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Behavior

Barnes Maze Stratégies de test avec les petites et grandes des modèles de rongeurs

Published: February 26, 2014 doi: 10.3791/51194
Automatic Translation
*1, *2
1Biomedical Sciences and Bond Life Sciences Center, University of Missouri, 2Division of Neurotoxicology, National Center for Toxicological Research, Food and Drug Administration
* These authors contributed equally

Summary

La terre sèche Barnes labyrinthe est largement utilisé pour mesurer la capacité de la navigation spatiale en réponse à des stimuli aversifs légèrement. Sur des jours consécutifs, la performance (par exemple, la latence pour localiser évasion cage) des sujets de contrôle améliore, indicatif de l'apprentissage et de la mémoire normale. Les différences entre les rats et les souris nécessitent appareils et méthodologie changements qui sont détaillées ici.

Abstract

L'apprentissage spatial et la mémoire des rongeurs de laboratoire est souvent évaluée par la capacité de navigation dans des labyrinthes, le plus populaire de qui sont les (Barnes) labyrinthes de l'eau et des terres arides. Amélioration des performances sur des sessions ou des essais est pensé pour refléter l'apprentissage et de la mémoire de l'emplacement évasion cage / plate-forme. Considéré comme moins stressant que les labyrinthes de l'eau, le labyrinthe Barnes est relativement simple conception d'un haut de forme circulaire avec plusieurs trous équidistants sur le bord de périmètre. Tous sauf un des trous sont à double fond ou aveugles fin, tandis que l'un mène à une cage d'échappement. Stimuli aversifs légèrement (par exemple, plafonnier lumineux) fournissent la motivation pour localiser la cage d'échappement. Latence de localiser la cage d'échappement peut être mesuré pendant la session, mais des effets supplémentaires nécessitent généralement l'enregistrement vidéo. De ces enregistrements vidéo, l'utilisation d'un logiciel de suivi automatisé peut générer une variété de paramètres qui sont semblables à celles produites dans des labyrinthes d'eau (par exemple </ Em> la distance parcourue, la vitesse / vitesse, le temps passé dans le quadrant correct, le temps passé en mouvement / repos, et la confirmation de latence). Type de stratégie de recherche (c.-à-aléatoire, serial ou directe) peut être classé comme bien. Barnes construction et d'essais labyrinthe méthodologies peuvent différer pour les petits rongeurs, tels que des souris, des rongeurs et des grands, tels que les rats. Par exemple, alors que les indices extra-labyrinthe sont efficaces pour les rats, les rongeurs sauvages plus petits peuvent exiger intra-labyrinthe des indices avec une barrière visuelle dans le labyrinthe. Stimuli appropriés doivent être identifiés qui motivent le rongeur pour localiser la cage d'échappement. Les deux Barnes et labyrinthes d'eau peuvent être de temps que 4-7 essais de test sont généralement nécessaires pour détecter amélioration de l'apprentissage et de la mémoire (par exemple, la performance des temps de latence plus courts ou des longueurs de trajet pour localiser la plate-forme d'évasion ou de la cage) et / ou des différences entre les groupes expérimentaux. Même ainsi, le labyrinthe Barnes est une évaluation comportementale largement utilisée mesurer les capacités de navigation spatiale etleur risque de perturbation par des manipulations génétiques, neuro-comportementaux, ou l'exposition médicament / substance toxique.

Introduction

L'apprentissage spatial et la mémoire chez les rongeurs de laboratoire a d'abord été évaluées chez des rats privés de nourriture qui naviguaient un dédale de ruelles pour trouver un renforçateur alimentaire 1. Plusieurs décennies plus tard, un système de mémoire de référence spatiale a été proposé 2. Contrairement à la mémoire de travail qui se réfère à la mémoire d'une session ou d'un procès test, la mémoire de référence correspond à la mémoire à travers des sessions ou des essais de test et est plus étroitement lié à la mémoire à long terme.

