Stretching Micropatterned Celler på en PDMS membran

Summary

Detta manuskript presenterar en teknik för att tillämpa eller frigöra krafter på vidhäftande celler eller vävnader med hjälp av enkelriktad stretching.

Abstract

Mekaniska krafter som utövas på celler och / eller vävnader spelar en viktig roll i ett flertal processer. Vi har utvecklat en anordning för att sträcka celler utstrukna på en polydimetylsiloxan (PDMS)-membran, kompatibel med avbildning. Denna teknik är reproducerbar och mångsidig. PDMS membranet kan micropatterned för att innesluta cellerna eller vävnaderna till en specifik geometri. Det första steget är att skriva ut micropatterns på PDMS membran med en djup UV-teknik. PDMS-membran monteras därefter på en mekanisk bår. En kammare är bundet ovanpå membranet med biokompatibelt fett för att tillåta glidning under sträckningen. Cellerna ympades och tilläts sprida sig i flera timmar på micropatterns. Provet kan sträckas och osträckta flera gånger med användning av en mikrometerskruv. Det tar mindre än en minut att applicera sträckan i full utsträckning (cirka 30%). Tekniken presenteras här inte inkluderar en motordriven enhet, som är nödvändigt för enpplying upprepade stretch cykler snabbt och / eller datorstyrda stretching, men detta kan genomföras. Sträckning av celler eller vävnader kan vara av intresse för frågor som rör cellkrafter, cell svar på mekanisk belastning eller vävnadsmorfogenes. Denna video presentation kommer att visa hur man undviker vanliga problem som kan uppstå när man gör den här typen av till synes enkla experiment.

Introduction

Cellerna komponera en vävnad i högre organismer är föremål för mekaniska spänningar och stretching krafter som kommer antingen från den yttre miljön eller från omgivande celler ^1,2. Cellerna måste anpassa sig till och stå emot dessa krafter för att bibehålla vävnadsintegritet. Sådana krafter är också viktiga för vävnader morfogenes under utveckling ^3,4. Tillämpa mekaniska krafter på odlade celler är ett sätt att efterlikna vad som kan hända i en vävnad, men med en kvantitativ och oberoende kontroll av cellform och cell deformation ^5,6. För detta ändamål kan flera metoder användas. Man kan trycka på cellerna (hela cellen eller delar av den), till exempel med hjälp av AFM eller derivat ^7,8 eller sträcka underlaget cellerna växer på.

Den metod som beskrivs i detta dokument visar hur man kan tänja en plan substrat pläterad med celler. Denna teknik utvecklades ursprungligen för att bedöma betydelsen av krafter som utövas på mitotic däggdjursceller ^9. Mitotiska celler hålla kontakten med substratet genom indragnings fibrer och sträckning av membranet utövas en kraft på de fibrer, vilka i sin tur framkallade vridningen av den mitotiska spolen. Intresset för att kombinera självhäftande micropatterns och stretching är att uppnå oberoende kontroll av krafter och formen på enskilda celler. Det är till exempel möjligt att sträcka en äggformad cell till en perfekt isotropa rund form, medan enaxlig sträckning appliceras. Om cellerna inte är platted på micropatterns, uniaxiell sträckning resulterar i cellförlängning, med de flesta celler har en längdaxel i linje med den sträckaxeln. Det är då svårt att särskilja effekten av den långa axeln anpassningen och effekten av sträckning appliceras till cellerna.

Enheten är lämplig för alla levande cell imaging, inklusive lång tid förflutit fluorescensmikroskopi, och droger kan läggas under experimentet. Den djupa UVs micropatterning metod ¹⁰beskrevs i detalj i Azioune et al. var ¹¹ Mönstring på PDMS beskrev Den nuvarande stretching protokollet i Azioune et al. ¹² är en videoversion av Carpi et al. ¹³

Protocol

1. Passivering av PDMS

1. Skär en bit av PDMS ca 35 mm x 20 mm från en redan gjord ark (t.ex. GelPak, som anges i tabellen av material).
2. Ta bort den övre och de undre skyddsskikt av plast (om nödvändigt) och använda en pincett för att placera PDMS i en plast (ej cellkultur behandlade) petriskål.
3. Tvätta PDMS med 70% etanol under 5 min på en rotator vid 30 oscillationer / min.
4. Torka ytan genom strömmande luft på den.
5. Belys med djup UV (λ = 180 nm) under 5 min vid ett avstånd från UV-lampor av ca 5 cm (se Material ark för lampen hänvisning; parametrar kommer att variera för olika lampor).
6. Förbered 200 l av EDC / NHS-lösning för varje PDMS bit (detta måste vara beredda strax före användning eftersom reaktiviteten av lösningen sönderfaller på några timmar). För 1 ml 0,05 M MES + 0,5 M NaCl buffert vid pH 6,0, tillsätt 11,5 mg sulfo-NHS och 19,2 mg EDC.
7. ÖverförPDMS ark från petriskålen till locket på petriskål, som inte har upplyst. Detta kommer att se till att omgivningen av PDMS är mycket hydrofoba och underlätta nästa steg.
8. Lägg EDC / NHS-lösning och inkubera i 15 minuter vid rumstemperatur.
9. Skölj EDC / NHS med vatten.
10. Lägg PLL-g-PEG-lösning (0,5 mg / ml i HEPES 10 mM pH 8,6) och inkubera från 3 h till över natten vid rumstemperatur.
11. Skölj PLL-g-PEG med vatten. Passiverad PDMS (funktionaliserats med PLL-g-PEG) kan lagras under flera dagar vid 4 ° C.

