Summary
이 원고는 단방향 스트레칭을 사용하여 부착 세포 나 조직에 힘을 적용하거나 해제하는 방법을 제시한다.
Abstract
기계의 힘은 세포에 작용 및 / 또는 조직은 다수의 프로세스에 중요한 역할을한다. 우리는 폴리 디메틸 실록산 영상과 호환 (PDMS) 막에 도금 세포 스트레칭 장치를 개발했습니다. 이 기술은 재현하고 다양한입니다. PDMS 막을 구체적인 형상으로 세포 또는 조직을 한정하기 위해 마이크로 패턴 될 수있다. 첫 번째 단계는 딥 UV 기술로 PDMS 막 상에 미세 패턴을 인쇄하는 것이다. PDMS 막이어서 기계적 들것에 장착된다. 챔버는 스트레치 동안 활공 수 있도록 생체 적합성 그리스와 멤브레인의 상단에 바인딩됩니다. 세포를 시딩하고 미세 패턴에 몇 시간 동안 확산 할 수있다. 샘플은 마이크로 미터 나사를 이용하여 여러 번 연신 및 연신 될 수있다. 그것은 (30 % 정도)의 전체 범위에 스트레치를 적용하는 분 미만 소요됩니다. 여기에 제시된 기술에 필요한 동력 장치를 포함하지 않습니다신속 및 / 또는 컴퓨터 제어 연신 반복 스트레치 사이클 pplying 있지만이 구현 될 수있다. 세포 스트레칭이나 조직 세포의 힘, 기계적인 스트레스 나 조직의 형태 형성에 대한 세포 반응에 관련된 질문에 관심이있을 수 있습니다. 이 비디오 프리젠 테이션은 단순 해 보이는 이런 유형의 실험을 수행 할 때 발생할 수있는 일반적인 문제를 방지하는 방법을 보여줍니다.
Introduction
고등 생물의 조직을 구성하는 세포는 기계적인 긴장과 외부 환경이나 주변의 세포 1, 2에서 하나 오는 스트레칭 힘이 적용됩니다. 세포에 적응하고 조직의 무결성을 유지하기 위해 이들의 힘에 저항한다. 이러한 힘은 개발 3,4 동안 조직의 형태 형성에 중요하다. 배양 된 세포에 기계적인 힘을 적용하는 것은 조직에 일어날 일에 모방 할 수있는 방법이지만, 세포의 모양과 세포의 변형 5,6의 양적 및 독립 제어와. 이를 위해 여러 가지 기술들이 사용될 수있다. 하나는 (전체 세포 또는 그 일부)를, 예를 들어 AFM 또는 파생 7,8 또는 세포가 성장 기판을 스트레칭을 사용하여 셀을 누를 수 있습니다.
이 문서에서 설명하는 방법은 세포로 도금 평면 기판을 스트레칭하는 방법을 보여줍니다. 이 기술은 원래 평가하기 위해 개발 된 힘의 역할은 m에 작용itotic 포유 동물 세포 9. 유사 분열 세포가 수축 섬유를 통해 기판에 연결 상태를 유지하고 막을 스트레칭 차례로 분열 스핀들의 회전을 유발하는 섬유에 힘을 발휘. 접착제 미세 패턴을 결합하고 스트레칭의 관심은 힘과 개별 셀의 모양을 독립적으로 제어를 달성하는 것입니다. 그것은 축 스트레칭이인가 된 상태에서, 완벽하게 등방성 둥근 모양으로 난형 세포를 스트레칭 예를 들어 수 있습니다. 세포는 미세 패턴에 엮어되지 않으면 축성 대부분의 세포는 스트레치 축과 정렬 된 장축을 갖는 세포 연신율 결과 스트레칭. 이것은 장축 정렬과 셀에 적용된 스트레칭 효과의 영향을 분리하기 위하여 다음 어렵다.
이 디바이스는 시간이 오래 경과 형광 현미경을 포함한 모든 살아있는 세포 이미징에 적합하고, 약은 실험 기간 동안 추가 할 수 있습니다. 깊은 UV를의 미세 방법 10Azioune에 상세하게 설명했다 등. PDMS 11 패터닝는 설명했다 Azioune 등. 12 프로토콜을 스트레칭 선물 카르 피 등. (13)의 비디오 버전입니다
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Protocol
1. PDMS의 보호
- PDMS의 조각을 잘라 약은 전 장에서 X 20mm 35mm (예를 들어, GelPak, 재료의 표에 나와있는대로)가.