Plusieurs types de labyrinthes ont été développés comme des évaluations non invasives de cet apprentissage de l'hippocampe-dépendante spatial et la mémoire dans les petites et grandes rongeurs (par exemple labyrinthe d'eau, labyrinthe en T multiple, bras radial et labyrinthe labyrinthes de terre sèche) 3-6. Ici, nous nous concentrons sur la plate-forme circulaire ou Barnes labyrinthe, décrite pour la première en 1979 par le Dr Carol Barnes 7. Ce labyrinthe a été utilisée pour tester l'apprentissage de la navigation spatiale et de la mémoire dans un large éventail de modèles de rongeurs, notamment les rats (RaTTU norvegicus), souris (Mus musculus), souris sylvestres (Peromyscus maniculatus bairdii), les souris Californie (Peromyscus californicus), et les rongeurs hystricomorphes (par exemple, les octodons [octodon Octodon]) 8-13. D'autres espèces évaluées en utilisant le labyrinthe Barnes comprennent blattes américaines (Periplaneta americana), 14 serpents de maïs (Elaphe guttata guttata) 15,   reptiles squamates (par exemple, les lézards de côté-blotched [Uta stansburiana]) 16, et les primates non humains (par exemple, les lémuriens de souris [Microcebus murinus]) 17. Dans nos laboratoires, les performances du labyrinthe Barnes a été utilisé comme un indice de la neurotoxicité développementale après bisphénol A (BPA) ou de l'éthinylestradiol (EE2) exposition 9-1113. Il est aussi couramment utilisé pour le comportement phénotypage de diverses souches de souris 18-21, l'évaluation des effets du vieillissement 7,22-28, et la définition de la maladie d'Alzheimer liéeicits dans des modèles animaux 3,29-33, ainsi que les effets de l'exercice et les modifications alimentaires, de l'environnement, et métabolique 34-42.

Un des principaux avantages de l'utilisation de Barnes labyrinthe est qu'il induit moins de stress dans les sujets relatifs à labyrinthes d'eau, tels que l'eau de Morris 43, même si les deux peuvent induire une augmentation de courte durée à des concentrations de corticostérone plasmatiques chez des souris 44. Comme un labyrinthe de la terre ferme, le labyrinthe Barnes peut être plus éthologique pertinentes pour les rongeurs terrestres 45. Bien que les performances de labyrinthe d'eau a été montré pour être plus sensibles aux altérations génétiques chez la souris 3,46,47, la performance en labyrinthe Barnes est plus sensible aux modifications de certaines autres 48,49. Dans les modèles de rongeurs où l'utilisation du labyrinthe d'eau n'est pas possible, le labyrinthe Barnes peut fournir une évaluation de la fine de la rétention de la mémoire spatiale 31. Les stimuli aversifs légèrement généralement utilisés dans le labyrinthe Barnes (feux lumineux), c'est à direcependant, ne peut pas fournir une motivation suffisante pour le rongeur pour localiser la cage d'échappement 45. En outre, les rongeurs peuvent apprendre qu'aucune sanction se produit si elles n'entrent pas dans la cage d'échappement. Ainsi, au lieu de chercher activement pour la cage d'évacuation, certains rongeurs explorer activement le labyrinthe pour de longues durées de chaque essai. Comme examiné par Kennard et Woodruff-Pak 24, cette exploration accrue permettra de prolonger le temps de latence pour localiser la cage d'échappement, la longueur du trajet, et d'augmenter le nombre d'erreurs. Ainsi, la mesure de plusieurs paramètres, y compris les temps de latence, taux d'erreur, le temps passé dans les quadrants correctes et incorrectes, la vitesse, le temps en mouvement, le temps de repos, et de la stratégie de recherche, peut collectivement fournir un meilleur indicateur de l'espace d'apprentissage de la navigation et de la mémoire capacité de chaque sujet 8 -10. En outre, la performance peut être mesurée comme le temps de latence pour trouver la première cage d'échappement (mesure primaire) ou la latence pour entrer dans la cage d'échappement (mesure totale). Certains ont argued que les mesures primaires de performance sont un reflet plus précis de l'apprentissage spatial de mesures au total 50. La plupart des études, y compris les exemples décrits ici, utiliser la latence pour entrer dans la cage d'échappement pour déterminer le taux d'erreur et de la stratégie de recherche. En outre, certains systèmes de logiciels de suivi ont un système de détection de corps en trois points qui permet de mesurer les fréquences de renifler les trous vs incorrectes correctes. Enfin, le labyrinthe doit être nettoyé avec de l'éthanol entre les essais pour éliminer les signaux olfactifs qui pourraient fournir des indices ou prouver gênant pour animaux ultérieures.

