Stretching cellules Micropatterned sur une membrane PDMS

Summary

Ce manuscrit présente une technique d'appliquer ou libérer des forces sur les cellules ou les tissus adhérents utilisant étirement unidirectionnel.

Abstract

Les forces mécaniques qui s'exercent sur les cellules et / ou tissus jouent un rôle important dans de nombreux processus. Nous avons mis au point un dispositif pour étirer les cellules étalées sur un polydiméthylsiloxane (PDMS) membrane, compatible avec l'imagerie. Cette technique est reproductible et versatile. La membrane PDMS peut être microélectrodes pour confiner des cellules ou des tissus à une géométrie spécifique. La première étape consiste à imprimer micropatterns sur la membrane PDMS avec une technique de rayonnement UV lointain. La membrane PDMS est ensuite montée sur un châssis mécanique. Une chambre est tenue au-dessus de la membrane avec de la graisse biocompatible pour permettre glisse pendant l'étirement. Les cellules sont ensemencées et autorisés à se répandre pendant plusieurs heures sur les micropatterns. L'échantillon peut être étirée et non étirée à plusieurs reprises à l'aide d'une vis micrométrique. Il faut moins d'une minute pour appliquer le tronçon à sa pleine mesure (environ 30%). La technique présentée ici ne comprend pas un dispositif motorisé, qui est nécessaire pour unpplying cycles répétés d'étirement rapidement et / ou traction contrôlée ordinateur, mais cela peut être mis en œuvre. Stretching de cellules ou de tissus peut être d'intérêt pour les questions liées aux forces de cellules, la réponse cellulaire au stress mécanique ou la morphogenèse des tissus. Cette présentation vidéo vous montrera comment éviter les problèmes typiques qui peuvent survenir lorsque vous faites ce type d'expérience apparemment simple.

Introduction

Les cellules composant un tissu chez les organismes supérieurs sont soumis à des tensions mécaniques et les forces d'étirage provenant soit du milieu extérieur ou à partir de cellules environnantes ^1,2. Les cellules doivent s'adapter et à résister à ces forces afin de maintenir l'intégrité des tissus. Ces forces sont également importantes pour la morphogenèse des tissus au cours du développement ^{de 3,4.} L'application de forces mécaniques sur des cellules en culture est une façon d'imiter ce qui pourrait arriver dans un tissu, mais avec un contrôle quantitatif et indépendante de la forme des cellules et la déformation de la cellule ^5,6. Pour cela, plusieurs techniques peuvent être utilisées. On peut appuyer sur les cellules (la cellule entière ou une partie de celui-ci), par exemple en utilisant l'AFM ou dérivés ^7,8 ou étirer le substrat, les cellules sont de plus en plus sur.

La méthode décrite dans cet article montre comment étirer un substrat plan avec des cellules plaquées. Cette technique a d'abord été mis au point pour évaluer le rôle des forces exercées sur mles cellules de mammifères itotic ^9. Les cellules mitotiques rester connecté au substrat par des fibres de rétraction et d'étirement de la membrane une force exercée sur ces fibres, ce qui a provoqué la rotation du fuseau mitotique. L'intérêt de combiner micropatterns adhésives et d'étirement est de parvenir à un contrôle indépendant des forces et de la forme des cellules individuelles. Il est par exemple possible d'étirer une cellule ovoïde dans une forme ronde parfaitement isotrope, tandis que l'allongement uniaxial est appliquée. Si les cellules ne sont pas tressé sur micropatterns, étirage uniaxial résultats de l'allongement cellulaire, avec la plupart des cellules ayant un axe longitudinal aligné avec l'axe d'étirage. Il est alors difficile de séparer l'effet de l'alignement de l'axe long et l'effet de l'étirage appliqué aux cellules.

