig af celletypen, RPE-1-celler vil tage 10 minutter, og HeLa-celler 20 min).
5. Skyl forsigtigt flydende celler med ligevægt medium (ligevægt medium i kuvøse).
6. Lad cellerne spredes for et par hr om de mønstre (RPE-1 skal mindst 2 timer; HeLa-celler har brug for 3 timer).
7. Tilføj et dækglas på toppen af ​​puljen for at undgå fordampning og mellemstore lækage i tilfælde af PDMS pauser.
8. Sæt apparatet på et omvendt mikroskop og begynde billeddannelse. Undgå brug af olieimmersion obkvenser, da det ikke vil arbejde på grund af fokusering problemer.

5.. Strækker

1. Drej mikrometrisk skrue til at korrigere for den fase position i x-, y-og z-aksen (hovedsagelig x). Skal korrigeres for at modvirke udvidelsen af ​​PDMS og tab af fokus scenen position. (Se "I løbet af stretch" stk i diskussionen).

Representative Results

Teknikken præsenteres i denne video protokol tillod tilførsel af kræfter på retraktionsindstillingen fibre af mitotiske pattedyrceller. Faktisk under celledeling på mitotiske fase pattedyrceller oprulles tage form af en kugle og efterlade tynde actin kabler omgivet af membran, som er fastgjort til substratet. Disse kabler (retraktionsindstillingen fibre), er mindet om cellens geometri før de går ind division. Making micropatterns med dyb UV gennem en fotomaske på PDMS tynd film (figur 1) gav geometriske styring af celleadhæsion. Ved strækning af substrat ved starten af metafase blev nogle af disse retraktionsindstillingen fibre trækkes væk fra cellen kroppen, hvilket resulterer i en mekaniske kræfter, der påføres på den mitotiske cellens cortex (figur 3). Disse kræfter blev vist at styre retningen af spindelaksen ^9.

gur 1 "fo: content-width =" 6tommer "fo: src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Syntetisk Quartz Fotomaske bærende micropatterns funktioner.   A) Typisk fotomaske anvendes til dyb UV mønster. Det er en 10 cm x 10 cm binær maske og funktionerne er typisk på omkring 20 um bred til enkelt celle mønster, med en submicron opløsning. Squares synlige med det blotte øje er på størrelse med et 10X objektiv mikroskop synsfelt. Den blowup viser de funktioner, der svarer til encellede mønstre (her diske). Funktioner er gennemsigtige for at lade dybe UV'er passere igennem. B) PDMS påføres fotomasken mens omhyggeligt undgår dannelsen af bobler. Den passiveret PDMS side er i kontakt med den metalliske side af fotomasken. De micropatterns vil blive udskrevet over hele PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større billede.

Figur 2. Puljen.   En PDMS pulje påføres PDMS ark. Grease dækker den nederste kant af bassinet. Kapaciteten af ​​puljen er omkring 2 ml medier. Poolen er fyldt med dyrkningsmedium (her vand med fluorescein vises i gult). For at undgå fordampning, kan et dækglas lægges på toppen. Klik her for at se større billede .

A) Før stretching. Cellen er belagt på en oval mønster. For at opnå dette, er mønstret gøres med PDMS blive strakt under indtryk af runde mønstre gennem fotomasken. En opdelt fotomasken bruges (det stykke af masken er omkring 1,5 cm i diameter). For at undgå at nedbryde en maske, kan du bruge en oval mønster på fotomasken og udskrive det på en ikke-strakt PDMS ark. B) Efter stretching. Underlaget er strakt som mønsteret bliver en cirkel. Klik her for at se større billede .

Discussion

Selv om denne teknik har været anvendt adskillige gange, og er grundigt testet, er der flere kritiske trin, der kan føre til en mislykket forsøg.

Om PDMS:

For dette arbejde, GelPak et kommercielt tilgængeligt tynd PDMS plade blev anvendt. Alternativt PDMS plader kan støbes direkte fra PDMS mix. Vi anbefaler at bruge GelPak fordi det er mere reproducerbar, og er mindre tilbøjelige til at bryde i forhold til specialfremstillede PDMS.

