PDMS膜上のマイクロパターン細胞を伸ばす

Summary

この原稿は、単方向ストレッチを使用して接着細胞または組織に力を適用したり、解放する手法を提示します。

Abstract

機械的力は、細胞に作用するおよび/または組織は、多くのプロセスにおいて重要な役割を果たしている。私たちは、イメージングと互換性ポリジメチルシロキサン（PDMS）膜上で平板培養した細胞を伸ばすためのデバイスを開発した。この手法は、再現性があり、汎用性があります。 PDMS膜は、特定の形状に細胞または組織を閉じ込めるために微細化することができる。最初のステップは、ディープUV技術とPDMS膜上に微細パターンを印刷することである。 PDMS膜は、次いで、機械的なストレッチャーに取り付けられている。室は、ストレッチの際に滑走できるように生体適合性グリース膜の上にバインドされています。細胞は播種し、微細パターン上の数時間広めるために許可されています。サンプルは、マイクロメータねじを用いて複数回延伸·未延伸することができる。それは、その全容（約30％）にストレッチを適用する分もかかります。ここで紹介するテクニックはために必要な電動式の装置が含まれていません迅速および/またはコンピュータ制御された延伸繰り返し延伸サイクルをpplyingが、これは実現することができる。細胞または組織の延伸は、細胞力、機械的なストレスや組織形態形成に対する細胞応答に関連した質問の対象となることができます。このビデオプレゼンテーションでは、一見シンプルなこのタイプの実験を行うときに発生する可能性のある一般的な問題を回避する方法を紹介します。

Introduction

高等生物の組織を構成する細胞は、機械的緊張にさらされ、外部環境からか、周囲の細胞^の1,2のいずれかから来る力を伸ばす。細胞は、に適応し、組織の完全性を維持するためにこれらの力に耐えなければならない。そのような力は、開発中に^3,4の組織形態形成のためにも重要である。培養細胞に対する機械的な力を適用すると、組織内で何が起こるか模倣する方法ですが、細胞形状および細胞変形^5,6の定量的かつ独立したコントロール機能を備えています。このために、いくつかの技術が使用されてもよい。一つは、AFMまたはその誘導体^7,8を使用して、たとえば、細胞（全細胞またはその一部）に押したり、細胞が上に成長している基板を伸ばすことができます。

このホワイトペーパーで説明する方法は、細胞でメッキ面基板をストレッチする方法を示しています。この技術は、元々m個に作用する力の役割を評価するために開発されたitotic、哺乳動物細胞^9。有糸分裂細胞は、引込みファイバを介して基板への接続を維持し、膜を延伸は今度は紡錘体の回転を引き起こし、これらの繊維に力を発揮した。接着マイクロパターンを組み合わせて、延伸の関心が力と個々の細胞の形状の独立した制御を達成することである。一軸延伸が適用されている間、それは、完全に等方性の丸い形状に卵形細胞を伸ばすために、例えば、可能である。細胞が微細にplattedされていない場合、ほとんどの細胞は一軸延伸軸と一致長軸を有する、細胞伸長における結果を延伸する。それは長い軸調整や細胞に適用し、ストレッチの効果の影響を分離することが、その後は難しい。

デバイスは、長い時間経過蛍光顕微鏡法を含む任意の生細胞イメージングのために適しており、薬物は、実験中に添加することができる。深いUVの用微細法¹⁰ら Aziouneに詳細に記載した。PDMS上¹¹パターニングがAzioune らに記載された^。12プロトコルを伸ばし存在カルピらのビデオ版です^。13

Protocol

1。 PDMSの不動態化

1. あらかじめ作られたシート（材料の表に示すように、たとえば、GelPak、）からのX 20ミリメートルのPDMSが約35ミリメートルの部分をカット。
2. プラスチックの上部と下部の保護層を除去（必要な場合）、ペトリ皿（処理した培養を細胞ではない）は、プラスチックに、PDMSを配置するためにピンセットを使用しています。
3. /分30振動で回転装置上で5分間、70％エタノールで、PDMSを洗ってください。
4. その上に空気を流すことにより、表面を乾燥させます。
5. 約5cmのUVバルブからの距離で5分間、深紫外（λ= 180 nm）をして点灯（ランプリファレンスのための材料のシートを参照してください。パラメータは、異なるランプに異なります）。
6. 各PDMSピース用EDC / NHS溶液200μlを準備し（溶液の反応性が時間のうちに崩壊するので、これは使用直前に調製しなければならない）。 pH6.0の0.05MのMES + 0.5 M NaCl緩衝液の1ミリリットルの場合は、スルホ-NHSの11.5 mgおよびEDCを19.2ミリグラムを追加します。
7. 転送照らされていないペトリ皿の蓋にペトリ皿からのPDMSシート。これはPDMSの周囲が非常に疎水性であることを確認して、次のステップを容易にするであろう。
8. EDC / NHS溶液を添加し、室温で15分間インキュベートする。
9. 水とEDC / NHSを洗浄します。
10. PLL-gの PEG-溶液（10mMのHEPES pHが8.6で0.5 mg / ml）を添加し、室温で一晩に3時間のインキュベート。
11. 水でPLL-G-PEGを洗浄します。 （PLL-gの -PEGで官能化された）不動態化されたPDMSは、4℃で数日間保存することができる

