El estiramiento células micropatterned en una membrana de PDMS

Summary

Este manuscrito presenta una técnica para aplicar o liberar las fuerzas sobre las células o los tejidos adherentes utilizando estiramiento unidireccional.

Abstract

Las fuerzas mecánicas ejercidas sobre las células y / o tejidos juegan un papel importante en numerosos procesos. Hemos desarrollado un dispositivo para estirar las células sembradas en placas sobre un polidimetilsiloxano (PDMS) de membrana, compatible con formación de imágenes. Esta técnica es reproducible y versátil. La membrana de PDMS se puede microestructurada con el fin de confinar las células o tejidos a una geometría específica. El primer paso es imprimir micropatrones en la membrana de PDMS con una técnica de UV profunda. La membrana de PDMS se monta entonces en una camilla mecánica. Una cámara está enlazado en la parte superior de la membrana con grasa biocompatible para permitir el deslizamiento durante el estiramiento. Las células se siembran y permitir que se extienda por varias horas en los micropatrones. La muestra puede ser estirada y no estirada varias veces con el uso de un tornillo micrométrico. Se tarda menos de un minuto para aplicar la recta en toda su extensión (en torno al 30%). La técnica presentada aquí no incluye un dispositivo motorizado, que es necesaria para unapplying ciclos repetidos de estiramiento de forma rápida y / o estiramiento controlado ordenador, pero esto puede ser implementado. El estiramiento de las células o el tejido puede ser de interés para las cuestiones relacionadas con las fuerzas de células, la respuesta celular al estrés mecánico o la morfogénesis de tejidos. Esta presentación en video le mostrará cómo evitar los problemas típicos que pueden surgir cuando se hace este tipo de aparentemente sencillo experimento.

Introduction

Las células que componen un tejido en organismos superiores están sujetos a tensiones mecánicas y fuerzas de estiramiento próximos ya sea desde el ambiente externo o a partir de células que rodean ^1,2. Las células deben adaptarse y resistir estas fuerzas a fin de mantener la integridad de los tejidos. Tales fuerzas son también importantes para tejidos morfogénesis durante el desarrollo ^3,4. La aplicación de fuerzas mecánicas sobre las células cultivadas es una manera de imitar lo que podría suceder en un tejido, pero con un control cuantitativo e independiente de la forma celular y ^5,6 deformación celular. Para ello, pueden utilizarse varias técnicas. Uno puede pulsar sobre las células (la célula entera o parte de ella), por ejemplo usando AFM o derivados de ^7,8 o estirar el sustrato las células están creciendo en.

El método descrito en este documento se demuestra cómo estirar un sustrato plano plateado con células. Esta técnica se desarrolló originalmente para evaluar el papel de las fuerzas ejercida sobre mcélulas de mamíferos itotic ^9. Las células mitóticas mantenerse conectados al sustrato a través de fibras de retracción y estiramiento de la membrana ejercen una fuerza sobre las fibras, que a su vez provocaron la rotación del huso mitótico. El interés de la combinación de micropatrones adhesivas y estiramiento es para lograr un control independiente de las fuerzas y forma de las células individuales. Por ejemplo, es posible estirar una célula ovoide en una forma redonda perfectamente isotrópico, mientras que se aplica estiramiento uniaxial. Si las células no se entretejieron en micropatrones, estirado uniaxial resultados en la elongación celular, con la mayoría de células que tiene un eje largo alineado con el eje de estiramiento. Es entonces difícil separar el efecto de la alineación del eje largo y el efecto de la estiramiento aplicado a las células.

