Stretching-Cells auf einer mikrostrukturierten PDMS-Membran

Summary

Dieses Manuskript stellt eine Technik, um auf adhärenten Zellen oder Gewebe gelten oder freiKräfte mit unidirektionalen Stretching.

Abstract

Mechanische Kräfte auf Zellen ausgeübt und / oder Gewebe spielen eine wichtige Rolle in zahlreichen Prozessen. Wir haben ein Gerät an Zellen auf einer Polydimethylsiloxan (PDMS)-Membran, mit bildgebenden kompatibel vernickelt strecken entwickelt. Dieses Verfahren ist reproduzierbar und vielseitig. Die PDMS-Membran, um Zellen oder Gewebe zu einem bestimmten Geometrie beschränken mikrostrukturiert werden. Der erste Schritt ist die Mikrostrukturen auf den PDMS-Membran mit einem tiefen UV-Technik gedruckt. Die PDMS-Membran wird dann auf einer mechanischen Trage befestigt. Eine Kammer ist auf der Oberseite der Membran mit biokompatiblen Fett damit Gleiten während der Strecke gebunden. Die Zellen werden ausgesät und für mehrere Stunden auf den Mikro verbreiten. Die Probe kann mehrere Male unter Verwendung einer Mikrometerschraube gespannt und ungestreckte werden. Es dauert weniger als eine Minute, um die Strecke in vollem Umfang (rund 30%) anzuwenden. Die hier vorgestellte Technik nicht eine motorisierte Vorrichtung, die für eine erforderliche umfassenpplying wiederholter Dehnungszyklen schnell und / oder Computer-kontrolliertes Recken, aber dies kann realisiert werden. Dehnen von Zellen oder Gewebe kann von Interesse für die Fragen, um die Zellkräfte, Zell-Antwort gegen mechanische Beanspruchung oder Gewebemorphogenese bezogen werden. Diese Video-Präsentation wird zeigen, wie die typischen Probleme, die, wenn Sie diese Art von scheinbar einfachen Experiment entstehen könnten.

Introduction

Die Zellen Zusammensetzen eines Gewebe in höheren Organismen unterliegen mechanischen Spannungen und Dehnungskräfte kommen entweder von der äußeren Umgebung oder von umgebenden Zellen ^1,2. Die Zellen müssen sich anzupassen und zu widerstehen, diese Kräfte, um die Gewebeintegrität aufrecht zu erhalten. Solche Kräfte sind auch für Gewebe-Morphogenese während der Entwicklung ^3,4. Anwenden von mechanischen Kräften auf kultivierte Zellen ist ein Weg, zu imitieren, was in einem Gewebe passieren könnte, aber mit einer quantitativen und unabhängige Steuerung der Zellform und Zellverformung ^5,6. Hierzu könnten verschiedene Techniken verwendet werden. Man kann auf die Zellen (die ganze Zelle oder einen Teil davon), beispielsweise mit AFM oder Derivate ^7,8 oder strecken das Substrat die Zellen wachsen auf zu drücken.

Die in diesem Dokument beschriebenen Verfahren zeigt, wie ein Flugzeug Substrat mit Zellen plattiert dehnen. Auf m Diese Technik wurde ursprünglich entwickelt, um beurteilen die Rolle der Streitkräfte ausgeübtitotic Säugetierzellen ^9. Mitotische Zellen bleiben mit dem Substrat verbunden, durch Zurückziehen und Strecken der Fasern Membran ausgeübt wird, eine Kraft auf jene Fasern, die wiederum provozierte die Rotation der mitotischen Spindel. Das Interesse der Kombination von Klebstoff und Mikro Recken um eine unabhängige Steuerung von Kräften und Form der einzelnen Zellen zu erreichen. Es ist beispielsweise möglich, eine eiförmige Zelle in eine perfekt runde Form isotropen strecken, während einachsige Dehnung angewendet wird. Wenn die Zellen nicht auf Mikro geflochten, uniaxiales Strecken Ergebnisse in Zellstreckung, wobei die meisten Zellen, die ein mit dem Streckachse ausgerichtet langen Achse. Es ist dann schwierig, den Effekt der Ausrichtung der langen Achse und der Wirkung der Ausdehnung auf die Zellen zu trennen.

