מתיחת תאי micropatterned בממברנה PDMS

Summary

כתב יד זה מציג טכניקה כדי להחיל או לשחרר כוחות על תאים או רקמות חסיד באמצעות מתיחה חד כיווני.

Abstract

כוחות מכאניים המופעלים על תאים ו / או רקמות לשחק תפקיד מרכזי בתהליכים רבים. פיתחנו מכשיר למתוח תאים מצופים בpolydimethylsiloxane קרום (PDMS), תואם עם הדמיה. טכניקה זו ניתנת לשחזור ותכליתי. קרום PDMS ניתן micropatterned כדי להגביל את התאים או רקמות לגיאומטריה ספציפית. הצעד הראשון הוא להדפיס micropatterns על הממברנה PDMS עם טכניקת UV עמוקה. קרום PDMS מותקן אז על אלונקה מכאנית. תא חייב על גבי הקרום עם גריז ביולוגית כדי לאפשר גלישה במתיחה. התאים הם זורעים ואפשרו להפיץ לכמה שעות על micropatterns. המדגם יכול להיות מתוח וunstretched מספר פעמים עם השימוש בבורג micrometric. זה לוקח פחות מדקה כדי להחיל את המתיחה לכל אורכו (בסביבות 30%). הטכניקה המוצגת כאן אינה כוללת מכשיר ממונע, אשר הוא הכרחי עבורpplying מחזורי מתיחה חוזרים ונשנים במהירות ו / או בשליטת מחשב מתיחה, אבל יכול להיות מיושם זה. מתיחה של תאים או רקמות יכולות להיות עניין לשאלות הקשורות לכוחות תא, בתגובת תא ללחץ מכאני או המורפוגנזה רקמות. מצגת וידאו זה יראה איך להימנע מבעיות אופייניות שעלולות להתעורר כאשר אתה עושה את זה סוג של ניסוי פשוט לכאורה.

Introduction

התאים המרכיבים את רקמות באורגניזמים גבוהים יותר כפופים למתחים מכאניים וכוחות המתיחה מגיעים גם מהסביבה החיצונית או מהתאים המקיפים את ^1,2. תאים חייבים להסתגל ולהתנגד לכוחות הללו על מנת לשמור על שלמות רקמה. כוחות כאלה הם גם חשובים עבור המורפוגנזה רקמות במהלך ^3,4 פיתוח. החלת כוחות מכאניים על תאים בתרבית היא דרך לחקות את מה שעלול לקרות ברקמה, אבל עם שליטה כמותיים ועצמאית של צורת התא ^ו5,6 עיוות תא. לשם כך, עשויות לשמש במספר טכניקות. אפשר ללחוץ על התאים (התא כולו או חלק ממנו), למשל באמצעות AFM או נגזרי ^7,8 או למתוח את מצע התאים גדלים על.

השיטה המתוארת במאמר זה מדגימה כיצד למתוח מצע מטוס מצופה בתאים. טכניקה זו פותחה במקור כדי להעריך את התפקיד של כוחות המופעלים על מ 'תאי יונקים itotic ^9. תאי mitotic להישאר מחוברים למצע דרך סיבי הכחשה ומותחים את הקרום שהפעילו כוח על אלה סיבים, אשר בתורו עורר את הסיבוב של ציר mitotic. העניין של שילוב micropatterns דבק ומתיחה הוא להשיג שליטה עצמאית של כוחות וצורה של תאים בודדים. זה למשל אפשר למתוח תא ביצה לצורה עגולה איזוטרופיים בצורה מושלמת, תוך מתיחת uniaxial מוחלת. אם התאים אינם קלועים בmicropatterns, uniaxial מתיחת תוצאות בהתארכות תא, עם רוב התאים שיש ציר ארוך מיושר עם ציר המתיחה. קשה לאחר מכן להפריד את ההשפעה של יישור ציר זמן ואת ההשפעה של המתיחה מוחלת על התאים.