2. Mönstring av PDMS

1. Ta en PDMS plåt och placera den på en syntetisk kvarts fotomasker bära microfeatures för mönstring (se figur 1). Placera PDMS sidan bär PLL-g-PEG mot krom sidan av fotomasken.
2. Belys under 7 min genom fotomasken på ett avstånd från UV-lampor av ca 5 cm.
3. Tillsätt vatten på masken + PDMS och skala PDMS sakta bort masken.
4. Inkubera med fibronektin lösning vid 50 mg / ml i HEPES-buffert vid pH 8,6 under 1 h vid rumstemperatur. Det är möjligt att använda andra ECM-proteiner, men dessa har inte testats med detta protokoll.
5. Skölj med PBS.

3. Montering av enhet

1. Montera tidigare passive PDMS på sträckningsanordningen (se diskussion för felsökning).
   1. Fäst ena sidan av PDMS på den fasta delen av båren.
   2. Fäst den andra sidan till den rörliga delen av båren utan kläm alltför mycket av PDMS arket.
2. Skär en rektangel av PDMS (22 mm x 19 mm) i en tjock PDMS hugg och skär en annan rektangel inuti för att få en pool (eller ram) som kommer att behålla cellerna och media (se figur 2).
3. Lägg silikonfett enligt denna PDMS pool och placera den på toppen av PDMS arket för att skapa en medium behålla poolen. Fettet kommer att tillåta glidning i poolen över PDMS arket under sträckning.

4. Mönstring av Celler

1. Drag av cellerna från en 50% konfluens odlingskolv med Versene.
2. Räkna celler och återsuspendera dem i en koncentration av 200.000 celler / ml.
3. Tillsätt 1 ml cellsuspension i poolen (se Diskussion för ytterligare detaljer).
4. Låt cellerna binder till mönstren för 10 till 30 minuter (beroende på celltypen, RPE-1-celler kommer att ta 10 min och HeLa-celler 20 min).
5. Spola försiktigt flytande celler med till jämvikt medium (jämvikt medium i inkubator).
6. Låt cellerna sprids för några timmar på de mönster (RPE-1 behöver minst 2 timmar, HeLa-celler kommer att behöva 3 timmar).
7. Lägg på ett täckglas på toppen av poolen för att undvika avdunstning och mediumläckage vid PDMS raster.
8. Placera enheten på ett inverterat mikroskop och börja avbildning. Undvik att använda oljeimmersions obuppställda målen, eftersom det inte kommer att fungera på grund av att fokuseringsproblem.

5. Sträckning

1. Vrid mikrometerskruven samtidigt korrigera scenen positionen i x-, y-, och z-axeln (huvudsakligen x). Scenen ställning behöver rättas till för att motverka breddning av PDMS och förlusten av fokus. (Se "Under stretch" punkt i diskussionen).

Representative Results

Tekniken presenteras i denna video protokoll får tillämpningen av krafter på indragnings fibrer av mitotiska däggdjursceller. Faktum är att under celldelning, på den mitotiska stadiet mammalieceller dras att ta formen av en sfär och lämna bakom tunna aktin kablar omgivna av membran, vilka är fästa till substratet. Dessa kablar (indragnings fibrer), är minnet av cellgeometrin innan du går in i division. Making micropatterns med djup UV-genom en fotomask på PDMS tunn film (figur 1) tillät den geometriska kontrollen av cellvidhäftning. Genom sträckning av substratet vid inträde av metafas, vissa av dessa indragnings fibrer drogs bort från cellkroppen, vilket resulterar i en mekaniska krafter applicerade på den mitotiska cellens cortex (figur 3). Dessa krafter har visat att styra orienteringen av spindelaxeln ^9.

gur 1 "fo: innehåll-width =" 6in "fo: src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "width =" 600px "/>
Figur 1. Syntetisk Quartz Fotomask lager micropatterns funktioner.   A) Typisk fotomasker som används för djup UV-mönstring. Det är en 10 cm x 10 cm binär mask och funktionerna är vanligtvis på ca 20 nm bred för enskild cell mönstring, med en submikron upplösning. Kvadrat synliga med blotta ögat är storleken på ett 10X objektiv mikroskop synfält. Den blowup visar de funktioner som motsvarar enstaka cellmönster (här skivor). Funktioner är transparenta för att låta djupa UVs passera. B) Den PDMS appliceras på fotomasken samtidigt noggrant undviker uppkomsten av bubblor. Den passiverade PDMS sida är i kontakt med den metalliska sidan av fotomasken. De micropatterns skrivs över PDMS.g1highres.jpg "target =" _blank "> Klicka här för att visa en större bild.

