Stretching Micropatterned Celler på en PDMS Membrane

Summary

Dette manuskriptet presenterer en teknikk for å søke eller frigjøre krefter på heftende celler eller vev ved hjelp av enveis stretching.

Abstract

Mekaniske kreftene på celler og / eller vev spille en viktig rolle i mange prosesser. Vi har utviklet et apparat for å strekke celler belagt på en polydimethylsiloxane (PDMS) membran, kompatibel med bildebehandling. Denne teknikken er reproduserbar og allsidig. Den PDMS membranen kan micropatterned for å avgrense celler eller vev til en bestemt geometri. Det første trinnet er å skrive ut micropatterns på PDMS membran med en dyp UV teknikk. Den PDMS membranen blir deretter montert på en mekanisk båre. Et kammer er bundet på toppen av membranen med biokompatible grease for å tillate gliding under strekk. Cellene blir sådd og tillatt å spre seg i flere timer på micropatterns. Prøven kan bli strukket og ustrukket flere ganger med bruk av en mikrometerskrue. Det tar mindre enn et minutt å gjelde strekningen til sin fulle utstrekning (rundt 30%). Den teknikk som presenteres her ikke inneholder en motordrevet enhet, som er nødvendig for enpplying gjentatte strekk sykluser raskt og / eller datastyrte stretching, men dette kan gjennomføres. Stretching av celler eller vev kan være av interesse for spørsmål knyttet til cellestyrker, celle respons på mekanisk stress eller vev morphogenesis. Denne videoen presentasjonen vil vise hvordan du kan unngå typiske problemer som kan oppstå når du gjør denne type tilsynelatende enkelt eksperiment.

Introduction

Cellene som utgjør en vev i høyere organismer er underlagt mekaniske spenninger og strekker kreftene kommer enten fra det ytre miljø eller fra omkringliggende celler ^1,2. Celler må tilpasse seg og motstå disse kreftene for å opprettholde vev integritet. Slike krefter er også viktig for vev morphogenesis under utvikling ^3,4. Bruk av mekaniske krefter på dyrkede celler, er en måte til å etterligne det som kan skje i et vev, men med en kvantitativ og uavhengig kontroll av celleform og celle deformasjon ^5,6. For dette, kan flere teknikker benyttes. Man kan trykke på cellene (hele celle eller en del av den), for eksempel ved hjelp av AFM eller derivater av ^7,8 eller strekke substratet cellene vokser videre.

Fremgangsmåten som beskrives i dette dokumentet viser hvordan å strekke et plan substrat belagt med cellene. Denne teknikken ble opprinnelig utviklet for å vurdere rollen til kreftene på mitotic pattedyrceller ^ni. Mitotiske celler være koblet til substratet via hevefibre og strekking av membranen som utøves en kraft på disse fibrene, som i sin tur provosert rotasjonen av den mitotiske spindel. Interessen for å kombinere selvklebende micropatterns og stretching er å oppnå uavhengig kontroll av krefter og form av individuelle celler. Det er for eksempel mulig å strekke en ovoid celle til en perfekt isotrop rund form, mens uniaksial strekk påføres. Dersom cellene ikke er flettet på micropatterns, uniaksial strekking resulterer i celleforlengelse, med de fleste celler som har en lang akse på linje med den strekk-aksen. Det er da vanskelig å skille effekten av den lange aksen innretting og virkningen av strekk påført til cellene.

Apparatet er egnet for alle levende celle bildebehandling, inkludert lang tid lapse fluorescerende mikroskopi, og medikamenter kan legges under forsøket. Den dype UVs micropatterning metode ¹⁰ble beskrevet i detalj i Azioune et al. ^11. Mønster på PDMS ble beskrevet i Azioune et al. ^12. Foreliggende strekker protokoll er en video-versjon av Carpi et al. ^13.

Protocol

En. Passivisering av PDMS

1. Klipp et stykke av PDMS ca 35 mm x 20 mm fra en pre gjort ark (for eksempel GelPak, som er oppført i tabellen av materialer).
2. Fjern det øverste og de nederste beskyttende lag av plast (om nødvendig), og bruk pinsett for å plassere PDMS i en plastpose (ikke cellekultur behandlet) petriskål.
3. Vask PDMS med 70% etanol i 5 min på en rotator ved 30 svingninger / min.
4. Tørk overflaten ved strømmende luft på den.
5. Belyse med UV (λ = 180 nm) for 5 min ved en avstand fra UV-pærer på ca 5 cm (se Materialer ark for lampe referanse, parametere vil variere for ulike lamper).
6. Forbered 200 pl av EDC / NHS-løsning for hver PDMS stykket (dette må fremstilles umiddelbart før bruk, fordi reaktiviteten av den løsning desintegrerer i løpet av noen timer). Til 1 ml av 0,05 M MES + 0,5 M NaCl-buffer ved pH 6,0, tilsett 11,5 mg av Sulfo-NHS og 19,2 mg EDC.
7. OverførPDMS ark fra petriskålen til lokket av petriskålen, noe som ikke er blitt belyst. Dette vil sikre at omgivelsene i PDMS er svært hydrofobe og tilrettelegge for neste trinn.
8. Legg EDC / NHS-løsning og inkuberes i 15 min ved romtemperatur.
9. Skyll EDC / NHS med vann.
10. Til PLL-g-PEG-løsning (0,5 mg / ml i 10 mM HEPES pH 8,6) og inkuberes fra 3 timer til over natten ved romtemperatur.
11. Skyll PLL-g-PEG med vann. Passiveres PDMS (funksjon med PLL-g-PEG) kan lagres i flere dager ved 4 ° C.

