Stretching micropatterned Cellen op een PDMS membraan

Summary

Dit manuscript presenteert een techniek om de krachten te passen of release op hechtende cellen of weefsels met behulp van unidirectionele stretching.

Abstract

Mechanische krachten op cellen en / of weefsels spelen een belangrijke rol in talrijke processen. We hebben een apparaat om cellen op een polydimethylsiloxaan (PDMS) membraan, geschikt imaging strekken ontwikkeld. Deze techniek is reproduceerbaar en veelzijdig. De PDMS membraan kan worden micropatterned om cellen of weefsels te beperken tot specifieke geometrie. De eerste stap is micropatterns drukken op de PDMS membraan met een diepe UV techniek. De PDMS membraan wordt vervolgens gemonteerd op een mechanische brancard. Een kamer is gebonden bovenop het membraan met biocompatibele vet glijden tijdens het traject mogelijk. De cellen worden gezaaid en mogen verspreiden voor enkele uren op de micropatterns. Het monster kan meerdere malen worden uitgerekt en zonder rek met behulp van een micrometrische schroef. Het duurt minder dan een minuut om het traject van toepassing zijn op haar volle omvang (ongeveer 30%). De hier gepresenteerde techniek heeft een gemotoriseerd apparaat, dat nodig is voor een niet bevattenpplying herhaalde cycli stretch snel en / of computergestuurde strekken, maar dit kan worden uitgevoerd. Uitrekken van cellen of weefsel kan van belang zijn voor vragen met betrekking tot cel krachten, cel reactie op mechanische stress of weefsel morfogenese. Deze video presentatie zal laten zien hoe je typische problemen die zich kunnen voordoen bij het doen van dit soort schijnbaar eenvoudige experiment te voorkomen.

Introduction

De cellen samenstellen van een weefsel in hogere organismen zijn onderworpen aan mechanische spanningen en rekkrachten afkomstig hetzij van de externe omgeving of uit de omliggende cellen ^1,2. Cellen moeten zich aanpassen aan en tegen deze krachten, om de integriteit van het weefsel te behouden. Dergelijke krachten zijn ook belangrijk voor weefsels morfogenese tijdens ontwikkeling ^3,4. Toepassing mechanische krachten op gekweekte cellen is een manier om te bootsen wat zou gebeuren in een weefsel, maar met een kwantitatieve en onafhankelijke regeling van celvorm en celvervorming ^5,6. Hiervoor kunnen verschillende technieken worden gebruikt. Men kan drukken op de cellen (de volledige cel of deel daarvan), bijvoorbeeld met AFM of derivaten ^7,8 en rek het substraat de cellen groeien op.

De methode beschreven in dit document laat zien hoe een vliegtuig substraat bedekt met cellen strekken. Deze techniek werd oorspronkelijk ontwikkeld ter beoordeling van de rol van krachten op mitotic zoogdiercellen ^9. Mitotische cellen verbonden blijven op het substraat door retractie vezels en strekken de membraan een kracht uitgeoefend op de vezels, die op zijn beurt veroorzaakt de rotatie van de mitotische spoel. Het belang van het combineren van lijm micropatterns en stretching is om onafhankelijke controle van de krachten en de vorm van individuele cellen te bereiken. Het is bijvoorbeeld mogelijk om een ​​eivormige cel uitstrekken tot een perfect isotroop ronde vorm, terwijl uniaxiale rek wordt toegepast. Als de cellen niet worden gevlochten op micropatterns, eenassige stretching resultaten in cel rek, met de meeste cellen met een lange as in lijn met de stretch as. Het is dan moeilijk om het effect van de lange as uitlijning en het effect van het traject toegepast om de cellen te scheiden.

