Растяжка Micropatterned клеток на PDMS мембраны

Summary

Эта рукопись представляет технику применять или освободить силы на прикрепленных клеток или тканей с использованием однонаправленной растяжения.

Abstract

Механические силы, действующие на клетки и / или ткани играют важную роль в многочисленных процессов. Мы разработали устройство, чтобы растянуть клетки высевают на полидиметилсилоксан (PDMS) мембраны, совместимый с изображениями. Эта техника является воспроизводимым и универсальным. PDMS мембрана может быть micropatterned для того, чтобы ограничить клеток или тканей с определенным геометрии. Первым шагом является печать micropatterns на мембране PDMS с глубоким техники УФ. PDMS мембраны затем монтируется на механическом носилках. Камера связан в верхней части мембраны с биосовместимым смазки, чтобы позволить скольжения во время растяжения. Клетки высевают и давали возможность распространяться в течение нескольких часов на micropatterns. Образец может быть растянут и растяжений несколько раз с использованием микрометрического винта. Это займет меньше минуты, чтобы применить на участке в полном объеме (около 30%). Техника, представленная здесь не включает моторизованный устройство, которое необходимо дляpplying повторяющихся циклов растяжения быстро и / или управляется компьютером растяжения, но это может быть осуществлено. Растяжение клеток или тканей может представлять интерес для вопросов, связанных с сотовых сил, клеточного ответа к механическим воздействиям или ткани формообразования. Это видео презентация покажет, как избежать типичных проблем, которые могут возникнуть при выполнении этого типа, казалось бы, простого эксперимента.

Introduction

Клетки, составляющие ткань у высших организмов подвержены механическим напряженности и растягивающих сил ближайшие либо из внешней среды или от окружающих клеток ^1,2. Клетки должны адаптироваться и противостоять эти силы для поддержания целостности тканей. Такие силы также важны для тканей формообразования во время разработки ^3,4. Применение механических сил на культивируемых клетках это способ имитировать то, что может произойти в ткани, но с количественным и независимого управления формы клеток и деформации клеток ^5,6. Для этого несколько методов могут быть использованы. Можно нажать на клетках (вся клетка или ее часть), например с помощью АСМ или производные ^7,8 или растянуть подложки клетки, растущие на.

Метод, описанный в этой статье показано, как растянуть плоскости подложки, покрытая клетками. Этот метод был первоначально разработан для оценки роли сил, действующих на мitotic клетки млекопитающих ^9. Митотических клеток оставаться на связи с подложкой через отвода волокон и растяжения мембрану, оказываемое усилие на тех волокон, которые, в свою очередь, спровоцированных вращение митотического веретена. Интерес объединения клейкие micropatterns и растяжения является достижение независимый контроль сил и формы отдельных клеток. Это, например, можно протянуть овально клетки в совершенно изотропной круглой формы, в то время как одноосное растяжение применены. Если клетки не свили на micropatterns, одноосное растяжение результаты в удлинения клеток, при этом большинство клеток, имеющих длинную ось совмещена с осью растяжения. Это то трудно отделить эффект длинной оси выравнивания и эффекта на участке, приложенного к клеткам.

Устройство подходит для любого живого изображения клеток, в том числе давно промежуток флуоресцентной микроскопии, и наркотики могут быть добавлены в течение эксперимента. Глубокий метод UVs micropatterning ¹⁰был подробно описан в Azioune соавт. был описан ¹¹ Patterning на PDMS в Azioune др. ^12. Настоящий растяжения протокол является видео версия Карпи и др. ^13.

Protocol

1. Пассивация PDMS

1. Отрежьте кусок PDMS примерно 35 мм х 20 мм из предварительно сделанного листа (например, GelPak, как указано в таблице материалов).
2. Снимите верхнюю и нижние защитные слои пластика (при необходимости) и использовать пинцет, чтобы поместить PDMS в пластиковом (не клеточной культуре лечение) чашки Петри.
3. Промыть PDMS с 70% этанолом в течение 5 мин на ротатор на 30 колебаний / мин.
4. Сушат поверхность на потоке воздуха на нем.
5. Освещать с глубокой УФ (λ = 180 нм) в течение 5 мин на расстоянии от УФ луковицы около 5 см (см. материалы лист для ведения лампы; параметры будут отличаться в зависимости от ламп).
6. Подготовка 200 мкл EDC / NHS решение для каждого PDMS кусок (это должны быть готовы непосредственно перед использованием, так как реакционная способность решения распадается в течение нескольких часов). Для 1 мл 0,05 М MES +0,5 буферных М NaCl при рН 6.0, добавить 11,5 мг сульфо-NHS ​​и 19,2 мг EDC.
7. ТрансферPDMS листов из чашки Петри на крышке чашки Петри, которые не были освещенной. Это гарантирует, что Окрестности PDMS очень гидрофобным и облегчить следующий шаг.
8. Добавить раствор EDC / NHS и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
9. Промыть EDC / NHS водой.
10. Добавить раствор PLL-G-ПЭГ (0,5 мг / мл в 10 мМ HEPES рН 8,6) и инкубируют с 3 часов до в течение ночи при комнатной температуре.
11. Промойте PLL-G-ПЭГ с водой. Пассивируется PDMS (функционализированные с PLL-п-ПЭГ) могут быть сохранены в течение нескольких дней при 4 ° С.