El dispositivo es adecuado para cualquier imagen de células vivas, incluyendo la microscopía fluorescente lapso largo de tiempo, y las drogas se puede añadir durante el experimento. La profunda método micropatterning UVs ¹⁰se describe en detalles en Azioune et al. ¹¹ Patrones de PDMS se describe en Azioune et al. ¹² El presente estiramiento protocolo es una versión de vídeo de Carpi et al. ¹³

Protocol

1. La pasivación de la PDMS

1. Corte un pedazo de PDMS aproximadamente 35 mm x 20 mm a partir de una hoja de pre-hechos (por ejemplo, GelPak, que se enumeran en la tabla de materias).
2. Quite la parte superior y las capas protectoras inferiores de plástico (si es necesario) y utilizar pinzas para colocar el PDMS en un plástico (no celular cultivo tratado) placa de Petri.
3. Lavar el PDMS con etanol al 70% durante 5 minutos en un rotador a 30 oscilaciones / min.
4. Seque la superficie por las corrientes de aire en él.
5. Iluminar con profunda UV (λ = 180 nm) durante 5 minutos a una distancia de las bombillas UV de unos 5 cm (ver hoja de Materiales para referencia lámpara; parámetros variarán para diferentes lámparas).
6. Preparar 200 l de solución de EDC / NHS para cada PDMS pieza (este debe estar preparado justo antes de su uso debido a que la reactividad de la solución se desintegra en cuestión de horas). Para 1 ml de 0,05 M MES + 0,5 M de tampón NaCl a pH 6,0, agregar 11,5 mg de sulfo-NHS y 19,2 mg de EDC.
7. Transferir elPDMS hojas de la placa de Petri a la tapa de la placa de Petri, que no ha sido iluminado. Esto asegurará que el entorno de los PDMS son muy hidrófobo y facilitar el siguiente paso.
8. Añadir la solución de EDC / NHS y se incuba durante 15 min a temperatura ambiente.
9. Enjuague EDC / NHS con agua.
10. Añadir la solución de PLL-g-PEG (0,5 mg / ml en HEPES 10 mM pH 8,6) y se incuba a partir de 3 horas a toda la noche a temperatura ambiente.
11. Enjuague el PLL-g-PEG con agua. PDMS pasivados (funcionalizadas con PLL-g-PEG) se pueden almacenar durante varios días a 4 ° C.

2. Patrones de la PDMS

1. Tome una hoja de PDMS y colocarlo en una fotomáscara de cuarzo sintético que lleva las microfeatures para modelar (ver Figura 1). Coloque el lado de PDMS que lleva el PLL-g-PEG hacia el lado del cromo de la fotomáscara.
2. Iluminar durante 7 min a través de la fotomáscara a una distancia de las lámparas UV de aproximadamente 5 cm.
3. Añadir agua en la máscara + PDMS y pelar las PDMS lentamente fuera de la máscara.
4. Incubar con solución de fibronectina a 50 mg / ml en tampón de HEPES a pH 8,6 durante 1 hora a temperatura ambiente. Es posible utilizar otras proteínas ECM, pero éstos no se han probado con este protocolo.
5. Lavar con PBS.

3. Montaje del dispositivo

1. Monte los PDMS previamente pasivado en el dispositivo de estiramiento (ver Discusión para solución de problemas).
   1. Una un lado del PDMS a la parte fija de la camilla.
   2. Fijar el otro lado a la parte móvil de la camilla sin sujeción demasiado de la hoja de PDMS.
2. Cortar un rectángulo de PDMS (22 mm x 19 mm) en una puñalada PDMS de espesor y cortar otro rectángulo interior con el fin de tener una piscina (o marco) que retendrá las células y los medios de comunicación (ver Figura 2).
3. Agregue grasa de silicona bajo este PDMS piscina y colóquelo en la parte superior de la hoja de PDMS para crear un medium retener piscina. La grasa permitirá que el deslizamiento de la piscina sobre la hoja de PDMS durante el estiramiento.

4. Modelar las celdas

1. Separar las células de un 50% de confluencia matraz de cultivo con Versene.
2. Contar las células y resuspender en una concentración de 200.000 células / ml.
3. Añadir 1 ml de la suspensión celular en la piscina (ver la discusión para más detalles).
4. Deje que las células se unen a los patrones durante 10-30 min (dependiendo del tipo de célula, las células de RPE-1 se llevará a 10 min y las células HeLa 20 min).
5. Enjuague suavemente las células flotantes con medio equilibrada (equilibre medio en incubadora).
6. Deje que las células se extienden por unos pocos horas en los patrones (necesitará RPE-1 por lo menos 2 horas, las células HeLa necesitarán 3 h).
7. Añadir un cubreobjetos en la parte superior de la piscina para evitar la evaporación y medio de fuga en caso de que el PDMS se rompe.
8. Coloque el dispositivo en un microscopio invertido y empezar de imágenes. Evite el uso de ob inmersión en aceitetivos, ya que no va a funcionar debido a problemas de enfoque.