Het apparaat is geschikt voor elke live cell imaging, inclusief lange time lapse fluorescentie microscopie, en drugs kan tijdens het experiment worden toegevoegd. De diepe UV's micropatterning methode ¹⁰werd in detail beschreven in Azioune et al.. ¹¹ Patterning op PDMS werd beschreven in Azioune et al.. ¹² De huidige stretching protocol is een video-versie van Carpi et al.. ¹³

Protocol

1. Passivering van de PDMS

1. Knip een stuk PDMS ongeveer 35 mm x 20 mm uit een vooraf gemaakte blad (bijvoorbeeld GelPak, zoals vermeld in de tabel van materialen).
2. Verwijder de bovenste en onderste beschermende lagen kunststof (indien nodig) en gebruik pincet om de PDMS plaatsen in een plastic (niet celcultuur behandeld) petrischaal.
3. Was de PDMS met 70% ethanol gedurende 5 minuten op een rotator bij 30 oscillaties / min.
4. Droog het oppervlak door stromende lucht op.
5. Verlicht met diepe UV (λ = 180 nm) gedurende 5 min bij een afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm (zie Materialen blad voor referentie licht, parameters variëren voor verschillende lampen).
6. Bereid 200 ul van EDC / NHS oplossing bij PDMS stuk (dit moet vers worden bereid voor gebruik omdat de reactiviteit van de oplossing vervalt in enkele hr). 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl bij pH 6,0, voeg 11,5 mg Sulfo-NHS en 19,2 mg EDC.
7. Breng dePDMS vellen uit de petrischaal om het deksel van de petrischaal, die niet zijn belicht. Dit zal ervoor zorgen dat de omgeving van de PDMS zijn zeer hydrofoob en de volgende stap te vergemakkelijken.
8. Voeg EDC / NHS oplossing en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur.
9. Spoel EDC / NHS met water.
10. Add PLL-g-PEG-oplossing (0,5 mg / ml in 10 mM HEPES pH 8,6) en incubeer van 3 uur 's nachts bij kamertemperatuur.
11. Spoel de PLL-g-PEG met water. Gepassiveerd PDMS (gefunctionaliseerd met PLL-g-PEG) worden enkele dagen bewaard bij 4 ° C.

2. Patroonvorming van de PDMS

1. Neem een PDMS vel en plaats het op een synthetische kwarts fotomasker met het microfeatures voor patronen (zie figuur 1). Plaats de PDMS zijkant voorzien van het PLL-g-PEG geconfronteerd met de chromen kant van de fotomasker.
2. Belichten gedurende 7 min door het fotomasker op afstand van de UV-lampen van ongeveer 5 cm.
3. Voeg water op het masker + PDMS en schil de PDMS langzaam het masker af.
4. Incubeer met fibronectine bij 50 mg / ml in HEPES buffer bij pH 8,6 gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. Het is mogelijk om anderen ECM eiwitten te gebruiken, maar deze zijn niet getest met dit protocol.
5. Spoelen met PBS.

3. Het toestel bevestigen

1. Monteer de eerder gepassiveerd PDMS op de stretching apparaat (zie Overleg voor het oplossen van problemen).
   1. Bevestig een zijde van de PDMS het vaste deel van de brancard.
   2. Bevestig de andere kant van het mobiele gedeelte van de stretcher zonder klemmen te veel van het PDMS vel.
2. Snijd een rechthoek van PDMS (22 mm x 19 mm) in een dikke PDMS steek en snij een rechthoek binnen om een pool (of frame) hebben dat de cellen en media behouden (zie figuur 2).
3. Voeg siliconenvet onder deze PDMS zwembad en plaats deze op de top van de PDMS vel het creëren van een medium behoud zwembad. Het vet zal het glijden van het zwembad over de PDMS vel mogelijk te maken tijdens het uitrekken.

4. Patroonvorming van de Cellen

1. Maak de cellen van een 50% confluentie kolf met Versene.
2. Tel de cellen en resuspendeer ze in een concentratie van 200.000 cellen / ml.
3. Voeg 1 ml celsuspensie in het zwembad (zie Overleg voor meer informatie).
4. Laat de cellen binden aan de patronen voor 10-30 min (afhankelijk van het celtype, RPE-1 cellen 10 min en HeLa-cellen 20 min. duren).
5. Zachtjes spoelen van de drijvende cellen met in evenwicht medium (evenwicht middelgroot incubator).
6. Laat de cellen verspreid voor een paar uur op de patronen (RPE-1 zal minstens 2 uur nodig hebben; HeLa cellen 3 uur nodig).
7. Voeg een dekglaasje bovenop de pool verdamping en middelgrote lekkage indien het PDMS onderbrekingen voorkomen.
8. Plekje op een omgekeerde microscoop en start beeldvorming. Vermijd het gebruik van olie immersie obstellingen als het niet zal werken als gevolg van focus problemen.