Das Gerät eignet sich für alle lebenden Zellen, einschließlich Langzeitablauf Fluoreszenz-Mikroskopie, und Medikamente können während des Experiments hinzugefügt werden. Die tiefe Mikrostrukturierungsverfahren ¹⁰ UVswurde im Detail in Azioune et al. ¹¹ Musterung auf PDMS wurde beschrieben in Azioune et al. ¹² Die vorliegende Streck Protokoll ist ein Video-Version Carpi et al. ¹³

Protocol

1. Passivierung der PDMS

1. Ein Stück des PDMS ca. 35 mm x 20 mm aus einer bereits geformten Folie (zum Beispiel GelPak, wie in der Tabelle aufgeführten Materialien).
2. Entfernen Sie die obere und die untere Schutzschichten aus Kunststoff (falls erforderlich) und mit Hilfe einer Pinzette, um die PDMS in einer Kunststoff legen (nicht zellkulturbehandelte) Petrischale.
3. Waschen Sie die PDMS mit 70% Ethanol für 5 Minuten auf einem Schüttler bei 30 Schwingungen / min.
4. Trocknen Sie die Oberfläche durch strömende Luft auf sie.
5. Illuminate mit tiefen UV (λ = 180 nm) für 5 min bei einem Abstand von den UV-Lampen von etwa 5 cm (siehe Materialien Blatt für Lampe Referenz; Parameter für verschiedene Lampen variieren).
6. Planen 200 ul EDC / NHS-Lösung für jedes Stück PDMS (muss unmittelbar vor der Verwendung hergestellt, da die Reaktivität der Lösung zerfällt in wenigen Stunden werden). Für 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl-Puffer bei pH 6,0, fügen 11,5 mg Sulfo-NHS und 19,2 mg EDC.
7. Übertragen Sie diePDMS Blätter von der Petrischale mit dem Deckel der Petrischale, die nicht belichtet worden ist. Dadurch wird sichergestellt, dass die Umgebung des PDMS sind sehr hydrophob und ermöglichen den nächsten Schritt.
8. In EDC / NHS-Lösung und Inkubation für 15 min bei Raumtemperatur.
9. Spülen EDC / NHS mit Wasser.
10. Hinzufügen PLL-g-PEG-Lösung (0,5 mg / ml in 10 mM HEPES pH 8.6) und Inkubation von 3 h bis über Nacht bei Raumtemperatur.
11. Spülen Sie die PLL-g-PEG mit Wasser. Passi PDMS (mit PLL-g-PEG funktionalisiert) kann für mehrere Tage bei 4 ° C gelagert werden

2. Strukturieren der PDMS

1. Nehmen Sie ein PDMS Blatt und legen Sie es auf einem synthetischen Quarzphotomaske tragen die Mikroformen zur Strukturierung (siehe Abbildung 1). Legen Sie die PDMS seitigen Lager die PLL-g-PEG mit Blick auf den Chrom Seite der Photomaske.
2. Beleuchten 7 Minuten durch die Photomaske in einem Abstand von der UV-Lampen von etwa 5 cm.
3. Fügen Sie Wasser auf die Maske + PDMS und schälen Sie die PDMS langsam aus der Maske.
4. Inkubieren mit Fibronectin-Lösung bei 50 mg / ml in HEPES-Puffer bei pH 8,6 für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Es ist möglich, andere ECM-Proteine ​​zu verwenden, aber diese sind nicht mit diesem Protokoll getestet.
5. Spülen mit PBS.

3. Das Gerät montieren

1. Montieren Sie die zuvor passivierten PDMS auf die Spannvorrichtung (siehe Diskussion zur Fehlersuche).
   1. Befestigen einer Seite des PDMS zu dem feststehenden Teil der Trage.
   2. Befestigen Sie die andere Seite mit dem Mobilteil der Trage ohne Spann zu viel von der PDMS Blatt.
2. Schneiden Sie ein Rechteck von PDMS (22 mm x 19 mm) in einer dicken PDMS Stich-und Schnitt ein weiteres Rechteck im Inneren, um einen Pool (oder Rahmen) haben, die die Zellen-und Medien behalten werden (siehe Abbildung 2).
3. In Silikonfett unter diese PDMS Pool und legen Sie es auf der PDMS-Blatt zu erstellen med.ium Haltebecken. Das Fett wird die Gleitfähigkeit des Pools über das PDMS Blatt beim Strecken zu ermöglichen.

4. Strukturieren der Zellen

1. Lösen Sie die Zellen aus einer 50% Konfluenz Kulturflasche mit Versene.
2. Zähle die Zellen zu resuspendieren und diese in einer Konzentration von 200.000 Zellen / ml.
3. 1 ml der Zellsuspension in den Pool (siehe Diskussion für weitere Details).
4. Sei (je nach Zelltyp, RPE-1-Zellen werden 10 min und HeLa-Zellen 20 min dauern) die Zellen zu binden, um die Muster für 10-30 min.
5. Vorsichtig spülen Sie die schwimmenden Zellen mit ins Gleichgewicht Medium (ins Gleichgewicht mittel Inkubator).
6. Lassen Sie die Zellen verteilt für ein paar Stunden auf die Muster (RPE-1 ist mindestens 2 Stunden brauchen, HeLa-Zellen wird 3 Stunden brauchen).
7. Fügen Sie ein Deckglas auf den Pool, um Verdunstung und mittlere Leckage bei der PDMS Pausen zu vermeiden.
8. Legen Sie das Gerät auf einem inversen Mikroskop und starten Bildgebung. Vermeiden Sie die Verwendung von Ölimmersion objectives, da es nicht durch Fokussierung Probleme funktionieren.