2. Fordelingen av PDMS

1. Ta en PDMS ark og plassere den på et syntetisk kvarts photomask bærer microfeatures for mønster (se figur 1). Plasser PDMS side bærer PLL-g-PEG vender krom side av fotomasken.
2. Lyse i 7 min gjennom fotomasken i en avstand fra UV-pærene på ca 5 cm.
3. Tilsett vann på maske + PDMS og skrelle PDMS sakte av masken.
4. Inkuber med fibronektin-oppløsning ved 50 mg / ml i HEPES-buffer ved pH 8,6 i 1 time ved romtemperatur. Det er mulig å bruke andre ECM proteiner, men disse har ikke blitt testet med denne protokollen.
5. Skyll med PBS.

Tre. Montering av Device

1. Monter tidligere passiv PDMS på stretching enhet (se diskusjon om problemer).
   1. Fest den ene side av PDMS til den faste del av båren.
   2. Løser den andre siden til den mobile delen av båren uten klem for mye av PDMS arket.
2. Klipp et rektangel av PDMS (22 mm x 19 mm) i en tykk PDMS stikk og kutt et annet rektangel inne for å ha et basseng (eller ramme) som vil beholde cellene og media (se figur 2).
3. Legg silikonfett under denne PDMS basseng og plassere den på toppen av PDMS ark for å lage en MEDIUM beholde bassenget. Fettet vil tillate gliding av bassenget over PDMS ark under stretching.

4. Mønstring av det Cells

1. Løsne cellene fra en 50% confluency kultur kolbe med Versene.
2. Tell cellene og resuspender dem i en konsentrasjon på 200.000 celler / ml.
3. Tilsett 1 ml av cellesuspensjon i bassenget (se diskusjon for ytterligere detaljer).
4. La cellene bindes til mønstrene på 10-30 min (avhengig av celletype, RPE-1-celler vil ta 10 min, og HeLa-cellene 20 min).
5. Skylle forsiktig de flytende celler med equilibrated medium (likevekt medium i inkubator).
6. La cellene spredt for noen timer på mønstre (RPE-en vil trenge minst to timer, HeLa celler vil trenge tre timer).
7. Legg et dekkglass på toppen av bassenget for å unngå fordampning og middels lekkasje i tilfelle PDMS pauser.
8. Sett enheten på et invertert mikroskop og starte bildebehandling. Unngå bruk av olje nedsenking objectives som det ikke vil fungere på grunn av fokus problemer.

5. Stretching

1. Drei mikrometerskruen samtidig korrigere fasen posisjon i x-, y-, og z-aksen (i hovedsak x). Scenen stilling må rettes opp for å motvirke utvidelse av PDMS og tap av fokus. (Se "Under strekk" punkt i diskusjonen).

Representative Results

Den teknikk som presenteres i denne video-protokollen tillot anvendelse av krefter på inntrekkjedenes fibre av mitotiske celler hos pattedyr. Faktisk, ved celledeling, i den mitotiske fase, pattedyrceller trekkes for å ta form av en kule, og etterlater tynne aktin kabler som er omgitt av membranen som er festet til substratet. Disse kablene (heve fiber), er minnet av cellen geometri før du går inn i divisjonen. Å gjøre micropatterns med fjern UV gjennom en fotomaske for PDMS tynn film (figur 1) tillates den geometriske kontroll av celleadhesjon. Ved å strekke substratet ved angrep av metafase, ble noen av disse heve fibre trekkes løs fra cellelegemet, noe som resulterer i en mekaniske krefter anvendes på den mitotiske celle cortex (figur 3). Disse styrkene ble vist til å styre retningen på spindel aksen ^ni.

gure en "fo: content-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Syntetisk Quartz Photomask peiling micropatterns funksjoner.   A) Typisk fotosjablonen brukes for dyp UV mønster. Det er en 10 cm x 10 cm binær maske og funksjonene er vanligvis på ca 20 mikrometer brede for enkelt celle mønster, med en submikron oppløsning. Squares synlige ved blotte øye er på størrelse med en 10X objektiv mikroskop synsfelt. Oppblåsningsforholdet viser funksjonene som tilsvarer encellete mønstre (her plater). Funksjoner er gjennomsiktig for å la dype UVs passere gjennom. B) Den PDMS påføres på fotomasken, samtidig som man unngår dannelsen av bobler. Den passiverte PDMS side er i kontakt med den metalliske side av fotomasken. De micropatterns vil bli skrevet over hele PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.