- 플라스틱의 상단과 하단에 보호 층을 제거 (필요한 경우)와 페트리 접시를 (처리 문화를 셀 수 없습니다) 플라스틱 PDMS를 배치 핀셋을 사용합니다.
- / 분 (30) 진동에서 회 전자에 5 분 동안 70 % 에탄올로 PDMS를 씻으십시오.
- 거기에 공기를 유입하여 표면을 건조시킵니다.
- 약 5 ㎝의 UV 전구에서 거리에서 5 분 깊은 UV (λ = 180 nm의)와 조명 (램프 참고 용 재료 장을보고, 매개 변수는 다른 램프에 따라 다를 것이다).
- 각각의 조각을 PDMS를위한 EDC / NHS 용액 200 μL (용액의 반응성이 시간 만에 붕괴 때문에 그냥 사용하기 전에 준비해야합니다)를 준비합니다. pH가 6.0에서 0.05 M MES + 0.5 M NaCl을 버퍼 1 ㎖를 들어, 설포-NHS의 11.5 밀리그램과 EDC의 19.2 밀리그램을 추가합니다.
- 이동조명되지 않은 페트리 접시의 뚜껑에 페트리 접시에서 PDMS의 장. 이는 PDMS의 주변은 매우 소수성 보장하고 다음 단계를 용이하게한다.
- EDC / NHS 솔루션을 추가하고 실온에서 15 분 동안 품어.
- 물과 EDC / NHS를 씻어.
- PLL-g-PEG 용액 (HEPES 10 mM의 pH를 8.6에서 0.5 ㎎ / ㎖)를 첨가하고 3 시간에 하룻밤 실온에서 품어.
- 물을 PLL-g-PEG를 씻어. (PLL-g-PEG 기능화) 비활성화 된 PDMS는 4 ℃에서 며칠 동안 저장 될 수있다
2. PDMS의 패터닝
- PDMS 시트를 가지고 패터닝 microfeatures 베어링 합성 석영 포토 마스크에 배치 (그림 1 참조). PLL-g-PEG는 포토 마스크의 크롬 측에 직면 베어링 PDMS면을 넣습니다.
- 약 5cm의 UV 전구로부터의 거리에 포토 마스크를 통해 12 분 동안 밝히는.
- 마스크 + PDMS에 물을 천천히 마스크 오프 PDMS 껍질.
- 실온에서 1 시간 동안의 pH 8.6에서의 HEPES 버퍼에서 50 ㎎ / ㎖에서 피브로넥틴 용액으로 배양한다. 그것은 다른 사람에게 ECM 단백질을 사용하는 것이 가능하지만, 이러한 프로토콜이 테스트되지 않았다.
- PBS로 씻어.
3. 장치 설치
- 스트레칭 장치 (문제 해결을위한 토론 참조)에 이전에 비활성화 된 PDMS를 탑재합니다.
- 들것의 고정 부분에 PDMS의 한 쪽을 연결합니다.
- PDMS 시트의 너무 많은 클램핑하지 않고 들것의 모바일 부분에 다른 쪽을 고정합니다.
- 두꺼운 PDMS 찌르기에 PDMS의 사각형 (22mm X 19mm)을 잘라 (그림 2 참조) 세포와 미디어를 유지하는 풀 (또는 프레임)을 부여하기 위해 내부에 또 다른 사각형을 잘라.
- 이 풀을 PDMS에서 실리콘 그리스를 추가하고 의대를 만들 PDMS 시트의 상단에 배치IUM 풀을 유지. 그리스 스트레칭 동안 PDMS 시트에 풀의 활공을 허용합니다.
4. 셀 패터닝
- 센과 50 % 자랄 문화 플라스크에서 세포를 분리.
- 세포를 카운트하고 200,000 세포 / ml의 농도로 재현 탁 그들을.
- 풀의 세포 현탁액 1 ㎖ (자세한 내용에 대한 설명을 참조)를 추가합니다.
- 세포 (RPE-1 세포를 10 분 및 HeLa 세포를 20 분 소요되며, 세포 유형에 따라) 10-30 분 동안 패턴에 바인딩하자.
- 부드럽게 평형 배지 (배양기에서 매체를 평형)와 부동 세포를 세척하십시오.
- 세포가 패턴에 몇 시간 동안 전파하자 (RPE-1은 최소 2 시간이 필요합니다, 헬라 세포는 3 시간이 필요합니다).