המכשיר מתאים לכל הדמיה תא חי, הכולל מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשגות זמן רב, וניתן להוסיף תרופות במהלך הניסוי. שיטת micropatterning יובס העמוקה ¹⁰תואר בפירוט בAzioune et al. ¹¹ דפוסים על PDMS תוארו בAzioune et al. ¹² הווה מתיחת פרוטוקול הוא גרסת וידאו של קארפי et al. ¹³

Protocol

1. פסיבציה של PDMS

1. חותכי חתיכה של PDMS כ 35 מ"מ x 20 מ"מ מגיליון שהוכן מראש (למשל, GelPak, כפי שמופיע בטבלה של חומרים).
2. הסר את החלק העליון ושכבות מגן התחתונה של פלסטיק (במידת צורך) ולהשתמש בפינצטה כדי למקם את PDMS בפלסטיק (לא תא התרבות שטופלה) צלחת פטרי.
3. שטוף את PDMS עם אתנול 70% למשך 5 דקות על הכתף ב30 תנודות / דקה.
4. ייבש את פני השטח על ידי זורם אוויר על זה.
5. להאיר עם UV העמוק (λ = 180 ננומטר) במשך 5 דקות במרחק מנורות UV של כ -5 ס"מ (ראה גיליון חומרים למנורת התייחסות; פרמטרים ישתנו למנורות שונות).
6. הכן 200 μl של פתרון EDC / NHS עבור כל PDMS חתיכה (זה חייב להיות מוכן רק לפני השימוש בגלל תגובתיות של הפתרון דועכת בעניין של שעות). עבור 1 מיליליטר של 0.05 M MES + 0.5 חיץ M NaCl ב-pH 6.0, להוסיף 11.5 מ"ג sulfo-NHS ו19.2 מ"ג של EDC.
7. העברPDMS גיליונות מצלחת פטרי למכסה של צלחת פטרי, שלא היה מוארת. זה יבטיח כי הסביבה של PDMS מאוד הידרופובי ולהקל על השלב הבא.
8. הוספת פתרון EDC / NHS ודגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר.
9. יש לשטוף EDC / NHS עם מים.
10. הוספת פתרון PLL-G-PEG (0.5 מ"ג / מיליליטר בHEPES pH 10 מ"מ 8.6) ו דגירה מהשעה 3 בלילה בטמפרטורת חדר.
11. יש לשטוף את PLL-G-PEG עם מים. PDMS פסיבציה (פונקציונליות עם PLL-G-PEG) יכול להיות מאוחסן במשך כמה ימים ב 4 ° C.

2. דפוסים של PDMS

1. קח דף PDMS ולמקם אותו על photomask קוורץ סינטטי הנושא את microfeatures לדפוסים (ראה איור 1). הנח את צד PDMS הנושא את PLL-G-PEG מול צד הכרום של photomask.
2. להאיר למשך 7 דקות באמצעות photomask במרחק מנורות UV של כ -5 ס"מ.
3. מוסיף מים על המסכה + PDMS ולקלף את PDMS לאט את המסכה.
4. דגירה עם פתרון פיברונקטין ב50 מ"ג / מיליליטר במאגר HEPES ב-pH 8.6 במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר. אפשר להשתמש באחרים חלבוני ECM, אבל אלה לא נבדקו עם פרוטוקול זה.
5. יש לשטוף עם PBS.

3. הרכבה ההתקנים

1. הר PDMS פסיבציה בעבר על מכשיר המתיחה (ראה דיון לפתרון בעיות).
   1. צרף צד אחד של PDMS לחלק הקבוע מהאלונקה.
   2. תקן את הצד השני לחלק הנייד של האלונקה ללא הידוק רב מדי של גיליון PDMS.
2. לחתוך מלבן של PDMS (22 מ"מ x 19 מ"מ) בדקירת PDMS עבה וחתך מלבן אחר בתוך כדי שתהיה בריכה (או מסגרת) שיישמר על התאים ותקשורת (ראה איור 2).
3. להוסיף גריז סיליקון תחת זה PDMS בריכה ולמקם אותו על גבי גיליון PDMS ליצור medium שמירה על בריכה. הגריז יאפשר הגלישה של הבריכה מעל גיליון PDMS במהלך מתיחה.

4. דפוסי התאים

1. לנתק את התאים מ50% בקבוק תרבות confluency עם Versene.
2. ספירת תאי resuspend אותם בריכוז של 200,000 תאים / מיליליטר.
3. הוסף 1 מיליליטר של השעיה תא בבריכה (ראה דיון לפרטים נוספים).
4. בואו התאים להיקשר לדפוסים ל10-30 דקות (תלוי בסוג התא, הרשתית-1 תאים ייקחו 10 דקות ותאי הלה 20 דקות).
5. בעדינות לשטוף את התאים הצפים עם מדיום equilibrated (לאזן בינוני בחממה).
6. בואו התאים התפשטו לכמה שעות על הדפוסים (RPE-1 יצטרך לפחות 2 שעות; תאי הלה יצטרכו 3 שעות).
7. הוספת coverslip על גבי הבריכה כדי למנוע דליפת אידוי ובינוני במקרה הפסקות PDMS.
8. שים את המכשיר על מיקרוסקופ הפוכה ולהתחיל הדמיה. הימנע משימוש באוב טבילת שמןjectives כפי שהוא לא יעבוד בשל בעיות מיקוד.