Barnes conceptions de labyrinthe varier, mais en général ont chacun 12 ou 20 trous d'échappement potentiels, dont un seul conduit à la maison ou une cage d'échappement. La cage d'échappement peut être situé directement sous le trou d'évacuation sur le dessus du labyrinthe (pour des labyrinthes sans murs) ou intégré dans le mur d'enceinte du labyrinthe. Les repères peuvent varier en taille d'environ 16,5 cm de hauteur ou de la largeur (dans la maze) à une ligne horizontale de 21,6 cm de largeur placées du sol au plafond de la paroi de la chambre à l'extérieur du labyrinthe. Figures 1-5 montrent des exemples de Barnes conceptions de labyrinthe pour les espèces Peromyscus (figure 1) et les rats (figures 2-5). Bouchons ou faux fonds doivent couvrir les trous de nonescape pour empêcher l'animal de tomber hors du labyrinthe. Taille de la chambre d'essai peut varier (~ 20 m 2), mais il doit être suffisamment grand pour fournir suffisamment d'espace pour le labyrinthe, habituer les animaux à la salle, pouvant accueillir un ordinateur avec vidéo set-up (le cas échéant), et un lieu pour l'expérimentateur de s'asseoir à une distance (au moins 122 cm ~) à partir de l'appareil de labyrinthe de telle sorte que leur présence n'interfère pas avec la performance de l'animal. Affectation de l'emplacement de la cage d'échappement doit être équilibrée entre les groupes de traitement et le sexe. Alors que les procédures spécifiques décrites ici ne comprennent pas tourner le labyrinthe entre les essais pour décourager l'utilisation des intra-labyrinthe odeur indices, certaines étudesintégrer cette procédure 50. Dans nos procédures, le labyrinthe est nettoyé avec de l'éthanol entre les essais pour éliminer les odeurs repères.

En localisant la cage d'évacuation, trois types de stratégies de recherche ont été définis (à l'origine appelés «modèles» de Barnes 7): 1) aléatoires, définies sur le plan opérationnel que des recherches localisées de trous séparés par des chemins qui traversent le centre du labyrinthe, 2) de série, définis comme une recherche systématique de trous consécutifs dans un sens horaire ou antihoraire, et 3) direct ou spatiale, définie comme la navigation directement au quadrant correct sans traverser le centre du labyrinthe plus d'une fois et avec trois ou moins d'erreurs. En général, à des tests répétés, rongeurs progressent généralement à travers les stratégies de recherche dans l'ordre indiqué (au hasard, de série, et direct) 51. Un essai de sonde sans la cage d'échappement peut également être utilisée comme mesure supplémentaire de la mémoire 50.

Le protocole et représentantrésultats ici ont été élaborés pour deux types de rongeurs (petits rongeurs appelés Peromyscus espèces contraire) et les rats. Bien que ces procédures générales peuvent aussi tenir des souris consanguines et / ou consanguine (Mus musculus), d'autres études doivent être consultés sur les différences de méthodologie potentiels pour ces dernières espèces 18-21.