5. Stretching

1. Draai de micrometrische schroef tijdens het corrigeren van de fase positie in de x-, y-en z-as (voornamelijk x). De positie van het podium moet worden gecorrigeerd aan de verbreding van de PDMS en het verlies van de focus tegen te gaan. (Zie "Tijdens de rekken" paragraaf in de discussie).

Representative Results

De in deze video protocol techniek de vordering van krachten op het terugtrekken vezels mitotische zoogdiercellen. Immers, tijdens de celdeling, in de mitotische fase zoogdiercellen trekken de vorm van een bol nemen en achter dunne actine kabels omgeven door membraan die zijn bevestigd aan het substraat. Deze kabels (retractie vezels), zijn het geheugen van de cel geometrie voordat je in divisie. Maken micropatterns met diepe UV door een fotomasker op PDMS dunne film (figuur 1) kon de geometrische controle celadhesie. Door strekken het substraat bij het ​​begin van metafase, sommige terugtrekken vezels werden van het cellichaam getrokken, waardoor een mechanische krachten aangebracht op de cortex mitotische cel (figuur 3). Deze krachten werden de richting van de spilas ⁹ regelen.

guur 1 "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figuur 1. Synthetische Quartz Fotomasker dragende micropatterns functies.   A) Typische fotomasker gebruikt voor diepe UV-patronen. Het is een 10 cm x 10 cm binaire masker en de kenmerken zijn typisch van ongeveer 20 micrometer breed voor enkele cel patronen, met een submicron resolutie. Vierkanten zichtbaar met het blote oog zijn de grootte van een 10X objectief microscoop gezichtsveld. De ontploffing toont de functies die overeenkomen met enkele cel patronen (hier discs). Kenmerken zijn transparant voor diepe UV's laten passeren. B) De PDMS wordt aangebracht op het fotomasker terwijl de vorming van luchtbellen zorgvuldig vermeden. De gepassiveerd PDMS zijde in contact met de metalen zijde van het fotomasker. De micropatterns wordt afgedrukt over de PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Klik hier voor grotere afbeelding.

Figuur 2. Het zwembad.   Een PDMS zwembad wordt toegepast op de PDMS vel. Grease is aan de onderkant omtrek van het zwembad. De capaciteit van het zwembad is ongeveer 2 ml van de media. Het zwembad is gevuld met kweekmedium (hier water met fluoresceïne verschijnt in het geel). Om verdamping te voorkomen, kan een dekglaasje worden toegevoegd op de top. Klik hier voor grotere afbeelding .

A) Voor het uitrekken. De cel wordt uitgeplaat op een ovaal patroon. Hiertoe wordt de patroonvorming uitgevoerd met PDMS uitgerekt tijdens de indruk ronde patronen door het fotomasker. Een afgebroken photomask wordt gebruikt (het stuk van het masker is ongeveer 1,5 cm in diameter). Om afbreken van een masker te voorkomen, gebruikt een ovaal patroon op de fotomasker en druk het af op een ongestrekte PDMS vel. B) Na het rekken. Het substraat wordt uitgerekt, zoals het patroon wordt een cirkel. Klik hier voor grotere afbeelding .

Discussion

Hoewel deze techniek vele malen gebruikt en getest, zijn er verschillende belangrijke stappen die leiden tot een mislukt experiment.

Over het PDMS:

Voor dit werk, GelPak, een commercieel beschikbare dunne PDMS vel, werd gebruikt. Alternatief PDMS platen kunnen direct worden gegoten uit PDMS mix. Wij raden u aan GelPak omdat het meer reproduceerbaar, en minder kans op breken in vergelijking met op maat gemaakte PDMS.