Figur 2. Bassenget.   En PDMS bassenget er brukt på PDMS ark. Grease dekker bunnen omkretsen av bassenget. Kapasiteten av bassenget er rundt 2 ml av media. Bassenget er fylt med kultur medium (her vann med fluorescein vises i gult). For å unngå fordampning, kan et dekkglass legges på toppen. Klikk her for å se større bilde .

A) Før stretching. Cellen er belagt på et ovalt mønster. For å oppnå dette, er det mønster gjøres med PDMS blir strukket under inntrykk av firkantmønster gjennom fotomasken. En fordelt fotomaske (den del av masken er ca 1,5 cm i diameter) anvendes. For å unngå å bryte ned en maske, bruke et ovalt mønster på photomask og skrive den ut på en unstretched PDMS ark. B) Etter stretching. Underlaget er strukket slik som mønsteret blir en sirkel. Klikk her for å se større bilde .

Discussion

Selv om denne teknikken har vært brukt mange ganger, og er grundig testet, er det flere viktige tiltak som kan føre til en mislykket eksperiment.

Om PDMS:

For dette arbeidet, GelPak, en kommersielt tilgjengelig tynn PDMS-ark, ble benyttet. Alternativt PDMS ark kan bli kastet direkte fra PDMS mix. Vi anbefaler å bruke GelPak fordi det er mer reproduserbar, og er mindre sannsynlig å bryte forhold til skreddersydde PDMS.

Om enheten:

Den strekker enhet som brukes i denne protokollen ble utviklet "in house", men man kan også bruke micropatterning teknikk på kommersielt tilgjengelige bårer som Flexcell. Skreddersydde alternativene er mer allsidig og mye billigere.

Montering av enheten:

Monteringen av PDMS kan føre til brudd. Det er også lett å snu det, og det er ingen måte å fortelle hvilken side ersom. Dersom PDMS klemmes for mye, blir den kortere, og dette kan føre til å bryte (som spenningen vil være større for den samme avstand på strekk). Pass på at skruene er godt strammet eller PDMS ark vil gli så snart strekningen begynner eller senere i løpet av eksperimentet.

Legge cellene:

For å løsne cellene fra dyrknings substrat, er det bedre å bruke 0,02% EDTA i PBS i stedet for trypsin. Ved hjelp av EDTA vil tillate raskere ny binding av cellene på mønstre. Når celler blir tilsatt til PDMS, må de være godt adskilt fra hverandre for å oppnå individuelle celler som binder til mønsteret. Når de er i suspensjon, pipettere dem flere ganger med en 200 mL spiss, og dette vil bryte opp aggregater. Om 200000 celler må legges på 4 cm ² overflate for å få binding til hvert mønster. Bruk et lite volum, slik at cellene faller hurtig på overflaten. Hvis det ikke er nok celler, mnoen mønstre vil forbli tom. Den ikke festede celler må skylles ut av mediet fjernes så snart nok celler er bundet til mønstrene. Tiden før spyle kan variere mellom celletypene, men 15 minutter er generelt tilstrekkelig for cellene til å begynne å feste til mønstrene. Hvis cellene er igjen for å feste for lenge, vil mønstre bli okkupert av to eller flere celler. Dette trinnet er beskrevet i ^13.

I løpet av strekningen:

Vær ekstra forsiktig, mens du strekker, for å unngå å miste posisjonen regionen av interesse. Faktisk, under strekk, vil den PDMS blir bredere, og scenen stilling må justeres på nytt for å kompensere. En kombinasjon av en motorisert strekker enhet og programstyring over scenen kan utvikles til å automatisk kompensere for denne effekten ^14.. Den enkle og allsidige manuell båre presenteres her kan oppgraderes til å oppnå en slik automatisert kompensasjon.

PDMS pool kan lekke dersom silikonfett ikke ble plassert riktig i nærheten av overflaten. Kontroller at oppsettet er riktig forseglet ved å sette PBS inne og ser etter lekkasjer før plating celler på det.

Vår båren gjør at en strekning på ca 30%, men tilpasset designet bårer kunne gi rom for en høyere grad av strekk. Vær forsiktig så den høyere belastningen, er det høyere risiko for PDMS lag breaking.

Begrensninger:

En av de viktigste begrensninger i den teknikk som presenteres her, er mangelen på enkel automatisk strekking / destretching ved hjelp av en motor. Ikke desto mindre er det mulig å tilpasse en aktuator i stedet for en manuell mikrometerskrue. Denne implementeringen, kombinert med en bestemt programing av mikroskopet kontroll kan tillate kompensasjon for prøve forskyvning under stretching.

En annen ulempe er vanskeligheten med å ha høy oppløsning, fordi bruk av olje immersion mål iduserer bevegelser av den myke underlaget når målet beveger seg for fort. Dette kan løses ved hjelp av vann (men da fordampning er et problem for langsiktige eksperimenter) eller veldig flytende olje.

Modifikasjoner og fremtidige applikasjoner:

I samarbeid med Yanlan Mao og Nic Tapon fra Cancer Research Institute (London, UK), utviklet vi en annen versjon av båren som tillater to lag med PDMS oppå hverandre, med prøven å være i midten, for å klemme og strekke hele vev.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141