- PDMS 나누기 경우 증발 매체의 누설을 방지하기 위해 풀의 상단에 커버 슬립을 추가합니다.
- 거꾸로 현미경에 장치를 넣어 영상을 시작합니다. 기름 침수 산부인과의 사용을 피하십시오이 때문에 문제를 중심으로 작동하지 않습니다으로 jectives.
5. 스트레칭
- X-,-y 및 z 축 (주로 X)의 무대 위치를 보정하는 동안 마이크로 미터 나사를 돌립니다. 스테이지 위치는 PDMS의 확폭 및 포커스의 손실을 상쇄하도록 보정 될 필요가있다. (토론 단락 "스트레치하는 동안"참조).
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Representative Results
이 비디오 프로토콜에서 제시된 방법은 포유 동물 세포의 유사 분열 후퇴 섬유에의 힘의인가를 허용했다. 실제로, 세포 분열 동안, 유사 분열 단계에서, 포유류 세포는 구형 형상을 가지고, 기판에 부착 된 막에 의해 둘러싸인 얇은 액틴 케이블 뒤에 남겨 후퇴. 이 케이블 (수축 섬유) 부문에 가기 전에 셀 구조의 메모리입니다. PDMS 박막의 포토 마스크를 통해 깊은 UV와 미세 패턴 제작 (그림 1)은 세포 접착의 기하학적 제어를 허용했다. 중기의 발병에서 기판을 연신함으로써, 이러한 후퇴 섬유의 일부는 유사 분열 세포의 외피 (도 3)에인가되는 기계적 힘의 결과로 얻어 전지 본체에서 뽑아 하였다. 이러한 힘은 스핀들 축 (9)의 방향을 제어하는 것으로 하였다.
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그림 1. 미세 패턴의 기능을 베어링 합성 석영 포토 마스크. 딥 UV 패터닝에 사용되는 A) 일반 포토 마스크. 그것은 10 센티미터 × 10 cm의 바이너리 마스크이며 특징 서브 미크론 해상도, 단일 세포의 패터닝을 위해 전형적으로 약 20 ㎛의 폭으로한다. 육안으로 보이는 사각형은보기의 10 배 목표 현미경 필드의 크기입니다. 파열은 단일 셀 패턴 (여기 디스크)에 해당하는 기능을 보여줍니다. 특징 깊은 UV를주의 깊게 거품의 형성을 피하면서 PDMS는 포토 마스크에 적용됩니다. B)를 통과하게 투명합니다. 비활성화 된 PDMS 측은 포토 마스크의 금속면이 접촉한다. 미세 패턴은 모든 PDMS에 인쇄됩니다.g1highres.jpg "대상 ="_blank "> 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 수영장. PDMS 풀은 PDMS 시트에 적용됩니다. 그리스는 수영장의 바닥 주변을 덮고 있습니다. 풀의 용량은 용지의 약 2 ㎖이다. 풀 배지로 가득 차 있습니다 (여기에 형광 물이 노란색으로 표시). 증발을 방지하기 위해, 커버 슬립은 상단에 추가 할 수 있습니다. 더 큰 이미지를 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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Discussion
이 기술은 여러 번 사용하고 철저하게 테스트되어 있지만, 실패한 실험으로 이어질 수있는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다.
PDMS 소개 :
이 작품의 경우, GelPak, 시판 얇은 PDMS 시트를 사용 하였다. 또는 PDMS 시트는 PDMS 믹스에서 직접 캐스팅 할 수 있습니다. 더 재현하고, 사용자 정의 만든 PDMS에 비해 휴식 덜하기 때문에 우리는 GelPak를 사용하는 것이 좋습니다.
장치에 대한 :
이 프로토콜에 사용되는 스트레칭 장치는 "집에서"설계되었습니다,하지만 그 중 하나는 FlexCell의 같은 상용 들것에 미세 기술을 적용 할 수 있습니다. 주문품 옵션은 더 융통성 있고 훨씬 저렴.
장치를 설치 :
PDMS의 설치가 차단 될 수 있습니다. 또한 거꾸로 쉽고, 어느 쪽 확인할 방법이 없다있다. PDMS가 너무 고정되어 있으면 짧아진다 이것은 (장력 스트레치 동일한 거리만큼 커야하므로) 파괴로 이어질 수있다. 확인 나사가 잘 조여 또는 PDMS 시트가 빨리 스트레치 실험시 이후에 시작 또는로 미끄러됩니다.
