PDMS Zarında Micropatterned Hücreler germe

Summary

Bu el yazması tek yönlü germe kullanarak yapışık hücreler ve dokular üzerindeki kuvvetleri uygulamak ya da serbest bırakmak için bir teknik sunuyor.

Abstract

Mekanik kuvvetler hücreleri üzerinde uygulanan ve / veya dokular, çok sayıda süreçlerinde önemli bir rol oynamaktadır. Bir polidimetilsiloksan görüntüleme ile uyumlu (PDMS) membran üzerine kaplanmıştır hücreleri uzatmak için bir cihaz geliştirdiler. Bu teknik, tekrarlanabilir ve çok yönlüdür. PDMS zar, belirli bir geometri için hücreler veya dokular sınırlandırmak amacıyla micropatterned edilebilir. İlk adım, bir derin UV tekniği ile PDMS membran üzerine micropatterns yazdırmaktır. PDMS zar daha sonra mekanik bir sedye üzerinde monte edilir. A odası boyunca uzanan kayma sağlamak için biyo-uyumlu yağı ile membran üzerine bağlıdır. Hücreler ekildi ve micropatterns birkaç saat boyunca yayılmasına izin verilir. Numune mikrometrik bir vida kullanımı ile birden çok kez gerilmiş gerek gerilmemiş edilebilir. Bu (% 30 civarında) tam ölçüde streç uygulamak için bir dakikadan az sürer. Burada sunulan tekniği için gerekli olan bir motorlu aygıt içermezhızlı bir şekilde ve / veya bilgisayar kontrollü gerilme tekrarlanan germe döngüsünden pplying, ancak bu uygulanabilir. Hücrelerin germe veya doku hücre kuvvetler, mekanik stres veya doku morfolojilerinden hücre yanıtı ile ilgili sorularınız için ilgi olabilir. Bu video sunumu görünüşte basit deney bu tür yaparken ortaya çıkabilecek tipik sorunları önlemek için nasıl gösterecektir.

Introduction

Yüksek organizmalarda bir doku oluşturan hücreler mekanik gerilimler ve dış ortamdan ya da çevreleyen hücrelerden ^1,2 dan ya geliyor germe güçlerine tabidir. Hücreler uyum ve doku bütünlüğünü korumak için bu güçlere direnmek gerekir. Bu tür güçler de kalkınma ^3,4 sırasında dokular morfogenezisi önemlidir. Kültürlü hücreler üzerinde mekanik kuvvet uygulayarak bir doku içinde neler olabileceğini taklit etmek bir yoldur, ancak hücre şekli ve hücre deformasyon ^5,6 nicel ve bağımsız kontrolü ile. Bunun için, çeşitli teknikler kullanılabilir. Bir (bütün hücre veya bunun bir parçası), örneğin, AFM veya ^7,8 türevleri ya da hücrelerin büyüdüğü alt tabakanın esneme kullanılarak hücreler üzerinde basın olabilir.

Bu yazıda anlatılan yöntem hücreleri ile kaplı bir uçak substratı germek için nasıl gösterir. Bu teknik, ilk olarak değerlendirmek için geliştirilmiştir kuvvetlerinin rolü m üzerine uygulananitotic memeli hücreleri ^9. Mitotik hücreler geri çekme elyafların yoluyla alt-tabakaya bağlı kalmak ve membran germe da mitotik iğin dönmesini tahrik lifleri üzerine bir kuvvet uygulamıştır. Yapışkan birleştirme micropatterns ve germe kuvvetleri ilgi ve tek tek hücreler şeklinde bağımsız kontrol elde etmektir. Bu, tek eksenli germe uygulanır ise, mükemmel bir şekilde izotropik yuvarlak şekil, bir oval hücre uzatmak için, örneğin mümkündür. Hücreler micropatterns platted değilseniz, tek eksenli en hücreler germe ekseni ile hizalanan uzun bir eksene sahip olan, hücre uzaması sonucu germe. Bu, uzun eksen hizalama ve hücrelere uygulanan gerilme etkisinin etkisini ayırmak için daha sonra zordur.

Cihaz, uzun zaman atlamalı floresan mikroskobu da dahil olmak üzere herhangi bir canlı hücre görüntüleme için uygun olan, ve uyuşturucu deney sırasında ilave edilebilir. Derin UV'lerin micropatterning yöntemi ¹⁰Azioune ayrıntılı olarak tarif edilmiştir ve ark. PDMS ¹¹ Desen nitelendirildi Azioune et al. ¹² de protokol uzanan Mevcut Carpi et al. ¹³ içeren bir video versiyonu