5. Extensión

1. Gire el tornillo micrométrico, mientras que la corrección de la posición de etapa en el x-, y-, y el eje z (principalmente x). La posición de fase debe ser corregido para contrarrestar la ampliación de los PDMS y la pérdida de enfoque. (Consulte la sección "Durante el tramo" párrafo de la discusión).

Representative Results

La técnica presentada en este protocolo de vídeo permite la aplicación de fuerzas sobre las fibras de retracción de las células de mamíferos de la mitosis. De hecho, durante la división celular, en la etapa mitótica, células de mamífero se retraen para tomar la forma de una esfera y dejar atrás los cables de actina delgadas rodeadas por una membrana que se unen al sustrato. Estos cables (fibras de retracción), son la memoria de la geometría de la célula antes de entrar en división. Haciendo micropatrones con UV profunda a través de una fotomáscara en PDMS película delgada (Figura 1) permite el control geométrico de la adhesión celular. Al estirar el sustrato en el inicio de la metafase, algunas de estas fibras de retracción fueron sacados de distancia desde el cuerpo celular, resultando en una fuerzas mecánicas aplicadas en la corteza de la célula mitótica (Figura 3). Estas fuerzas se muestran para gobernar la orientación del eje del husillo ^9.

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Figura 1. Fotomáscara de cuarzo sintético teniendo micropatrones características.   A) photomask típico utilizado para modelar UV profunda. Se trata de una de 10 cm x 10 cm máscara binaria y las características son típicamente de alrededor de 20 micras de ancho para un solo patrón de células, con una resolución submicrónica. Cuadrados visibles a simple vista son el tamaño de un campo de microscopio de objetivo de 10X de vista. La ampliación muestra las funciones que corresponden a los patrones de células individuales (en este caso discos). Características son transparentes para permitir que las UVs profundas pasan a través. B) El PDMS se aplica sobre la fotomáscara, evitando cuidadosamente la formación de burbujas. El lado de PDMS pasivado está en contacto con el lado metálico de la fotomáscara. Los micropatrones se imprimirán en todo el PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver la imagen más grande.

Figura 2. La piscina.   Una piscina de PDMS se aplica en la hoja de PDMS. Grease está cubriendo el perímetro inferior de la piscina. La capacidad de la piscina es de alrededor de 2 ml de los medios de comunicación. La piscina se llena con medio de cultivo (en este caso el agua con fluoresceína aparece en amarillo). Para evitar la evaporación, un cubreobjetos se puede añadir en la parte superior. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

A) Antes de estirar. La célula se cultiva en placa sobre un modelo oval. Para lograr esto, el patrón se hace con el PDMS de ser estirado durante la impresión de patrones circulares a través de la fotomáscara. Se utiliza una fotomáscara roto hacia abajo (la pieza de la máscara es de aproximadamente 1,5 cm de diámetro). Para evitar romper una máscara, utilice un patrón de óvalo en el photomask e imprimirlo en una hoja de PDMS sin estirar. B) Después de estirar. El sustrato se estira como el patrón se convierte en un círculo. Haga clic aquí para ver la imagen más grande .

Discussion

Aunque esta técnica ha sido utilizada en numerosas ocasiones y es sometido a pruebas exhaustivas, hay varios pasos críticos que pueden llevar a un experimento fallido.

Acerca de los PDMS:

Para este trabajo, GelPak, una hoja de PDMS delgada disponible en el mercado, se utilizó. Alternativamente hojas PDMS se puede lanzar directamente desde la mezcla de PDMS. Le recomendamos que utilice GelPak porque es más reproducible, y es menos probable que se rompa en comparación con PDMS por encargo.