2. Паттерна PDMS

1. Возьмите PDMS лист и поместить его на синтетической кварцевого фотошаблонов, хранящим microfeatures для паттерна (см. рисунок 1). Разместите сторону PDMS подшипник PLL-г-ПЭГ перед хром сторону фотошаблонов.
2. Гореть в течение 7 мин через фотошаблон на расстоянии от УФ-ламп около 5 см.
3. Добавить воду на маску + PDMS и почистить PDMS медленно с маски.
4. Инкубировать с фибронектином раствора при 50 мг / мл в HEPES буфере при рН 8,6 в течение 1 часа при комнатной температуре. Можно использовать другие ECM белков, но они не были протестированы с этим протоколом.
5. Промыть PBS.

3. Монтаж устройства

1. Установите ранее пассивированы PDMS на растяжение устройства (см. Обсуждение для устранения неисправностей).
   1. Прикрепите одну сторону из PDMS фиксированной части носилках.
   2. Закрепите другую сторону подвижной части носилок без зажима слишком много листа PDMS.
2. Вырежьте прямоугольник PDMS (22 мм х 19 мм) в толстом PDMS колото-вырезать еще один прямоугольник внутри, чтобы иметь бассейн (или рамку), сохранит клетки и СМИ (см. рисунок 2).
3. Добавить силиконовую смазку под этот PDMS бассейн и поместите его на верхней части листа PDMS, чтобы создать медий сохраняя бассейн. Смазка позволит скольжение бассейна над листом PDMS при растяжении.

4. Паттерна клеток

1. Открепления клеток от 50% слияния культуральной колбы с версеном.
2. Граф клеток и ресуспендируют их в концентрации 200000 клеток / мл.
3. Добавьте 1 мл клеточной суспензии в бассейне (см. обсуждение для получения дополнительной информации).
4. Пусть клетки связываются с узорами в течение 10-30 минут (в зависимости от типа клеток, RPE-1 клетки займет 10 минут, а HeLa клетки 20 мин).
5. Аккуратно промойте плавающие клетки с уравновешенной среде (равновесие среды в инкубаторе).
6. Пусть клетки распространяются в течение нескольких часов на паттернов (РПЭ-1 потребуется не менее 2 ч; HeLa клетки понадобится 3 часа).
7. Добавить покровное на вершине бассейна, чтобы избежать испарения и среднего утечку в случае, если PDMS перерывов.
8. Поместите устройство на инвертированный микроскоп и начать визуализацию. Избегайте использования иммерсионным Обиjectives как это не будет работать в связи с упором проблемы.

5. Растягивание

1. Поверните микрометрического винта при коррекции положения этап в X, Y-и Z-оси (в основном х). Положение этап должен быть исправлен, чтобы противодействовать расширению PDMS и потери фокуса. (См. "В ходе стрейч" пункта в обсуждении).

Representative Results

Техника представлена ​​в этом видео протокола позволило применение сил на отвода волокон митотических клетках млекопитающих. Действительно, во время деления клетки, в митотической стадии, клетки млекопитающих отказаться принять форму шара и оставить позади тонких актиновых кабелей, окруженных мембраной, которые прикреплены к субстрату. Эти кабели (отвода волокна), являются память о геометрии клеток перед входом в дивизионе. Создание micropatterns с глубокого УФ через фотошаблон на PDMS тонкой пленки (рис. 1) позволило геометрическую контроль клеточной адгезии. По растяжения подложки в начале метафазы, некоторые из этих отвода волокон оторвался от тела клетки, в результате чего механических сил, приложенных на коре митотического клетки (рис. 3). Эти силы были показаны управлять ориентацию оси шпинделя ^9.

Gure 1 "FO: содержание ширины =" 6 дюймов "FO: Пребывание" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "Первоначально" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "ширина =" 600px "/>
Рисунок 1. Синтетический кварц Photomask подшипник micropatterns особенности.   А) Типичный фотошаблонов используется для глубокого УФ кучность стрельбы. Это 10 см х 10 см двоичный маска и особенности, как правило, около 20 мкм в ширину для одной паттерна клеток, с разрешением субмикронного. Площади видимые невооруженным глазом, являются размер 10X объективной микроскопа поле зрения. Раздутие представлены функции, соответствующие отдельных моделей сотовых (здесь дисков). Особенности прозрачны, чтобы глубокие UVs пройти. B) PDMS наносится на фотошаблонов, тщательно избегая образования пузырьков. Пассивируется PDMS сторона находится в контакте с металлической стороне фотошаблона. В micropatterns будут напечатаны на всем протяжении PDMS.g1highres.jpg "целевых =" _blank "> Нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