5. מתיחה

1. סובב את בורג micrometric תוך תיקון מיקום הבמה בx-, (בעיקר x) y-, וציר ה-z. מיקום הבמה צריך להיות מתוקן כדי לנטרל את הרחבת PDMS ואובדן המיקוד. (ראה "במתיחה" הפסק בדיון).

Representative Results

הטכניקה שהוצגה בפרוטוקול וידאו זה אפשר את היישום של כוחות על סיבי ההכחשה של תאי יונקים mitotic. ואכן, במהלך חלוקת תא, בשלב mitotic, תאי יונקים לחזור לקחת את הצורה של כדור ולהשאיר מאחור כבלים אקטין דקים מוקפים בקרום אשר מחוברים למצע. כבלים אלו (סיבי הכחשה), הם הזיכרון של הגיאומטריה התא לפני שהוא הולך לחטיבה. ביצוע micropatterns עם UV העמוק דרך photomask על סרט דק PDMS (איור 1) אפשר שליטה הגיאומטרית של הידבקות תא. על ידי מתיחת המצע בתחילת metaphase, חלק מסיבי הכחשה אלה התרחקו מהגוף התא, וכתוצאה מכך כוחות מכאניים מוחלים על הקורטקס של התא mitotic (איור 3). כוחות אלה הוצגו למשול את הכיוון של ציר הציר ^9.

gure 1 "עבור: תוכן width =" 6in "עבור: src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "width =" "/> 600px
איור 1. סינתטית קוורץ Photomask נושאת תכונות micropatterns.   א) photomask אופייני המשמש לדפוסי UV עמוקים. זוהי מסכת ינארי סנטימטר 10 10 ס"מ X והתכונות הן בדרך כלל של כ -20 מיקרומטר רחב לדפוסי תא בודדים, עם רזולוציה submicron. ריבועים גלויים על ידי עין בלתי מזוינת הם בגודל של שדה המיקרוסקופ אובייקטיבי 10X מבט. הפיצוץ מראה את התכונות המתאימות לדפוסי תא בודדים (כאן דיסקים). תכונות הן שקופות כדי לאפשר יובס עמוק לעבור. B) PDMS מוחל על photomask תוך הימנעות היווצרותן של בועות בזהירות. צד PDMS פסיבציה הוא במגע עם הצד המתכתי של photomask. Micropatterns יודפס בכל רחבי PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 2. הבריכה.   בריכת PDMS מוחלת על גיליון PDMS. גריז מכסה היקפי קרקעית הברכה. הקיבולת של הבריכה היא כ 2 מיליליטר של תקשורת. הבריכה מלאה במדיום התרבות (כאן מים עם העמסה מופיעים בצהוב). כדי למנוע אידוי, coverslip ניתן להוסיף על גבי. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

PDMS) לפני המתיחה. התא מצופה על תבנית סגלגלה. כדי להשיג זאת, הדפוסים נעשה עם PDMS להיות מתוח במהלך הרושם של דפוסי סיבוב דרך photomask. משמש photomask מתפרק (חתיכת המסכה היא כ -1.5 סנטימטר קוטר). כדי להימנע מפירוק מסיכה, השתמש דפוס סגלגל על photomask ולהדפיס אותו על גיליון PDMS unstretched. ב) לאחר המתיחה. המצע נמתח כגון הדפוס הופך למעגל. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Discussion

למרות שטכניקה זו נעשתה שימוש פעמים רבות ונבדקה ביסודיות, ישנם מספר שלבים קריטיים שיכול להוביל לניסוי נכשל.

אודות PDMS:

לעבודה זו, GelPak, גיליון דק PDMS זמין מסחרי, היה בשימוש. לחלופין ניתן להטיל גיליונות PDMS ישירות מתערובת PDMS. אנו ממליצים להשתמש GelPak כי זה שחזור יותר, ופחות סביר לשבור לעומת PDMS בהתאמה אישית.

אודות המכשיר:

מכשיר המתיחה בשימוש בפרוטוקול זה תוכנן "בבית", אבל אפשר גם ליישם את טכניקת micropatterning על אלונקות זמינות מסחרי כמו FlexCell. אפשרויות מותאמות אישית שנעשו הן מגוונות יותר והרבה יותר זולות.