L'appareil est conçu pour toute l'imagerie des cellules vivantes, y compris longtemps microscopie laps de fluorescent, et les médicaments peut être ajouté lors de l'expérience. La méthode profonde UV micromodelage ¹⁰qui a été décrit en détail dans Azioune et al. Patterning ¹¹ sur PDMS a été décrit dans Azioune et al. étirage ¹² La présente protocole est une version vidéo de Carpi et al. ¹³

Protocol

Une. Passivation de l'PDMS

1. Coupez un morceau de PDMS environ 35 mm x 20 mm à partir d'une feuille pré fait (par exemple, GelPak, comme répertoriés dans le tableau des matériaux).
2. Retirer le dessus et les couches de protection du bas du plastique (si nécessaire) et utiliser des pinces pour placer les PDMS dans un plastique (pas de culture cellulaire traité) boîte de Pétri.
3. Laver les PDMS à l'éthanol 70% pendant 5 min sur un rotateur à 30 oscillations / min.
4. Sécher la surface par un courant d'air sur elle.
5. Illuminez UV profond (λ = 180 nm) pendant 5 min à une distance des ampoules UV d'environ 5 cm (voir fiche Matériaux pour la référence de la lampe, les paramètres varient pour différentes lampes).
6. Préparer 200 pi de solution EDC / NHS pour chaque PDMS pièce (ce doit être préparé juste avant utilisation, car la réactivité de la solution se décompose en quelques heures). Pour 1 ml de 0,05 M MES + tampons NaCl 0,5 M à pH 6,0, ajouter 11,5 mg de sulfo-NHS et 19,2 mg d'EDC.
7. Transférer lePDMS feuilles à partir de la boîte de Petri vers le couvercle de la boîte de Pétri, qui n'a pas été allumé. Cela permet de s'assurer que l'environnement des PDMS sont très hydrophobes et de faciliter l'étape suivante.
8. Ajouter la solution EDC / NHS et incuber pendant 15 min à température ambiante.
9. Rincer EDC / NHS avec de l'eau.
10. Ajouter la solution de PLL-g-PEG (0,5 mg / ml dans de l'HEPES 10 mM pH 8,6) et incubation de 3 heures à une nuit à température ambiante.
11. Rincer le PLL-g-PEG avec de l'eau. PDMS passives (fonctionnalisés par PLL-g-PEG) peuvent être stockés pendant plusieurs jours à 4 ° C.

2. Structuration de la PDMS

1. Prenez une feuille de PDMS et le placer sur un photomasque de quartz synthétique portant les microcaractéristiques pour motif (voir la figure 1). Placez le côté PDMS portant le PLL-g-PEG face au côté chrome du photomasque.
2. Illuminer pendant 7 min à travers le photomasque à une certaine distance des ampoules UV d'environ 5 cm.
3. Ajouter de l'eau sur le masque + PDMS et éplucher les PDMS lentement le masque.
4. Incuber avec une solution de fibronectine à 50 mg / ml dans du tampon HEPES à pH 8,6 pendant 1 h à température ambiante. Il est possible d'utiliser d'autres protéines de la MEC, mais ceux-ci n'ont pas été testés avec ce protocole.
5. Rincer avec du PBS.

3. Montage du périphérique

1. Montez les PDMS auparavant passives sur le dispositif d'étirement (voir Discussion pour le dépannage).
   1. Fixer un côté des PDMS à la partie fixe de la civière.
   2. Fixer l'autre côté à la partie mobile de la civière sans trop serrer la feuille de PDMS.
2. Découpez un rectangle de PDMS (22 mm x 19 mm) dans un coup de PDMS d'épaisseur et couper un autre rectangle à l'intérieur afin d'avoir une piscine (ou cadre) qui va retenir les cellules et les médias (voir la figure 2).
3. Ajouter de la graisse de silicone sous ce PDMS piscine et placer sur le dessus de la feuille de PDMS pour créer un medium conservant piscine. La graisse permettra le glissement de la piscine sur la feuille PDMS pendant l'étirement.