Protocol

1.. PDMS pasivasyon

1. PDMS bir parça kesin yaklaşık olarak önceden yapılmış tabakasından x 20 mm 35 mm (örneğin, GelPak, malzeme tabloda listelenen gibi).
2. Plastik üst ve alt koruma tabakaları çıkarın (gerekli ise) ve Petri çanağı (muamele edilmiş kültür hücre) bir plastik PDMS yerleştirmek için cımbız kullanın.
3. / Dakika 30 salınım ile bir karıştırıcı üzerine 5 dakika için% 70 etanol ile PDMS yıkayın.
4. Bunun üzerine akan hava ile yüzeyi kurulayın.
5. Yaklaşık 5 cm UV ampullere göre belirli bir mesafede, 5 dakika için derin UV (λ = 180 nm) ile aydınlatma imkanını (lamba referans malzemeleri tabloya bakın; parametreleri farklı lambalar için değişir).
6. Her bir parça PDMS için EDC / NHS çözeltisi 200 ul (solüsyonun reaktivitesi saat meselesi çürükleri için bu kullanımdan hemen önce hazırlanmalıdır) hazırlayın. PH 6.0 'da 0.05 M MES + 0.5 M NaCl tampon, 1 ml için, Sülfo-NHS 11.5 mg ve 19.2 mg EDC ekleyin.
7. TransferiIşıklı edilmemiştir Petri kabı, bir kapağa Petri kabı PDMS levhalar. Bu PDMS çevresi çok hidrofobik olmasını sağlamak ve bir sonraki adımı kolaylaştıracaktır.
8. EDC / NHS solüsyonu ilave edin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
9. Su ile EDC / NHS durulayın.
10. PLL-PEG-g çözelti (10 mM HEPES pH 8.6 içinde 0.5 mg / ml) ilave edilir ve 3 saat için oda sıcaklığında gece boyunca ikinci inkübe edin.
11. Su ile PLL-PEG-g durulayın. (G-PLL-PEG ile işlevselleştirilmiş) pasifleştirilmiş PDMS 4 ° C'de birkaç gün boyunca saklanabilir

2. PDMS desenlendirilmesi

1. PDMS levha alın ve desenlendirme için microfeatures taşıyan bir sentetik kuvars photomask üzerine yerleştirin (bkz. Şekil 1). PLL-g-PEG photomask krom yan bakan taşıyan PDMS tarafını yerleştirin.
2. Yaklaşık 5 cm UV ampullere göre belirli bir mesafede, fotomaske yoluyla, 7 dakika boyunca yanar.
3. Maske + PDMS üzerine su ekleyin ve yavaş yavaş maske kapalı PDMS soyun.
4. Oda sıcaklığında 1 saat süre ile pH 8.6 de HEPES tamponu içinde 50 mg / ml 'de fibronektin çözeltisi ile inkübe edin. Bu diğerleri ECM proteinleri kullanmak mümkündür, ancak bunlar bu protokol ile test edilmemiştir.
5. PBS ile durulayın.

3. Cihaz montaj

1. Germe cihazı (sorun giderme için Tartışma) üzerine önceden pasifize PDMS monte edin.
   1. Sedyenin sabit kısmına PDMS bir tarafı takın.
   2. PDMS tabakanın çok fazla sıkıştırma olmadan sedyenin mobil kısmına diğer tarafı düzeltildi.
2. Kalın bir PDMS bıçak içinde PDMS bir dikdörtgen (22 mm x 19 mm) kesme ve (Şekil 2 ye bakınız) hücreleri ve medya koruyacaktır bir havuz (ya da çerçeve) elde etmek için içine bir dikdörtgen kesin.
3. Bu havuzu PDMS altında silikon gres ekleyin ve bir med oluşturmak için PDMS levha üstüne yerleştirinyum havuzu muhafaza eder. Yağ germe sırasında PDMS tabaka üzerine havuzun kayma sağlayacaktır.

4. Hücreleri Desenlendirme

1. Versene ile% 50 confluency kültür şişesi hücreleri çıkarın.
2. Hücre sayımı ve 200,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda tekrar süspansiyon bunları.
3. Havuzda hücre süspansiyonu 1 ml (ek ayrıntılar için Tartışma) ekleyin.
4. Hücreler (RPE-1 hücreleri, 10 dakika ve HeLa hücreleri 20 dakika sürer, hücre tipine bağlı olarak) 10-30 dakika boyunca desen bağlanan olsun.
5. Yavaşça dengelenmiş ortamda (inkübatör ortamı dengeye) ile yüzen hücreleri yıkayın.
6. Hücreler desenleri birkaç saat boyunca yayalım (RPE-1 en az 2 saat gerekir; HeLa hücreleri 3 saat ihtiyacınız olacak).
7. PDMS tatili durumda, buharlaşma ve orta sızıntıyı önlemek için havuz üstünde bir lamel ekleyin.
8. Ters bir mikroskop cihazı koymak ve görüntüleme başlar. Immersiyon yağı ob kullanmaktan kaçınınnedeniyle odaklanma sorunları için çalışmaz gibi alamayarak hedeflere ulaşamama riski.