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Protocol

Une. Barnes procédure Maze pour les petits rongeurs

  1. Allumez les lumières aériennes au-dessus du labyrinthe et le lieu «Ne pas retourner" signes à l'extérieur de la porte du laboratoire.
  2. Apportez souris dans leurs cages normales de la chambre d'essai d'environ 30 minutes avant le début du premier procès pour permettre l'accoutumance. Si la pièce est calme, il peut ne pas être nécessaire d'inclure un bruit blanc, sinon cette mesure de précaution peut être considéré.
  3. Mettre en place le programme de suivi.
  4. Retirez délicatement la première souris de sa cage et placer dans la boîte de plastique recouvert de hauteur. Placez son évasion (de maison propre) polypropylène cage (29 cm x 19 cm x 13 cm) sous le trou d'évacuation désigné.
    1. Vérifier que le papier qui bloque le tube est retiré de ce trou d'évacuation et de tous les autres trous sont bouchés.
    2. Dessinez rideau dans le labyrinthe.
  5. Placez la boîte en plastique avec la souris à l'intérieur dans le centre du labyrinthe et environ 8 secondes plus tard, doucement take l'animal hors de la cage et le placer sur le labyrinthe.
    1. Après avoir placé l'animal dans le centre du labyrinthe, se déplacer doucement vers la zone de l'ordinateur (~ 150 cm du labyrinthe).
    2. Lancer le logiciel de suivi approprié qui devrait déjà être ouverte afin d'assurer un minimum de temps (quelques secondes) s'est écoulée entre le moment où l'animal a été placé sur le labyrinthe jusqu'à ce que le programme commence documenter ses performances.
  6. Observer la performance de l'animal de moniteur d'ordinateur et enregistrer le numéro du trou, le nombre de procès, la stratégie de recherche, et le nombre d'erreurs commises. Une erreur est définie comme renifler d'un trou incorrects. Évaluation de la stratégie de recherche peut être faite en direct ou tard sur la base du modèle de suivi.
    1. stratégie de recherche est classé comme directe (aller directement dans la cage d'échappement avec 3 erreurs ou moins),
    2. Série (voyage le long du périmètre de labyrinthe jusqu'à la cage d'échappement est situé), ou
    3. Aléatoire </ Strong> (traversant le centre du labyrinthe à plusieurs reprises pour vérifier les différents trous).
  7. Arrêtez le programme de suivi lorsque l'animal a quatre pattes à l'intérieur de la cage d'échappement.
  8. Si la souris ne entrer dans la cage d'échappement à moins de 5 min, guider doucement vers l'emplacement correct et dans la cage d'échappement. Que la souris restent dans la cage d'échappement pendant 2 min.
  9. Retirez la souris de la cage d'évacuation et placer dans un cage.
  10. Vaporiser le dessus du labyrinthe et échapper cage avec 70% d'éthanol et essuyez. Réglez la première cage / souris de côté pendant 30 minutes avant de lancer son second procès.
  11. Avant de commencer la prochaine souris, boucher le trou d'évacuation auparavant correcte et retirer le bouchon de papier bloquant le trou du trou d'évacuation désigné pour ce sujet prochaine.
  12. Chaque souris est testée pour deux essais / jour avec un intervalle entre les essais d'environ 30 min.
  13. Répétez ces étapes jusqu'à ce que toutes les souris ont été testées pendant sept jours consécutifs, ce qui peut augmenter la probabilité of observer une amélioration des performances et / ou les différences entre les groupes de traitement, par rapport à seulement quatre jours de données.

2. Test Maze Barnes pour rats Quand un programme de surveillance est indisponible

  1. S'assurer que le labyrinthe est dans sa position correcte (directement centrée sous des lumières), double fond qui bloquent les trous nonescape et empêchent l'animal de tomber sont en sécurité dans le labyrinthe, et la cage d'échappement est à l'endroit désigné pour le premier sujet. Plafonniers au-dessus du labyrinthe doivent être allumés.
  2. Assurez-ordinateur et l'appareil photo sont prêts et un chronomètre est disponible.
  3. Mettez bruit blanc pour atténuer des bruits provenant d'autres lieux à proximité. Le président de la testeur est d'environ 122 cm du bord le plus proche du haut de labyrinthe et reste dans le même endroit tout au long de l'essai.
  4. Une minuterie (fixé à 2 min) devrait être disponible (uniquement nécessaire le jour 1 de l'essai). Minuterie ne doit pas "bip" ou autrement faire du bruit. Porte (s) de tester room devrait avoir "Ne pas entrer" signe sur l'extérieur.
  5. Une feuille de commande de test pour les sujets listera l'ordre des essais de l'objet, le numéro de session, l'emplacement du trou numéro de la cage d'échappement pour chaque sujet, et les zones d'enregistrer la latence et le temps de la journée pour chaque sujet ainsi qu'une zone pour toute notes nécessaires (figure 6).
  6. De 30 à 60 min avant la première rat est à tester, mettre les animaux dans leurs cages d'accueil à la chambre de test afin de permettre l'accoutumance.
  7. Le tube central que le rat est placé dans au début d'un essai est fixée au centre du labyrinthe. Définir la feuille de carton montrant la première identification des animaux sur le dessus. Cela permet l'enregistrement vidéo pour capturer l'identification des animaux pour faciliter l'identification de chaque objet en observant les quelques premières secondes de la vidéo.