4. Modeler les cellules

1. Détacher les cellules à partir d'un flacon de culture de confluence de 50% avec Versene.
2. Compter les cellules et remettre en suspension à une concentration de 200 000 cellules / ml.
3. Ajouter 1 ml de suspension de cellules dans la piscine (voir la discussion pour plus de détails).
4. Laisser les cellules se lient aux modes de 10 à 30 min (selon le type cellulaire, les cellules RPE-1 auront 10 minutes et les cellules HeLa 20 min).
5. Rincez délicatement les cellules flottantes avec un milieu équilibré (s'équilibrer moyen dans l'incubateur).
6. Laissez les cellules réparties pour quelques heures sur les modèles (RPE-1 aura besoin d'au moins 2 heures, les cellules HeLa devront 3 h).
7. Ajouter une lamelle sur le dessus de la piscine pour éviter les fuites d'évaporation et moyennes dans le cas où les PDMS pauses.
8. Mettre l'appareil sur un microscope inversé et commencer imagerie. Éviter l'utilisation de l'huile à immersion obtifs comme il ne fonctionnera pas en raison de problèmes de focalisation.

5. Étirage

1. Tourner la vis micrométrique tout en corrigeant la position de phase dans les directions x, y et l'axe z (x principalement). La position de phase doit être corrigé pour compenser l'élargissement des PDMS et la perte de concentration. (Voir «Pendant l'étirement" paragraphe de la discussion).

Representative Results

La technique présentée dans ce protocole vidéo a permis l'application de forces sur les fibres de rétraction de la mitose des cellules de mammifères. En effet, au cours de la division cellulaire, dans la phase mitotique des cellules de mammifères se rétractent pour prendre la forme d'une sphère et laisser derrière les câbles d'actine minces entourées de membrane qui sont fixés au substrat. Ces câbles (fibres de rétraction), sont la mémoire de la géométrie de la cellule avant d'entrer dans la division. Faire micropatterns avec UV profonde à travers un masque photographique sur le film mince de PDMS (Figure 1) a permis le contrôle géométrique de l'adhésion cellulaire. En étirant le substrat dès le début de la métaphase, certaines de ces fibres de rétraction ont été tirés à distance du corps de la cellule, ce qui entraîne un des forces mécaniques appliquées sur le cortex de la cellule mitotique (figure 3). Ces forces ont été montrés pour gouverner l'orientation de l'axe de la broche ^9.

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Figure 1. Quartz synthétique Photomask portant micropatterns caractéristiques.   A) photomasque typique utilisé pour la structuration profonde UV. Il s'agit d'un x 10 cm masque binaire de 10 cm et les caractéristiques sont typiquement d'environ 20 um de large pour produire un patron de cellules uniques, avec une résolution submicronique. Carrés visibles à l'oeil nu sont de la taille d'un champ de microscope objectif 10X de vue. Le blowup montre les caractéristiques correspondant à des motifs de cellules individuelles (ici disques). Caractéristiques sont transparents pour laisser UV profonds traversent. B) Le PDMS est appliquée sur le masque photographique tout en évitant soigneusement la formation de bulles. Du côté des PDMS passivée est en contact avec la partie métallique du photomasque. Les micropatterns seront imprimées sur tous les PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

Figure 2. La piscine.   Un pool PDMS est appliquée sur la feuille de PDMS. La graisse est couvrant le périmètre fond de la piscine. La capacité de la piscine est d'environ 2 ml de milieu. La piscine est remplie de milieu de culture (ici l'eau avec de la fluorescéine apparaît en jaune). Pour éviter l'évaporation, une lamelle peut être ajouté sur le dessus. Cliquez ici pour agrandir l'image .

A) Avant d'étirement. La cellule est plaqué sur un motif ovale. Pour cela, la structuration se fait avec les PDMS étant étirés lors de l'impression de motifs de ronds à travers le photomasque. Un photomasque ventilée est utilisé (l'élément de masque est d'environ 1,5 cm de diamètre). Pour éviter de tomber en panne un masque, utiliser un modèle ovale sur le photomasque et l'imprimer sur une feuille de PDMS non étiré. B) Après l'étirement. Le substrat est étiré comme le modèle devient un cercle. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Discussion

Bien que cette technique a été utilisée à de nombreuses reprises et est testé en profondeur, il ya plusieurs étapes critiques qui peuvent conduire à une expérience ratée.

A propos des PDMS:

Pour ce travail, GelPak, une feuille de PDMS mince disponible dans le commerce, a été utilisé. Sinon feuilles PDMS peuvent être lancés directement à partir de PDMS mélange. Nous vous recommandons d'utiliser GelPak parce qu'il est plus reproductible, et est moins susceptible de se briser par rapport à PDMS sur mesure.