Рисунок 2. Бассейн.   PDMS бассейн наносят на лист PDMS. Смазка покрывает нижнюю периметру бассейна. Пропускная способность бассейна составляет около 2 мл СМИ. Бассейн наполнен культуральной среде (здесь вода с флуоресцеина отображается желтым цветом). Чтобы избежать испарения, покровное могут быть добавлены на вершине. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

а) до растяжения. Клеток высевали на овальной шаблона. Чтобы добиться этого, нанесение рисунка сделано с PDMS растягивается во впечатлением круглых шаблонов через фотошаблон. Разбиты фотошаблонов используется (часть маски составляет около 1,5 см в диаметре). Чтобы избежать разрушения маску, использовать овальную рисунок на фотошаблонов и распечатать его на нерастянутом PDMS листа. B) После растяжения. Субстрат растягивается, таких как картина превращается в окружность. Нажмите здесь, чтобы увеличить изображение .

Discussion

Хотя этот метод был использован много раз и проходит тщательную проверку, есть несколько важных шагов, которые могут привести к неудачного эксперимента.

О PDMS:

За эту работу, GelPak, имеющийся в продаже тонкий PDMS лист, был использован. В качестве альтернативы PDMS листов может быть приведен непосредственно из PDMS смеси. Мы рекомендуем использовать GelPak, потому что это более воспроизводимым, и меньше шансов на перерыв по сравнению с на заказ PDMS.

О устройства:

Растяжение устройство, используемое в данном протоколе был разработан "в доме", но можно также применять технику micropatterning на коммерчески доступных носилках, как FlexCell. На заказ варианты более универсальным и намного дешевле.

Монтаж устройства:

Монтаж из PDMS может привести к нарушению. Это также легко, чтобы инвертировать его и нет никакого способа узнать, какая сторонакоторый. Если PDMS зажата слишком много, это становится короче, и это может привести к разрыву (как напряжение будет больше на таком же расстоянии от участка). Убедитесь, что винты надежно затянуты или лист PDMS будет скользить, как только участок начинается или позже в ходе эксперимента.

Добавление клетки:

Для отделения клеток от культуральной подложки, лучше использовать ЭДТА 0,02% в PBS, а не трипсином. Использование ЭДТА позволит быстрее повторную привязку клеток на модели. Когда клетки добавляют к PDMS, они должны быть хорошо отделены друг от друга с целью получения индивидуальных клеток связывания с узором. Как только они будут в виде суспензии, пипетки их несколько раз с мкл кончика 200, это будет разбить агрегаты. О 200000 клетки должны быть добавлены на поверхность 4 см ^2, чтобы иметь связывания для каждого шаблона. Используйте небольшой объем поэтому клетки быстро падают на поверхность. Если нет достаточного количества клеток, млюбые модели останется пустым. О нераспространении прикрепленные клетки должны быть вымываются удалением медиа, как только достаточное количество клеток связываются с узорами. Время до флеш может варьироваться от типов клеток, но 15 мин достаточно целом для клеток начать присоединение к модели. Если клетки слева приложить слишком долго, шаблоны будут заняты 2 или более клеток. Этот шаг описан в ^13.

Во участке:

Будьте особенно осторожны, в то время как растяжение, чтобы не потерять позицию интересующей области. Действительно, во время растяжения, то PDMS станет шире, а положение этап должен быть скорректированы, чтобы компенсировать. Сочетание моторизованных растяжения устройства и программного обеспечения управления стадии могут быть разработаны, чтобы автоматически компенсировать этот эффект ^14. Этот простой и надежный ручной носилки, представленные здесь может быть повышен до достижения такой автоматизированной компенсации.

PDMS роол может привести к утечке, если Силиконовая смазка не был помещен правильно вокруг поверхности. Убедитесь, что настройки правильно запечатан, поставив PBS внутри и наблюдая за любой утечки до посева клеток на нем.

Наша носилки позволяет протяжение около 30%, но специально созданных носилки мог бы позволить более высокой степенью растяжения. Будьте осторожны, поскольку чем выше штамма, тем выше риск PDMS слоя взлома.

Ограничения:

Одним из главных ограничений в технике, представленной здесь является отсутствие легкого автоматического растяжения / destretching использовании двигателя. Тем не менее, можно адаптировать привод вместо ручного микрометрического винта. Эта реализация, в сочетании с определенным программирования контроля микроскопа может позволить компенсацию за перемещением образца при растяжении.

Еще одним недостатком является трудность имея высокое разрешение изображений, потому что с помощью целей масло погружения вDuces движения мягкой подложке, когда цель движется слишком быстро. Это может быть решена с использованием воды (но тогда испарение является проблемой для долгосрочных экспериментов) или очень жидкой нефти.

Изменения и будущие приложения:

В сотрудничестве с Yanlan Мао и Nic Tapon от НИИ онкологии (Лондон, Великобритания), мы разработали еще одну версию носилках что позволяет два слоя PDMS поверх друг друга, с образец быть в середине, для того, чтобы зажать и растянуть целые ткани.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141