Initiale Journée Test 1:

  1. Commencez ordinateur enregistrement vidéo (le cas échéant) et comprennent environ 5 secondes de l'essai avec la feuille d'identification des animaux pour subject identification. Nom de fichier (ou date de création) identifieront jour / moment du test.
  2. Retirez le premier animal de sa cage (vérifier l'identité si plusieurs animaux sont en cage) et placez doucement la tête la première dans la cage d'échappement. Couvrir la cage d'échappement avec un faux fond supplémentaire et lancer le chronomètre de 2 min. Ceci permet à l'animal de s'habituer à la cage d'échappement.
  3. Après la fin de 2 min minuterie, retirer délicatement animal évasion cage (enlever le couvercle faux fond ainsi et situé loin de labyrinthe), fiche ascenseur d'identité, et placer immédiatement le rat à l'intérieur du tube central. Couvrez le dessus du tube central avec une feuille de carton d'identification.
  4. Doucement et lentement soulever tube central avec couvercle en carton et mettre de côté. Démarrer le chronomètre lorsque le tube central est soulevé au-dessus de l'animal. Déplacez à s'asseoir dans le fauteuil du testeur.
  5. Asseyez-vous tranquillement dans le fauteuil, regardant à la fois l'animal et le chronomètre. Chaque animal a un maximum de 5 min à trouver la cage d'échappement.
  6. Si le rat trouve la cage d'échappement en moins d'5 min, arrêter le chronomètre et l'enregistrement de latence et le temps de la journée sur la feuille de commande de test. Retirer l'animal du évasion cage et la remise en cage.
  7. Si le rat ne trouve pas la cage d'échappement à moins de 5 min, guider doucement l'animal à la cage d'échappement et permet de passer 15 secondes avant de retirer et de retourner à l'animal de la cage de la maison.
    1. Cette durée de 15 secondes peut être programmé à l'aide d'une horloge avec une deuxième main sur le mur de la salle de test.
    2. temps d'enregistrement de la journée sur la feuille de commande d'essai et dossier que le rat n'a pas trouvé la cage d'échappement.
  8. Si le rat tombe / sauts hors du labyrinthe, le testeur devrait coup d'œil sur le chronomètre pour le temps. Le testeur doit alors tenter de récupérer rapidement l'animal.
    1. Si cela peut être fait dans les 10 secondes, remplacer l'animal sur le centre du labyrinthe et enregistrer le temps de l'automne / saut sur la feuille de test (si le testeur peut distinguer entre une chute ou saut, cela doit être noté). Poursuivre le procès.
    2. Si la récupération de l'animal prend plus de 10 secondes, arrêter le chronomètre, et mettre l'animal dans la cage de la maison. temps d'enregistrement de l'automne / saut (si le testeur peut distinguer entre une chute ou saut, notez).
    3. Les données des essais dans lequel un animal est tombé / sauté et ne peut être récupéré dans les 10 secondes sont omises des analyses statistiques.
  9. Arrêtez l'enregistrement vidéo sur l'ordinateur. Enregistrer des commentaires sur le procès.
  10. Retirez tout urine ou les excréments du haut de labyrinthe, pulvériser avec 70% d'éthanol, et essuyer sec. Retirer évasion cage et nettoyer avec 70% d'éthanol.
  11. Mettez une cage d'échappement propre à la mise en place désigné pour le sujet suivant. Ayant plus d'une cage d'échappement permet à chacun de sécher à l'air pour réduire l'odeur de l'éthanol. Mettez un faux fond propre au trou précédent (de sorte que tous, sauf un trou a un faux fond et que l'on trou contient la cage d'échappement).
  12. Réglez le tube central avec fiche d'identité pour le prochain sujet au centre du labyrinthe. Commencez l'enregistrement vidéo sur l'ordinateur. Retirez le prochain animal à tester, mettre en fuite cage (si jour / Session 1), et de commencer à 2 min minuterie (seulement si le jour / Session 1). Continuez à partir de l'étape 2 ci-dessus. Chaque sujet reçoit 1 essai / jour.
  13. Après tous les animaux sont testés, nettoyer le labyrinthe et échapper à la cage, éteindre les lumières généraux, et le bruit blanc. Supprimer "Ne pas entrer" signe (s) de porte (s).

Jours 2 à 7 essais

  1. Mettre en place la salle d'essai et labyrinthe pour les essais, comme détaillé ci-dessus.
  2. Réglez tube central dans le centre de labyrinthe avec fiche d'identité sur le dessus. Commencer l'enregistrement vidéo. Retirez le premier animal de cage et la placer dans le tube central.
  3. Cette étape consiste à différencier Jours 2-7 du Jour 1, plus précisément, aux jours 2-7, le sujet est placé directement dans le tube central après l'enlèvement de la cage de la maison et de la période d'habituation 2 min dans la cage d'évacuation ne se fait pas.
  4. Répétez la procédure à partir de l'étape 4 ci-dessus.