Figur 2. Poolen.   En PDMS pool appliceras på PDMS arket. Fett täcker nedre omkrets poolen. Kapaciteten i poolen är cirka 2 ml av media. Poolen är fylld med odlingsmedium (här vatten med fluorescein visas i gult). För att undvika avdunstning, kan en täck läggas ovanpå. Klicka här för att visa en större bild .

A) Innan stretching. Cellen är pläterad på en oval mönster. För att uppnå detta är det mönstring sker med PDMS sträcks under intryck av runda mönster genom fotomasken. En uppdelad fotomask används (den bit av masken är ca 1,5 cm i diameter). För att undvika att bryta ner en mask, använd en oval mönstret på fotomasken och skriva ut det på ett icke sträckt PDMS ark. B) Efter stretching. Underlaget är utsträckt till exempel mönstret blir en cirkel. Klicka här för att visa en större bild .

Discussion

Även om denna teknik har använts flera gånger och är noggrant testad, det finns flera viktiga steg som kan leda till ett misslyckat experiment.

Om PDMS:

För detta arbete GelPak, en kommersiellt tillgänglig tunn PDMS ark, användes. Alternativt PDMS ark kan gjutas direkt från PDMS mix. Vi rekommenderar att du använder GelPak eftersom det är mer reproducerbar, och är mindre benägna att bryta jämfört med skräddarsydda PDMS.

Om enheten:

Sträckningen anordning som används i detta protokoll utformades "in house", men man kan också tillämpa micropatterning teknik på kommersiellt tillgängliga bårar som Flexcell. Skräddarsydda alternativ är mer mångsidig och mycket billigare.

Montering av enheten:

Monteringen av PDMS kan leda till avbrott. Det är också lätt att invertera det och det finns inget sätt att tala om vilken sida som ärsom. Om PDMS är fastklämd för mycket, blir det kortare och detta kan leda till avbrott (som spänningen kommer att vara större för samma avstånd av sträckning). Se till att skruvarna är ordentligt åtdragna eller PDMS arket glider så snart sträckningen börjar eller senare under experimentet.

Lägga cellerna:

För att lossa cellerna från odlingssubstrat, är det bättre att använda EDTA 0,02% i PBS istället för trypsin. Med hjälp av EDTA tillåter snabbare återbindning av cellerna på mönstren. När celler sattes till PDMS, måste de vara väl åtskilda från varandra i syfte att erhålla individuella celler som binder till mönstret. När de är i suspension, pipettera dem flera gånger med en 200 | il spets, vilket kommer att bryta upp aggregat. Om 200.000 celler måste läggas in på 4 cm ² yta för att ha bindande till varje mönster. Använd en liten volym så att cellerna faller snabbt på ytan. Om det inte är tillräckligt med celler, mnågra mönster kommer att förbli tom. De icke anslutna cellerna måste spolas ut genom media avlägsnas så snart som tillräckligt många celler är bundna till mönstren. Tiden innan spolning kan variera mellan olika celltyper men 15 min är i allmänhet tillräckligt för att cellerna ska börja att fästa till mönstren. Om cellerna finns kvar att fästa för länge, kommer mönster att upptas av två eller flera celler. Detta steg beskrivs i ^13.

Under sträckan:

Var extra försiktig, medan stretching, för att undvika att förlora positionen för regionen av intresse. Faktum är att under sträckan kommer PDMS bli bredare, och scenen läget måste justeras för att kompensera. En kombination av en motoriserad sträckningsanordning och styrprogramvara för steget kan utvecklas för att automatiskt kompensera för denna effekt ^14. Den enkla och mångsidiga manuell bår presenteras här kan uppgraderas för att uppnå en sådan automatisk kompensation.

PDMS pool kan läcka om fett kisel inte placerades på rätt runt ytan. Se till att installationen är korrekt förseglad genom att PBS inne och tittar på någon läcka innan plätering celler på det.

Vår bår tillåter en sträcka av ca 30%, men skräddarsydda bårar skulle kunna möjliggöra en högre grad av sträckning. Var försiktig eftersom den högre belastningen är desto större är risken för lagret PDMS bryta.

Begränsningar:

En av de viktigaste begränsningarna i den teknik som presenteras här är bristen på enkel automatisk sträckning / destretching med användning av en motor. Icke desto mindre är det möjligt att anpassa ett ställdon i stället för en manuell mikrometerskruv. Denna implementering, i kombination med en specifik programmering av mikroskopet kontroll kan tillåta kompensation för prov förskjutning under sträckning.

En annan nackdel är att det är svårt att ha hög upplösning avbildning, eftersom att använda oljeimmersions målducerar rörelser mjuka underlaget när målet rör sig för fort. Detta kan lösas med hjälp av vatten (men då avdunstningen är en fråga för långtidsförsök) eller mycket flytande olja.

Ändringar och framtida tillämpningar:

I samarbete med Yanlan Mao och Nic Tapon från Cancer Research Institute (London, UK), utvecklade vi en annan version av båren som tillåter två lager av PDMS ovanpå varandra, med provet att vara i mitten, för att nypa och sträcka ut hela vävnader.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141