5. Dehnung

1. Die Mikrometerschraube drehen, während die Korrektur der Tischposition in x-, y-und z-Achse (hauptsächlich x). Die Bühnenposition muss korrigiert, die Erweiterung des PDMS und den Verlust des Fokus entgegenzuwirken. (Siehe "Bei der Strecke" Absatz in der Diskussion).

Representative Results

Die in diesem Video-Protokoll vorgestellte Technik erlaubt die Anwendung von Kräften auf die Rückzugs Fasern mitotischer Säugerzellen. In der Tat, während der Zellteilung, bei der mitotischen Phase, Säugetierzellen zurückziehen, um die Form einer Kugel nehmen und hinterlassen dünnen Aktin-Kabel von Membran umgeben, die auf dem Substrat befestigt sind. Diese Kabel (Rückzug Fasern), sind die Erinnerung an die Zellgeometrie, bevor er in Division. Machen Mikro mit tiefen UV durch eine Photomaske auf PDMS Dünnschicht (Abbildung 1) erlaubt die geometrische Steuerung der Zelladhäsion. Durch die Dehnung des Substrats zu Beginn der Metaphase, wurden einige dieser Fasern Rückzug aus dem Zellkörper gezogen, was zu einer auf der Rinde mitotischen Zelle (Abbildung 3) angelegten mechanischen Kräfte. Diese Kräfte wurden gezeigt, um die Ausrichtung der Spindelachse ⁹ zu regeln.

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Fig. 1 ist. Synthetische Quarzmikrofotomasken tragenden Funktionen.   A) Typische Photomaske für tiefe UV-Strukturierung eingesetzt. Es ist 10 cm x 10 cm binäre Maske und die Funktionen sind in der Regel von etwa 20 um breit für einzelne Zelle Musterung, mit einem Submikrometerauflösung. Quadrate mit bloßem Auge sichtbar sind von der Größe eines Mikroskop 10X-Objektiv Sichtfeld. Die blowUP zeigt die Merkmale entsprechend einzelne Zelle Muster (hier Discs). Features sind transparent, lassen tief UVs passieren. B) Die PDMS ist auf der Fotomaske aufgebracht, während sorgfältig Vermeidung der Bildung von Blasen. Die passi PDMS Seite in Kontakt mit der metallischen Seite der Photomaske. Die Mikro werden alle in den PDMS gedruckt werden.g1highres.jpg "target =" _blank "> Klicken Sie hier für eine größere Ansicht.

2. Der Pool.   Ein PDMS Pool befindet sich auf der PDMS-Folie aufgebracht. Fett ist für den unteren Bereich des Pool. Die Kapazität des Pool etwa 2 ml Medium. Der Pool ist mit Kulturmedium gefüllt (hier Wasser mit Fluorescein erscheint in gelb). Um Verdunstung zu vermeiden, kann ein Deckglas auf hinzugefügt werden. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

A) Vor Stretching. Die Zelle wird auf einem ovalen Muster plattiert. Um dies zu erreichen, wird die Strukturierung mit PDMS während der Eindruck runden Muster durch die Photomaske gestreckt geführt. Ein aufgeschlüsselt Photomaske verwendet wird (das Stück Maske ist ca. 1,5 cm im Durchmesser). Um den Abbau einer Maske zu vermeiden, verwenden eine ovale Muster auf der Photomaske und drucken Sie es auf einem nicht gedehnten PDMS Blatt. B) Nach dem Stretching. Das Substrat wird gestreckt, wie das Muster ein Kreis. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht .

Discussion

Obwohl diese Technik wurde mehrfach verwendet und wird gründlich getestet, gibt es mehrere kritische Schritte, die zu einem fehlgeschlagenen Experiment führen kann.

Über die PDMS:

Für diese Arbeit GelPak ein handelsüblicher Dünn PDMS Blatt, verwendet. Alternativ PDMS Blätter können direkt von PDMS-Mischung gegossen werden. Wir empfehlen die Verwendung GelPak, weil es mehr reproduzierbar, und ist weniger wahrscheinlich zu brechen Vergleich zu maßgeschneiderten PDMS.