Over het apparaat:

De stretching apparaat gebruikt in dit protocol is ontworpen "in huis", maar men kan ook de micropatterning techniek toe te passen op de in de handel verkrijgbare brancards als FlexCell. Custom made opties zijn veelzijdiger en een stuk goedkoper.

Montage van het apparaat:

De montage van de PDMS kan leiden tot breken. Het is ook gemakkelijk om het te inverteren en er is geen manier om te vertellen welke kantdie. Als de PDMS teveel geklemd, wordt korter en dit kan leiden tot het breken (zo spanning groter zal zijn voor dezelfde afstand van stretch). Zorg ervoor dat de schroeven goed aangedraaid of de PDMS vel zal zodra de rek begint of later tijdens het experiment glijden.

Het toevoegen van de cellen:

Voor het losmaken van de cellen uit de kweek substraat, is het beter om gebruik 0.02% EDTA in PBS in plaats van trypsine. Met EDTA sneller opnieuw binden van de cellen op de patronen staan. Wanneer cellen worden toegevoegd aan het PDMS, moeten ze goed van elkaar gescheiden om individuele cellen binden aan het patroon te verkrijgen. Zodra ze zijn in suspensie, pipet hen meerdere malen met een 200 ul tip, dit zal breken aggregaten. Ongeveer 200.000 cellen moeten worden toegevoegd aan het 4 cm ² oppervlakte om binding aan elk patroon hebben. Gebruik een klein volume zodat de cellen vallen snel op het oppervlak. Als er niet genoeg cellen, meventuele patronen blijft leeg. De niet-ingeschrevenen cellen moeten uit worden gespoeld door media verwijdering zo spoedig genoeg cellen zijn gebonden aan de patronen. De tijd voordat de flush kan variëren tussen celtypen maar 15 min is meestal genoeg voor de cellen om te beginnen met het aanbrengen van de patronen. Als de cellen worden overgelaten aan hechten te lang, zullen patronen worden bezet door 2 of meer cellen. Deze stap is beschreven in ^13.

Tijdens het traject:

Wees extra voorzichtig, terwijl het uitrekken, om te voorkomen dat de positie van de regio van belang. Inderdaad, tijdens het traject, de PDMS zal breder worden, en het podium positie moet worden aangepast om te compenseren. Een combinatie van een gemotoriseerde spaninrichting en softwarebesturing van de fase kan worden ontwikkeld om automatisch compenseren effect ^14. De eenvoudige en veelzijdige handmatige brancard hier gepresenteerd kan worden opgewaardeerd tot dergelijke automatische compensatie te bereiken.

De PDMS pool kan lekken als het silicium vet niet goed rond het oppervlak werd geplaatst. Zorg ervoor dat de installatie correct is verzegeld door de invoering PBS binnen en kijken voor eventuele lekkage voordat plating cellen op.

De brancard kan een stuk van ongeveer 30%, maar speciaal ontworpen brancards kan leiden tot een hogere graad van strekken. Pas als de hoger de spanning, des te hoger het risico van PDMS laag breken.

Beperkingen:

Een van de belangrijkste beperkingen in de hier gepresenteerde techniek is het gebrek aan eenvoudige automatische strekken / destretching met een motor. Niettemin is het mogelijk om een ​​actuator in plaats van een handmatige micrometrische schroef passen. Deze implementatie, in combinatie met een specifieke programmering van de microscoop controle kan een vergoeding voor het monster verplaatsing mogelijk te maken tijdens het uitrekken.

Een ander nadeel is de moeilijkheid met hoge resolutie beeldvorming, omdat het gebruik van olie-immersie doelstellingenceert bewegingen van de zachte ondergrond als de doelstelling beweegt te snel. Dit kan worden opgelost met behulp van water (maar dan verdamping is een probleem voor de lange termijn experimenten) of zeer vloeibare olie.

Wijzigingen en toekomstige toepassingen:

In samenwerking met Yanlan Mao en Nic Tapon van het Cancer Research Institute (Londen, UK), ontwikkelden we een andere versie van de brancard, die twee lagen van PDMS maakt boven op elkaar, met het monster in het midden, om te knijpen en rek gehele weefsels.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141