5. Germe

1. X-, y-ve z-ekseni (özellikle x) 'de aşama pozisyon düzeltme sırasında mikrometrik vidasını. Aşama pozisyon PDMS genişletme ve odak kaybına karşı koymak için düzeltilmesi gerekmektedir. (TARTIŞMA paragraf "streç sırasında" bak).

Representative Results

Bu ekran protokol sunulan teknik mitotik memeli hücrelerinin geri çekme lifleri üzerinde kuvvetlerinin uygulanmasını izin verdi. Gerçekten de, hücre bölünmesi esnasında, mitotik aşamasında, memeli hücreleri bir küre şeklini alır ve alt-tabakaya bağlı olan ince bir zar ile çevrili aktin kabloları geride bırakmak için çekin. Bu kablolar (geri çekilme lifler), bölünme girmeden önce hücre geometri hafızası vardır. PDMS ince film bir fotomaske aracılığıyla derin UV micropatterns yapmak (Şekil 1) hücre yapışmasının geometrik kontrol sağladı. Metafaz başlangıcında alt-tabakanın germe olarak, bu geri çekme elyafın bir kısmı, mitotik hücre korteks (Şekil 3) üzerine uygulanan bir mekanik kuvvet ile sonuçlanır uzaklıkta hücre gövdesinden çekilmiştir. Bu kuvvetler mil ekseni ⁹ yönünü idare gösterildi.

"fo: src =" 6in: "içerik-width = fo" Güre 1 / files/ftp_upload/51193/51193fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51193/51193fig1.jpg "width =" 600px "/>
Şekil 1. Micropatterns özelliklerini taşıyan Sentetik Kuvars Photomask.   Derin UV desenlendirme için kullanılan A) Tipik photomask. Bu, bir 10 cm x 10 cm, ikili maske ve özellikleri, bir mikron-altı çözünürlüğe sahip, tek bir hücre modelleme için tipik olarak yaklaşık 20 mm genişliğinde vardır. Çıplak gözle görülebilir Kareler görüş 10X objektif mikroskop alanının boyutu vardır. Blowup tek hücre desenleri (burada diskler) karşılık özelliklerini göstermektedir. Özellikler derin UV'lerin dikkatlice kabarcıkların oluşumunun önüne geçilirken PDMS photomask uygulanır. B) geçmesine izin vermek için saydamdır. Pasifleştirilmiş PDMS yan photomask metalik tarafı ile temas halindedir. Micropatterns tüm PDMS üzerine basılacaktır.g1highres.jpg "target =" _blank "> büyük resmi görebilmek için buraya tıklayın.

Şekil 2. Havuz.   Bir PDMS havuz PDMS kağıda uygulanır. Gres havuzun alt çevresini kapsayan. Havuzun kapasitesi ortamının yaklaşık 2 ml'dir. Havuz, kültür ortamı ile doldurulur (burada floresan ile sarı su görünür). Buharlaşmayı önlemek için, bir lamel üstüne eklenebilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

A) üzerine micropatterned RPE-1 hücrenin Faz kontrastlı görüntüler. Hücre oval bir model üzerine yerleştirilir. Bunu başarmak için, model verilmesi de photomask dolaşarak kalıplarının gösterim sırasında gerildikten PDMS ile yapılır. Bir kırılmış photomask (maske parçası çapı yaklaşık 1.5 cm) kullanılır. Bir maskeyi kesmemek için germe sonra, photomask oval bir desen kullanmak ve onu). B esnetilmemiş bir PDMS kağıda yazdırın. Tabaka desen bir daire olur gibi gerilir. resmi büyütmek için buraya tıklayın .

Discussion

Bu teknik çok kez kullanılan ve iyice test olmasına rağmen, başarısız bir deney yol açabilir çeşitli kritik adımlar vardır.

PDMS Hakkında:

Bu iş için, GelPak, piyasada mevcut ince PDMS levha kullanılmıştır. Alternatif PDMS yaprak PDMS karışımı doğrudan döküm alınabilir. Daha tekrarlanabilir ve özel yapılmış PDMS'nin kıyasla kırmak için daha az olasıdır, çünkü GelPak kullanmanızı öneririz.

Cihaz hakkında:

Bu protokolde kullanılan germe cihazı "evinde" tasarlanmıştır, ama bir de Flexcell gibi piyasada mevcut sedyede micropatterning tekniğini uygulayabilirsiniz. Özel yapılmış seçenekler daha çok yönlü ve çok daha ucuz.