Acerca del dispositivo:

El dispositivo de estiramiento utilizada en este protocolo fue diseñado "en casa", pero también se puede aplicar la técnica micropatterning en camillas disponibles comercialmente como FlexCell. Opciones por encargo son más versátiles y mucho más barato.

Montaje del dispositivo:

El montaje de los PDMS puede conducir a la rotura. También es fácil para invertirlo y no hay forma de saber de qué lado estáque. Si el PDMS se sujeta demasiado, se vuelve más corta y esto puede conducir a la rotura (como la tensión será mayor para la misma distancia de estiramiento). Asegúrese de que los tornillos estén bien apretados o la hoja de PDMS se deslizarán en cuanto el tramo comienza o más tarde durante el experimento.

Adición de las células:

Para separar las células del sustrato de cultivo, es mejor utilizar EDTA 0,02% en PBS en lugar de tripsina. El uso de EDTA permitirá más rápido reconsolidación de las células en los patrones. Cuando se añaden las células a los PDMS, que deben estar bien separados unos de otros con el fin de obtener células individuales de unión al patrón. Una vez que están en suspensión, la pipeta varias veces con una punta de 200 l, que deberá romper los agregados. Acerca de 200.000 células deben añadirse a la superficie 4 cm ² con el fin de tener la unión a cada patrón. Utilizar un volumen pequeño de modo que las células se dividen rápidamente sobre la superficie. Si no hay células suficientes, mcualquier patrón permanecerán vacíos. Las células que no fueron acompañados deben ser expulsadas por la eliminación de medios tan pronto como suficientes células están ligados a los patrones. El tiempo antes de la descarga puede variar entre los tipos de células, pero 15 minutos es generalmente suficiente para que las células comienzan a unir los patrones. Si las células se dejan unir durante demasiado tiempo, los patrones serán ocupados por 2 o más células. Este paso se describe en ^13.

Durante la recta final:

Tenga mucho cuidado, mientras se estira, para no perder la posición de la región de interés. De hecho, durante el estiramiento, el PDMS se convertirán más amplia, y la posición de fase debe ser reajustado para compensar. Una combinación de un dispositivo de estiramiento y el software de control motorizado de la etapa puede ser desarrollado para compensar automáticamente para este efecto ^14. La camilla manual sencillo y versátil que se presenta aquí se puede actualizar para lograr esa compensación automatizada.

La po PDMSol puede escaparse si la grasa de silicona no fue colocado correctamente alrededor de la superficie. Asegúrese de que la instalación está sellado correctamente poniendo PBS dentro y vigilando cualquier fuga de las placas, las células en él.

Nuestra camilla permite un tramo de aproximadamente 30%, pero camillas de diseño personalizado podría permitir un mayor grado de estiramiento. Tenga cuidado ya que cuanto mayor es la tensión, mayor es el riesgo de la capa de última hora de PDMS.

Limitaciones:

Una de las principales limitaciones de la técnica que aquí se presenta es la falta de fácil estiramiento / destretching automática mediante un motor. Sin embargo, es posible adaptar un dispositivo de accionamiento en lugar de un tornillo micrométrico manual. Esta aplicación, junto con una programación específica del control microscopio puede permitir una compensación para el desplazamiento de la muestra durante el estiramiento.

Otro inconveniente es la dificultad de tener imágenes de alta resolución, porque el uso de objetivos de inmersión en aceiteduce movimientos del sustrato blando cuando el objetivo se mueve demasiado rápido. Esto se puede resolver utilizando agua (pero entonces la evaporación es un problema para los experimentos a largo plazo) o aceite muy fluido.

Las modificaciones y aplicaciones futuras:

En colaboración con Yanlan Mao y Nic Tapon del Instituto de Investigación del Cáncer (Londres, Reino Unido), se desarrolló una nueva versión de la camilla que permite dos capas de PDMS en la parte superior de uno al otro, con la muestra de estar en el medio, con el fin de pellizcar y estirar tejidos completos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141