Über das Gerät:

Die Streckvorrichtung in diesem Protokoll verwendet wurde "im Haus" konzipiert, aber man kann auch die Mikrostrukturierung Technik anzuwenden auf handelsüblichen Kranken wie Flexcell. Maßgeschneiderte Optionen sind vielseitiger und viel billiger.

Gerätemontage:

Die Montage der PDMS kann zum Bruch führen. Es ist auch einfach, sie zu invertieren und es gibt keine Möglichkeit zu erkennen, welche Seitewas. Wenn das PDMS zu stark gespannt, sie wird kürzer, und dies kann zu Bruch führen (da die Spannung grßer für die gleiche Entfernung von Dehnungs sein). Achten Sie darauf, die Schrauben fest angezogen sind oder die PDMS Blatt wird so schnell wie die Strecke beginnt oder später während des Experiments rutschen.

Zugabe der Zellen:

Zum Ablösen der Zellen von dem Kultursubstrat, ist es besser, 0,02% EDTA in PBS anstelle von Trypsin verwendet. Mit EDTA wird schneller erneute Bindung der Zellen auf die Muster zu ermöglichen. Wenn die Zellen zu den PDMS hinzugefügt, müssen sie gut voneinander um einzelne Zellen die Bindung an das Muster zu erhalten getrennt werden. Sobald sie in der Schwebe sind, pipettieren sie mehrmals mit einer 200 ul Spitze, das wird Aggregate aufzubrechen. Über 200.000 Zellen müssen auf die 4 cm ² Oberfläche, um Bindung zu jedem Muster zu haben, hinzugefügt werden. Mit einem kleinen Volumen, so fallen die Zellen schnell auf die Oberfläche. Wenn es nicht genügend Zellen, mirgendwelche Muster wird leer bleiben. Die nicht anhaftenden Zellen müssen von Medienentnahme sobald genügend Zellen zu den Mustern gebunden gespült werden. Die Zeit vor der bündig zwischen Zelltypen variieren, aber 15 min ist im allgemeinen ausreichend für die Befestigung an den Zellen-Muster zu beginnen. Wenn die Zellen links zu lange zu befestigen, werden Muster, die durch 2 oder mehr Zellen besetzt werden. Dieser Schritt ist in ¹³ beschrieben.

Während der Strecke:

Seien Sie besonders vorsichtig, während Stretching, um zu vermeiden, verlieren die Position der Region von Interesse. In der Tat, während der Strecke, werden die PDMS werden breiter, und die Bühne Position muss neu justiert, um auszugleichen. Eine Kombination aus einem motorisierten Spannvorrichtung und Softwaresteuerung der Stufe entwickelt werden, um automatisch für diesen Effekt ¹⁴ zu kompensieren. Die einfache und vielseitige Hand Trage hier vorgestellten aufgerüstet werden, um solche automatisierten Ausgleich zu erzielen.

Die PDMS-pool können auslaufen, wenn die Silikonfett nicht richtig auf der Oberfläche platziert. Stellen Sie sicher, das Setup richtig, indem PBS innen und gerade für jeden Leck vor dem Beschichten Zellen darauf versiegelt.

Unsere Trage ermöglicht eine Strecke von etwa 30%, aber kundenspezifische Bahren könnten für einen höheren Grad der Streckung zu ermöglichen. Seien Sie vorsichtig, je höher die Belastung, desto höher ist das Risiko der PDMS-Schicht brechen.

Einschränkungen:

Eine der Haupteinschränkungen bei der hier vorgestellten Technik ist das Fehlen einer einfachen automatischen Dehnen / destretching Verwendung eines Motors. Dennoch ist es möglich, ein Stellglied statt einer manuellen Mikrometerschraube anzupassen. Diese Implementierung, verbunden mit einem spezifischen Programmierung des Mikroskopsteuerung kann Entschädigung für die Proben Verschiebung beim Strecken zu ermöglichen.

Ein weiterer Nachteil ist die Schwierigkeit, hochauflösende Bildgebung, da die Verwendung von Ölimmersionsobjektive inproduziert Bewegungen des weichen Untergrund, wenn das Ziel bewegt sich zu schnell. Dies kann mit Wasser gelöst werden (dann aber Verdunstung ist ein Thema für die Langzeitversuche) oder sehr flüssige Öl.

Änderungen und zukünftige Anwendungen:

In Zusammenarbeit mit Yanlan Mao und Nic Tapon vom Cancer Research Institute (London, UK), entwickelten wir eine andere Version der Bahre, die zwei Schichten von PDMS auf der jeweils anderen ermöglicht, wobei die Probe in der Mitte, um zu kneifen und strecken ganze Gewebe.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141