Cihazı Montaj:

PDMS montaj kırılma yol açabilir. Ayrıca, bunu tersine çevirmek kolay ve hangi tarafı anlatmak için hiçbir yolu yokturedilmektedir. PDMS çok kenetlenir, bu daha kısa hale gelir ve bu, (gerilme streç aynı mesafe için daha büyük olacak gibi) kırma yol açabilir. Emin olun vidalar iyice sıkılır veya PDMS levha kısa sürede streç deney sırasında daha sonra başlar ya da kayacak.

Hücreleri ekleme:

Kültür alt tabakadan hücreleri ayırma için, PBS yerine, tripsin EDTA,% 0.02 kullanmak daha iyidir. EDTA kullanarak kalıpları üzerinde hücrelerin hızlı bir yeniden birleştirme sağlayacaktır. Hücreler PDMS eklendiğinde, iyi model bağlanabilen tek tek hücrelerin elde etmek amacıyla birbirinden ayrılmalıdır. Onlar süspansiyon girdikten sonra, 200 ul ucu ile onlara birkaç kez pipet, bu asfaltları kıracak. Yaklaşık 200.000 hücreler her bir desen için bağlanma elde etmek için 4 ^cm2 yüzey üzerine eklenmelidir. Hücreler yüzeye hızla düşmek böylece küçük bir hacim kullanın. Yoksa yeterli hücre, mHerhangi bir desen boş kalır. Bağlı olmayan hücreleri gibi kısa sürede yeterli hücre alışkanlıklarına bağlı olarak ortam uzaklaştırılarak yıkanmalıdır. Temizleme önce zaman hücre tipleri arasında değişebilir, ancak 15 dakika hücreler kalıpları takmak başlamak için genellikle yeterlidir. Hücreler, çok uzun süre boyunca birleşmeye bırakılır, şekiller 2 ya da daha fazla hücre tarafından işgal edilir. Bu adım ¹³ 'de tarif edilmektedir.

Streç sırasında:

Ilgi bölgenin konumunu kaybetmemek için, germe sırasında, ekstra dikkatli olun. Gerçekten de, germe sırasında, PDMS daha geniş olacak, ve sahne konum telafi etmek için yeniden ayarlanması gerekmektedir. Sahne, bir motorlu germe cihazı ve yazılım kontrolü bir arada otomatik olarak bu etki ¹⁴ telafi etmek için geliştirilebilir. Burada sunulan basit ve çok yönlü manuel sedye gibi otomatik tazminat elde etmek için yükseltilmiş olabilir.

PDMS posilikon gres yüzeyi etrafında düzgün yerleştirilmiş değilse ol sızıntı olabilir. Kurulum doğru üzerinde hücreleri kaplama önce içindeki PBS koyarak ve herhangi bir sızıntı izleme tarafından kapatılmış olduğundan emin olun.

Bizim sedye yaklaşık% 30 bir streç verir, ancak özel olarak tasarlanmış sedye uzanan yüksek bir derecesi için izin verebilir. Suşu yüksek gibi dikkatli olun, yüksek PDMS katman kırılma riski.

Sınırlamalar:

Burada yer alan teknik ana sınırlamalar biri bir motor kullanılarak kolayca otomatik germe / destretching eksikliğidir. Bununla birlikte, bunun yerine, bir el ile mikrometrik bir vida bir aktüatör uyarlamak mümkündür. Mikroskop kontrolü belirli bir programlama ile birleştiğinde Bu uygulama, germe sırasında numune değiştirmesi için tazminat izin verebilirsiniz.

Yağ daldırma amaçları için kullanırken diğer bir dezavantajı, yüksek çözünürlüklü görüntüleme sahip zorluğuduramaç çok hızlı hareket yumuşak substratın Duces hareketleri. Bu su ile çözülebilir (ama sonra buharlaşma uzun süreli deneyler için bir konudur) ya da çok sıvı yağ.

Değişiklikler ve gelecekteki uygulamalar:

Kanser Araştırma Enstitüsü (Londra, İngiltere) Yanlan Mao ve Nic tapón ile işbirliği içinde, biz çimdik amacıyla, örnek ortada olmak, birbirlerinin üstüne PDMS'nin iki katmanları sağlar sedye başka bir sürümünü geliştirdi ve bütün dokuları germek.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GelPak	GelPak	PF-60-X4	Different thickness/stickiness are available. One alternative could be to cast your PDMS yourself.
Silicon grease	GE Bayer Silicones	Baysilone-Paste	This one is biocompatible
Stretching device	GREM mécanique	Stretcher 2011
EDC (N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)	Sigma	3450	Stable 6 months at -20 °C
NHS (N-Hydroxysulfosuccinimide sodium salt)	Sigma	56485	Protect from humidity
Pll-g-peg (PLL(20)-g[3.5]-PEG(2) 20 mg)	SurfaceSolutions (Zurich)
Synthetic Quartz photomask	Toppan		Take standard binary photomask in Quartz
Fibronectin from bovine plasma	Sigma	F1141