2。 PDMSのパターン化

1. PDMSシートを取り、パターニング微小特徴を有する合成石英フォトマスクの上に置き（ 図1を参照）。フォトマスクのクロム側にPLL-G-PEGをもつPDMS側に配置します。
2. 約5cmのUVバルブから距離を置いて、フォトマスクを介して7分間点灯します。
3. マスク+ PDMS上に水を加え、徐々にマスクオフPDMSを剥離。
4. 室温で1時間、pH8.6のHEPESで緩衝液中に50 mg / mlのフィブロネクチン溶液でインキュベートする。それは、他のECMタンパク質を使用することが可能であるが、これらはこのプロトコルで試験されていない。
5. PBSですすいでください。

3。デバイスの取り付け

1. ストレッチングデバイスに以前に不動態化されたPDMSをマウント（トラブルシューティングのための議論を参照）。
   1. ストレッチャの固定部分にPDMSの1側を接続してください。
   2. PDMSシートのあまりをクランプすることなく、ストレッチャの可動部分に反対側を固定します。
2. 厚手のPDMS刺しにPDMSの長方形（22ミリメートルX 19ミリメートル）をカットします（ 図2を参照）細胞および培地を保持し、プール（またはフレーム）を持つために内部に別の四角形を切った。
3. この下にシリコーングリースを追加し、プールをPDMSおよびMEDを作成するために、PDMSシートの上部に配置しますイウムは、プールを保持。グリースは、延伸時のPDMSシート上のプールの滑空が可能になります。

4。細胞のパターニング

1. ベルセンと50％の集密度の培養フラスコから細胞を剥離。
2. 細胞を計数し、200,000細胞/ mlの濃度で再懸濁します。
3. （詳細は、説明を参照）、プール内の細胞懸濁液の1ミリリットルを追加します。
4. 細胞が10〜30分間のパターンに結合する（細胞型に応じて、RPE-1細胞を20分間、10分間およびHeLa細胞がかかります）にしよう。
5. 静かに平衡化した培地（培養器内の媒質を平衡化）で浮遊細胞を洗い流す。
6. （RPE-1は、少なくとも2時間が必要になります。HeLa細胞を3時間が必要になります）、細胞がパターンにはいくつかの時間のために普及してみよう。
7. PDMSの改場合の蒸発とメディア漏れを回避するために、プールの上にカバースリップを追加します。
8. 倒立顕微鏡上のデバイスを入れて撮影開始。油浸OBの使用を避けるそれが原因で問題が焦点に動作しませんようにjectives。

5。ストレッチング

1. x軸、y軸、z軸（主にX）で​​のステージ位置を補正しながらマイクロメータネジを回します。ステージ位置は、PDMSの拡大、焦点の損失を打ち消すために補正する必要がある。 （議論では段落「ストレッチ中に」を参照してください）​​。

Representative Results

このビデオプロトコルで提示技術は、有糸分裂、哺乳動物細胞の収縮繊維に力を加えることを可能にした。実際に、細胞分裂の間、有糸分裂の段階では、哺乳動物細胞は、球体の形状をとると、基板に取り付けられた膜で囲まれた細いアクチンケーブルを残すように後退させる。これらのケーブル（後退繊維）、除算に入る前にセル形状のメモリである。 PDMS薄膜上にフォトマスクを通してUV深い有する微細パターンを作製する（ 図1）は、細胞接着の幾何学的な制御を可能にした。中期の開始時に、基板を延伸して、これらの引込み繊維の一部は、有糸分裂細胞の皮質（ 図3）上に塗布機械的な力をもたらす離れる細胞体から引っ張った。これらの力は、スピンドル軸⁹の方向を支配することが示された。

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図1。微細パターンの特徴を保有する合成石英フォトマスク。  深UVパターニングに使用されるA）の代表的なフォトマスク。それを10cm×10cmのバイナリマスクであり、機能には、サブミクロンの分解能で単一細胞のパターニングのために典型的には約20μm幅のものである。肉眼で見える四角は、ビューの10倍の顕微鏡対物フィールドのサイズです。爆発は、単一のセルパターン（ここではディスク）に対応する機能を示しています。特徴は、深いUVが通過させるために透明である。B）を慎重に気泡の形成を回避しながら、PDMS、フォトマスク上に適用される。不動態化されたPDMS側は、フォトマスクの金属面と接触している。微細パターンは、すべてのPDMS上に印刷されます。g1highres.jpg "ターゲット=" _blank ">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。