셀을 추가 :
배양 용 기재로부터 세포를 분리하기 위해, PBS보다는 트립신 EDTA로보기 0.02 %를 사용하는 것이 더 낫다. EDTA를 사용하여 패턴에 대한 세포의 빠른 리 바인딩을 허용합니다. 세포 PDMS에 첨가 될 때, 잘 패턴에 바인딩 개별 세포를 얻기 위해 서로 분리되어야한다. 그들이 정지에 한 번, 200 μL의 끝으로 그들에게 여러 번 피펫,이 집계를 중단합니다. 약 20 세포는 각각의 패턴에 바인딩을하기 위해 4 ㎠의 표면에 추가해야합니다. 세포 표면 상에 빠르게 떨어질 정도로 작은 양을 사용한다. 가없는 경우 충분한 세포, M모든 패턴은 비어있게됩니다. 비 부착 세포는 곧 세포가 패턴에 바인딩 될 때 미디어의 제거에 의해 플러시해야합니다. 세척하기 전에 시간은 세포 유형에 따라 다를 수 있지만 15 분은 세포가 패턴에 부착을 시작하기에 일반적으로 충분하다. 세포가 너무 오래 부착두면, 패턴은 2 개 이상의 셀에 의해 점령 될 것이다. 이 단계 (13)에 기재되어있다.
스트레칭 중 :
관심 영역의 위치를 잃지 않도록, 스트레칭하면서, 특별히 조심. 실제로, 스트레칭 동안 PDMS는 넓게 될 것이다, 그리고 스테이지 위치를 보상하도록 재조정 될 필요가있다. 스테이지의 동력 연신 장치 및 소프트웨어 제어의 조합은 자동으로이 효과 (14)를 보상하기 위해 개발 될 수있다. 여기에 제시된 간단하고 다양한 수동 들것은 자동 보정을 달성하기 위해 업그레이드 할 수 있습니다.
PDMS 포실리콘 기름이 표면 주위에 제대로 배치되지 않은 경우 올 누설 할 수 있습니다. 설치가 제대로에 세포를 도금하기 전에 내부의 PBS를 넣어 및 누출에 대한보고에 의해 밀봉되어 있는지 확인합니다.
우리의 들것은 약 30 %의 스트레칭을 할 수 있지만, 사용자 정의 설계 들것 스트레칭의 높은 수준을 허용 할 수 있습니다. 긴장 이상과 같은주의, 이상은 PDMS 층 파괴의 위험이 있습니다.
제한 사항 :
여기에 제시된 기술의 대부분의 한계 중 하나는 모터를 사용하여 자동 락 연신 / destretching의 부족이다. 그럼에도 불구하고, 대신에 수동 마이크로 미터 스크류 액추에이터를 적용하는 것이 가능하다. 현미경 컨트롤의 특정 프로그래밍과 결합이 구현은, 스트레칭 동안 샘플 변위에 대한 보상을 할 수 있습니다.
기름 침지 목표를 사용하기 때문에 또 다른 단점은 높은 해상도의 이미지를 갖는 어려움목적이 너무 빨리 이동하는 부드러운 기판을 만듭니 움직임. 이 물을 사용하여 해결 될 수있다 (하지만 증발 장기 실험에 대한 문제이다) 또는 매우 유동적 오일.
수정하고 미래의 어플리케이션 :
암 연구소 (런던, 영국)에서 Yanlan 마오와 닉 Tapon과 협력하여, 우리가 끼하기 위해, 샘플이 중간에되는, 서로의 상단에 PDMS의 2 개의 층을 허용하는 들것의 또 다른 버전을 개발 및 전체 조직을 스트레칭.
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Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 프랑스 문화원 퀴리, 파리,에 의해 설립되었다. 기계 들것 데미안 CUVELIER (문화원 퀴리)에 의해 디자인되고 GREM에서 제조 된 (MECANIQUE-grem.com). PDMS의 패터닝 아마르 Azioune (보르도 II 대학)에 의해 개발되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GelPak | GelPak | PF-60-X4 | Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself. |
| Silicon grease | GE Bayer Silicones | Baysilone-Paste | This one is biocompatible |
| Stretching device | GREM mécanique | Stretcher 2011 | |
| EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride) | Sigma | 3450 | Stable 6 months at -20 °C |
| NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt) | Sigma | 56485 | Protect from humidity |
| Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg) | SurfaceSolutions (Zurich) | ||
| Synthetic Quartz photomask | Toppan | Take standard binary photomask in Quartz | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma | F1141 |
References
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