3. Analyses statistiquespour Barnes Maze points de terminaison

  1. analyses de données peuvent nécessiter plusieurs tests statistiques. Variables continues, comme la latence et le taux d'erreur, peuvent être analysés comme un terrain de scission dans l'espace et le temps 52.
  2. Si certains animaux n'ont pas localiser la fuite ou cage dans le délai maximum imparti, les données de latence peuvent être affectés comme le maximum et analysées en utilisant le test de ProcLife SAS la version 9.2 d'analyse de logiciel.
    1. Cette méthode statistique est utile pour les données de comportement, dans lequel il existe une limite de coupure supérieure.
  3. données de stratégie de recherche peuvent être analysées en utilisant un modèle de mesures répétées avec PROC GLIMMIX et SAS version 9.2 du logiciel d'analyse.
    1. Cette première analyse emploie un journal il lien cumulatif et une distribution multinomiale tels que les trois stratégies de recherche (au hasard, de série, et direct) sont inclus dans cette analyse.
    2. Pour déterminer si les animaux apprennent à utiliser le plus efficace stratégie de recherche (direct), une secondeanalyse d sur la stratégie de recherche peut être effectuée sur lequel les deux stratégies les moins efficaces (aléatoires et série) sont combinées et comparées à la stratégie de recherche directe plus efficace.
    3. Cette dernière méthode se traduit par une distribution binomiale et emploie PROC GLIMMIX aussi.

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Representative Results

Souris sylvestres mâles sexuellement matures dépendent amélioré la capacité de navigation spatiale pour trouver des partenaires potentiels de reproduction, qui sont largement diffusés dans l'environnement. Tant l'exposition prénatale et des adultes à la testostérone sont essentiels dans l'organisation et l'activation de ce comportement de mâle adulte plus tard 53. En tant que tel, il a été supposé que l'exposition précoce à perturbateurs endocriniens pourrait perturber ce trait plus tard chez les hommes. Pour tester cette hypothèse, les souris mâles et femelles cerfs ont été de développement exposés par le régime alimentaire de la mère à plusieurs doses dans l'environnement de BPA dans un régime de phytoestrogènes libre, un contrôle de l'oestrogène positif (éthinylestradiol [EE2]) dans un régime de phytoestrogènes libre, ou la base contrôler l'alimentation raffinée libre phytoestrogènes, et ont été évalués pour Barnes performance dans le labyrinthe que les adultes. figure 1 montre l'appareil de labyrinthe Barnes pour cette espèce. Mâles exposés aux deux plus élevée, mais pas le plus faible, les doses de BPA démontrentd déficits équivalents dans l'apprentissage spatial, qui se manifeste par la latence prolongée, ont augmenté le taux d'erreur, et une incapacité à se convertir à la stratégie de recherche directe sur la période d'essai (figures 7-9). Cependant, les femelles exposées à la dose EE2 et le milieu de BPA, mais pas les autres doses de BPA, affichent des schémas masculinisée de l'apprentissage spatial et la mémoire (c'est à dire de réduire la consommation de latence et une augmentation de la stratégie de recherche directe) 9,13.

Contrairement à la souris sylvestre polygames, leurs cousins ​​connexes, les souris mâles monogames Californie, augmenter leur succès reproducteur en union monogame et reste sur le territoire d'une seule femelle et le partage des responsabilités parentales en 54,55. Par conséquent, la capacité de navigation spatiale n'a pas été soumis à une forte section de l'évolution chez les souris Californie. Par conséquent, la présomption est que tôt BPA et de l'exposition EE2 ne viseraient pas ce comportement chez les souris Californie. À l'appui de cette hyposis, l'exposition in utero au BPA ou EE2 n'a pas modifié les comportements spatiaux de navigation (temps de latence, taux d'erreur, ou la conversion de la stratégie de recherche directe) chez les hommes ou les femmes, qui ont démontré des réponses comparables dans tous les groupes de traitement (figures 10 et 11) 10. Comparé à contrôler les souris sylvestres, contrôler la souris de Californie n'ont pas diminué le nombre d'erreurs commises au cours des sept jours de tests consécutifs ni ne les souris mâles Californie de contrôle d'accroître leur utilisation de la stratégie de recherche directe. Cela peut refléter une différence d'espèce dans la capacité d'apprentissage, mais il est possible que pour affiner davantage l'évaluation de tests d'apprentissage et de la mémoire visuo-spatiale est requise pour les souris Californie.