図2。プール。   PDMSプールはPDMSシート上に塗布される。グリースはプールの底の周囲を覆っている。プールの容量は、媒体の約2 mlである。プールは、培養培地が充填されている（ここでは、フルオレセインを有する水は、黄色で表示されます）。蒸発を避けるために、カバーガラスを上に追加することができます。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

A）上のマイクロパターンRPE-1細胞の位相コントラスト画像。セルは楕円形のパターンの上にめっきされる。これを達成するために、パターニングは、フォトマスクを介して円形パターンの印象の中に延伸されるPDMSを用いて行われる。分解フォトマスク（マスクの一部が直径約1.5cm）で使用される。マスクを破壊しないようにするに延伸後、フォトマスク上の楕円形のパターンを使用し、それが）。Bの未延伸のPDMSシートに印刷。基板はパターンが円形になるよう延伸される。 拡大画像を表示するには、ここをクリックしてください 。

Discussion

この技術は、多数回使用されていますし、徹底的にテストされていますが、失敗した実験につながることができ、いくつかの重要なステップがあります。

PDMSについて：

この作業では、GelPak、市販の薄いPDMSシートを用いた。別の方法として、PDMSシートは、PDMSミックスから直接鋳造することができる。それは、より再現性があり、カスタムメイドのPDMSに比べて壊れにくくなるので、我々はGelPakの使用をお勧めします。

デバイスについて：

このプロトコルで使用される引き伸ばしデバイスは、 "家で"デザインされましたが、1もFlexCellのような市販のストレッチャーに微細加工技術を適用することができます。カスタムメイドオプションは、より汎用性とかなり安いです。

デバイスをマウント。

PDMSの取り付けは、破損につながることができます。それを反転させることも容易であり、ある側面伝える方法がありませんこれ。 PDMSはあまりクランプされる場合、それは短くなり、これは（張力が伸張の同じ距離も大きくなるように）破壊につながる可能性がある。ネジがうまく締められているか、PDMSシートが実験中に、すぐにストレッチが始まると以降にスリップすることを確認してください。

セルの追加：

培養基質から細胞を剥離するためには、EDTA、0.02％PBS中ではなく、トリプシンを使用することをお勧めします。 EDTAを使用すると、パターン上の細胞の速い再結合が可能になります。細胞がPDMSに添加される場合、それらはウェルのパターンに結合、個々の細胞を得るために、互いに分離されなければならない。彼らは、サスペンションに入ると、200μlの先端でそれらを数回ピペットで、これは凝集体を壊すでしょう。約200,000個の細胞は、各パターンへの結合を持つために4cm ^2の表面上に追加する必要があります。細胞が表面に素早く落ちるので、小さなボリュームを使用しています。十分な細胞、mが存在しない場合いずれのパターンが空のままになります。非付着細胞はすぐに十分な細胞がパターンにバインドされているように、メディアの除去によってフラッシュする必要があります。フラッシュが細胞型が、15分の間で変化させることができるまでの時間は、一般的に、細胞がパターンにアタッチする準備のために十分である。細胞があまりにも長い間取り付けるために残っている場合、パターンは2つ以上のセルによって占有されるであろう。この工程は^、13に記載されている。

ストレッチ時：

関心領域の位置を失わないように、ストレッチしながら、余分な注意が必要です。実際、ストレッチ中に、PDMSは広いとなり、ステージ位置を補正するために再調整する必要があります。ステージの電動引き伸ばしデバイスとソフトウェア制御の組み合わせが自動的にこの効果¹⁴を補うために開発することができます。ここで紹介する、シンプルで汎用性の高い手動ストレッチャは、このような自動化された補償を達成するためにアップグレードすることができます。

PDMS POシリコングリスは表面の周り適切に配置されていない場合はOLが漏れることができる。セットアップが正しく内部のPBSを入れ、その上に細胞をプレーティングする前に、漏れを監視することにより密閉されていることを確認します。

私たちの担架は約30％の伸びを可能にするが、カスタム設計されたストレッチャ延伸度が高いために可能性があります。ひずみが高いほど、より高いが、PDMS層の破壊の危険性であるように注意してください。

制限事項：

ここで紹介する手法の主な制限の1つは、モーターを使用して簡単に自動ストレッチ/ destretchingの欠如である。それにもかかわらず、代わりに手動のマイクロメータねじのアクチュエータを適合させることが可能である。顕微鏡制御の具体的なプログラミングと相まって、この実装では、延伸時のサンプル変位の補償を許可することができます。

油浸対物レンズを用いているため別の欠点は、高分解能イメージングを有することの難しさである目的は速すぎて動くソフト基板のducesの動き。これは、水を用いて解くことができる（ただし、次いで蒸発させて、長期実験の問題である）、または非常に流動性の油。

修正および将来のアプリケーション：

がん研究所（ロンドン、UK）からYanlanマオとニックTaponと共同で、我々は、ピンチするためには、試料が途中であると、互いの上にPDMSの2つの層を可能にストレッチャーの別のバージョンを開発全体の組織を伸ばす。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141