Om enheden:

Den strækker enhed, der bruges i denne protokol var designet "i hus", men man kan også anvende micropatterning teknik på kommercielt tilgængelige bårer som FlexCell. Specialfremstillede muligheder er mere alsidige og meget billigere.

Montering af enhed:

Monteringen af ​​PDMS kan føre til brud. Det er også nemt at vende det, og der er ingen måde at fortælle, hvilken side der erder. Hvis PDMS fastspændes for meget, bliver det kortere og dette kan føre til rev (som spændingen vil være større til den samme afstand af stræk). Sørg for, at skruerne er strammet eller PDMS plade vil glide, så snart strækningen begynder eller senere under eksperimentet.

Tilføjelse af celler:

For at løsne cellerne fra dyrkningssubstrat, er det bedre at anvende EDTA 0,02% i PBS i stedet for trypsin. Brug EDTA vil tillade hurtigere gentilknytningsangreb af cellerne på mønstrene. Når celler sættes til PDMS, skal de være godt adskilt fra hinanden for at opnå individuelle celler binder til mønsteret. Når de er i suspension, pipette dem flere gange med en 200 gl tip, det vil bryde op aggregater. Omkring 200.000 celler skal tilføjes på 4 ^cm2 overflade for at få binding til hvert mønster. Brug et lille volumen, så cellerne falder hurtigt på overfladen. Hvis der ikke er nok celler, meventuelle mønstre vil forblive tomt. De ikke vedhæftede celler skylles ved fjernelse medier så snart nok celler er bundet til mønstrene. Tiden før flush kan variere mellem celletyper, men 15 min er i almindelighed tilstrækkelig for at cellerne kan begynde knyttet til mønstrene. Hvis cellerne får lov til at vedhæfte i for lang tid, vil mønstrene besat af to eller flere celler. Dette trin er beskrevet i ^13.

Under strækning:

Vær ekstra forsigtig, mens du strækker, for at undgå at miste position i regionen af ​​interesse. I løbet strækningen, vil PDMS bliver bredere, og har brug for scenen holdning, der skal justeres for at kompensere. En kombination af en motoriseret stretching enhed og software kontrol af scenen kan udvikles til automatisk at kompensere for denne effekt ^14. Den enkle og alsidige manuel båre præsenteres her kan opgraderes til at opnå sådan automatiseret kompensation.

PDMS pool kan lække, hvis silikonefedt ikke var placeret korrekt omkring overfladen. Sørg for, at opsætningen er korrekt forseglet ved at sætte PBS inde og se for enhver utæthed før forkromning celler på det.

Vores båre tillader en strækning på omkring 30%, men specialdesignede bårer kunne give mulighed for en højere grad af strækning. Vær forsigtig, da den højere belastning, jo større er risikoen for PDMS lag bryde.

Begrænsninger:

En af de vigtigste begrænsninger i teknikken præsenteres her, er manglen på nem automatisk strækning / destretching ved hjælp af en motor. Ikke desto mindre er det muligt at tilpasse en aktuator i stedet for en manuel mikrometrisk skrue. Denne implementering, kombineret med en specifik programmering af mikroskopet kontrol kan tillade kompensation for prøve forskydning under strækning.

En anden ulempe er vanskeligheden ved at have høj opløsning billeddannelse, fordi bruge olie nedsænkning målcerer bevægelser af bløde underlag, når målet bevæger sig for hurtigt. Dette kan løses ved hjælp af vand (men så fordampningen er et problem for langsigtede forsøg) eller meget flydende olie.

Ændringer og fremtidige applikationer:

I samarbejde med Yanlan Mao og Nic Tapon fra Cancer Research Institute (London, UK), har vi udviklet en anden version af båren, som tillader to lag af PDMS oven på hinanden, med prøven være i midten, for at knibe og strække hele væv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141