A propos de l'appareil:

Le dispositif d'étirage utilisé dans ce protocole a été conçu "en interne", mais on peut aussi appliquer la technique de micromodelage sur des civières disponibles dans le commerce comme FlexCell. Les options faites sur commande sont plus polyvalents et beaucoup moins cher.

Montage de l'appareil:

Le montage des PDMS peut conduire à la rupture. Il est également facile d'inverser et il n'y a aucun moyen de dire de quel côté estqui. Si le PDMS est trop serré, il devient plus courte, ce qui peut conduire à la rupture (comme la tension sera plus élevée pour la même distance d'étirement). Assurez-vous que les vis sont bien serrées ou la feuille PDMS glissera dès que le tronçon commence ou plus tard au cours de l'expérience.

Ajout des cellules:

Pour détacher les cellules du substrat de culture, il est préférable d'utiliser de l'EDTA à 0,02% dans du PBS au lieu de trypsine. Utilisation EDTA permettra reconsolidation plus rapide des cellules sur les schémas. Lorsque les cellules sont ajoutées à du PDMS, ils doivent être bien séparés l'un de l'autre afin d'obtenir des cellules individuelles de liaison à la structure. Une fois qu'ils sont en suspension, la pipette plusieurs fois avec une pointe de 200 pi, ce qui va briser les agrégats. Environ 200.000 cellules doivent être ajoutés sur la surface de 4 cm ² afin d'avoir de liaison pour chaque modèle. Utilisez un petit volume de sorte que les cellules tombent rapidement sur la surface. S'il n'y a pas suffisamment de cellules, mdes modèles resteront vides. Les cellules non inscrits doivent être évacués par la suppression des médias dès que suffisamment de cellules sont liées aux modèles. Le temps avant que la chasse d'eau peut varier entre les différents types cellulaires, mais 15 minutes est généralement suffisante pour que les cellules commencent à se fixer aux schémas. Si les cellules sont laissées se fixer pendant trop longtemps, les modèles seront occupés par deux ou plusieurs cellules. Cette étape est décrite en ^13.

Au cours de l'étirement:

Soyez très prudent, tout en étirant, pour éviter de perdre la position de la région d'intérêt. En effet, au cours de l'étirement, les PDMS deviendront plus large, et la position de phase doit être réajusté pour compenser. Une combinaison d'un dispositif et le logiciel d'étirement contrôle motorisé de la scène peut être développé pour compenser automatiquement cet effet ^14. La civière manuel simple et polyvalent présenté ici peut être mis à niveau pour obtenir une telle compensation automatisé.

Le po PDMSol peut fuir si la graisse de silicium n'a pas été mis autour de la surface. Assurez-vous que l'installation est correctement scellé en mettant PBS à l'intérieur et à regarder pour toute fuite avant l'étalement des cellules sur elle.

Notre civière permet un tronçon d'environ 30%, mais brancards conçus sur mesure pourrait permettre un plus haut degré d'étirement. Soyez prudent car plus la souche est élevé, plus le risque de rupture de la couche de PDMS.

Limitations:

L'une des principales limitations dans la technique présentée ici est le manque de facilité automatique étirement / destretching l'aide d'un moteur. Néanmoins, il est possible d'adapter un dispositif d'actionnement à la place d'une vis micrométrique manuel. Cette mise en œuvre, couplé avec une programmation spécifique du contrôle de microscope peut permettre de compenser déplacement de l'échantillon lors de l'étirage.

Un autre inconvénient est la difficulté d'avoir l'imagerie haute résolution, parce que l'utilisation des objectifs à immersion d'huile dansduit les mouvements du substrat souple lorsque l'objectif se déplace trop rapidement. Ceci peut être résolu en utilisant de l'eau (mais l'évaporation est un problème pour les expériences à long terme) ou de l'huile très fluide.

Modifications et applications futures:

En collaboration avec Yanlan Mao et Nic Tapon du Cancer Research Institute (Londres, Royaume-Uni), nous avons développé une autre version de la civière qui permet à deux couches de PDMS sur le dessus de l'autre, avec l'échantillon étant dans le milieu, afin de pincer et étirer les tissus entiers.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141