הרכבה המכשיר:

ההרכבה של PDMS יכולה להוביל לשבירה. זה גם קל כדי להפוך אותו ואין שום דרך לדעת באיזה צד הואאשר. אם PDMS הוא הידק יותר מדי, הוא הופך להיות קצר יותר וזה יכול להוביל לשבירה (כמו המתח יהיה גדול יותר עבור אותו המרחק של מתיחה). ודא שהברגים הם הידקו או גיליון PDMS יגלוש בהקדם המתיחה מתחילה או בשלב מאוחר יותר במהלך הניסוי היטב.

הוספת התאים:

לניתוק התאים ממצע התרבות, עדיף להשתמש EDTA 0.02% ב-PBS ולא טריפסין. באמצעות EDTA יאפשר rebinding מהיר יותר של התאים בדפוסים. כאשר תאים מתווספים PDMS, הם חייבים להיות מופרדים היטב אחד מהשני על מנת להשיג תאים בודדים מחייבים לדפוס. ברגע שהם נמצאים בהשעיה, פיפטה כמה פעמים עם טיפ μl 200, זה ישבור את אגרגטים. כ -200,000 תאים יש להוסיף על גבי משטח 4 סנטימטר ² על מנת שיהיה מחייב לכל תבנית. השתמש בנפח קטן כל כך התאים ליפול במהירות על גבי המשטח. אם אין מספיק תאים, מ 'כל דפוסים יישארו ריקים. התאים המצורפים שאינם חייבים להיות סמוקים החוצה על ידי הסרת תקשורת ברגע שמספיק תאים מחויבים לדפוסים. הזמן עד שהסומק יכול להשתנות בין סוגי תאים אך 15 דקות היא בדרך כלל מספיק לתאים להתחיל מצרפים לדפוסים. אם התאים נשארים לצרף ליותר מדי זמן, דפוסים יהיו תפוסים על ידי 2 או יותר תאים. צעד זה מתואר ^ב13.

במהלך הקטע:

להיות זהיר במיוחד, תוך מתיחה, כדי להימנע מאיבוד מעמדו של האזור של עניין. ואכן, במתיחה, PDMS יהפוך רחב יותר, ואת מיקום הבמה צריך להיות וסידרה כדי לפצות. שילוב של ממונע בקרת התקנים ותוכנות מתיחה של השלב ניתן לפתח כדי לפצות באופן אוטומטי לאפקט הזה ^14. האלונקה הידנית הפשוטה ותכליתית שהוצגה כאן ניתן לשדרג על מנת להשיג פיצוי אוטומטי מסוג זה.

פו PDMSol יכול לדלוף אם גריז סיליקון לא הונח כראוי סביב פני השטח. ודא שההגדרה היא חתומה כראוי על ידי לשים את PBS בפנים וצופה לכל דליפה לפני תאי ציפוי על זה.

האלונקה שלנו מאפשרת מתיחה של כ -30%, אבל אלונקות מעוצבות אישית עלולות לאפשר לדרגה גבוהה יותר של מתיחה. היזהר כגבוה יותר המתח, גבוה יותר הוא הסיכון לשבירת שכבת PDMS.

מגבלות:

אחת המגבלות העיקריות בטכניקה המוצגת כאן הוא חוסר מתיחה / destretching האוטומטי קל באמצעות מנוע. אף על פי כן, זה אפשרי להתאים את מפעיל במקום בורג micrometric ידני. יישום זה, יחד עם תיכנות מסוימות של שליטת מיקרוסקופ יכול להרשות לפיצוי בגין עקירת מדגם במהלך מתיחה.

חסרון נוסף הוא הקושי שיש הדמיה ברזולוציה גבוהה, משום שבאמצעות טבילת מטרות נפט בתנועות duces של המצע הרך כאשר המטרה נעה מהר מדי. זה ניתן לפתור באמצעות מים (אבל אז אידוי הוא בעיה עבור ניסויים לטווח ארוך) או שמן מאוד נזיל.

שינויים ויישומים עתידיים:

בשיתוף פעולה עם Yanlan מאו וניק Tapon מסרטן מכון המחקר (לונדון, אנגליה), שפיתחנו גרסה אחרת של את האלונקה שמאפשרת לשתי שכבות של PDMS על גב אחד את השני, עם המדגם להיות באמצע, כדי לצבוט ולמתוח את כל הרקמות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141