L'appareil de labyrinthe Barnes et le matériel associé pour les rats sont présentés dans les figures 2-5. Cet appareil a été utilisé pour évaluer l'apprentissage spatial et la mémoire des rats mâles et femelles Sprague-Dawley les jours postnatals 47-51 (5 conséquencescutive jours, 1 essai / jour). Le dernier jour (c.-à-jour 5), la cage d'échappement a été déplacé de 180 ° à partir de son emplacement d'origine, les jours 1-4. Ces sujets avaient déjà été évalués pour le réflexe de redressement et planche inclinée comportement (avant le sevrage), et jouer le comportement, les niveaux d'activité de plein champ, et la coordination motrice. Leurs mères avaient consommé trois petits morceaux de vanille plaquette sur laquelle a été dispensé de 1 ml / kg de poids corporel de l'eau sur 6-21 jours de gestation. Les sujets eux-mêmes ont été traités par voie orale avec 1 ml / kg de poids corporel de l'eau deux fois par jour les jours 1-21 postnatales. Au moment du sevrage, ils étaient logés paire avec un frère de même sexe. Cependant, seulement 1/sex/litter a été évaluée pour des performances de labyrinthe Barnes. Figure 12 montre la latence moyenne pour localiser la cage d'échappement pour chaque sexe sur chacun des cinq jours d'essai. Effets principaux significatifs de sexe (p <0,04) et de la session (p <0,01) ont indiqué des latences plus courtes chez les femmes et des latences plus courtes, les jours 2-5 relatives à jour 1. Autres VHAe également signalé des latences plus courtes chez les rats femelles 56, mais les effets de sexe similaires n'ont pas toujours été noté dans notre laboratoire 11. Ainsi, un effet du sexe cohérente chez les rats est encore à déterminer des points de terminaison autres que la latence ne sont pas encore disponibles;. Cependant, logiciel de suivi est en cours d'utilisation dans une étude similaire pour examiner les taux d'erreur et de la stratégie de recherche chez les rats.

Figure 1
Figure 1. L'appareil de labyrinthe Barnes pour les espèces Peromyscus. A) Les indices géométriques intra-labyrinthe (par exemple, cercle, carré, triangle et étoile) sont placés à l'intérieur du mur de labyrinthe tous les 90 °, il ya 12 trous d'échappement placés tous les 30 °, et le labyrinthe est entourée d'un rideau noir (non représenté). B) Le sommet du labyrintheest placé sur un support en polypropylène et élevé à 100 cm au-dessus du sol. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 2
Figure 2. L'appareil Barnes labyrinthe pour les rats. L'supérieure du labyrinthe et des stands de support peuvent être vus avec un diamètre supérieur de labyrinthe et de la hauteur du plancher montré. Les chiffres sur la chaussée indiquent le nombre de trous et permettent à l'appareil de contrôle de placer la cage d'échappement à l'endroit désigné (les numéros d'étage ne peuvent être vus par le sujet). Un des extra-labyrinthe des indices visuels peut être vu sur le mur du fond (c.-à-rayures verticales noires). Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 3
Figure 3. Une vue rapprochée de l'appareil de labyrinthe Barnes pour les rats. Les blancs diapositives évasion de la cage dans les rainures sur la face inférieure de la partie supérieure de labyrinthe. Rainures similaires sont situés sur la face inférieure de la partie supérieure de labyrinthe pour chaque trou périmètre. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 4
Figure 4. L'tube central avec l'échantillon soumis identifier feuille sur le dessus de l'appareil de labyrinthe Barnes pour les rats. L'couvercle en carton se soulève à place du rat à l'intérieur du tube et est ensuite remplacé. La poignée sur le tube central permet le levage facile pour commencer le procès. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 5
Figure 5. La cage d'échappement pour des rats avec dimensions. Petits marche sur la rampe vers le bas offrent une traction pour le rat lors de la saisie. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 6
Figure 6. Cliquez ici pour voir largimage er.

Figure 7
. Figure 7 Effets de l'exposition in utero des souris mâles et cerf femelle au BPA ou EE2 sur la stratégie de recherche en Barnes labyrinthe A) Exemple de diagrammes illustrant les trois stratégies définies de recherche:. Aléatoire (en haut), série (au milieu) et directe (en bas) . B) Pourcentage de BPA, EE2 et souris de contrôle employant aléatoire (jaune), série (vert), ou (noir) des stratégies de recherche directe à travers des tests d'acquisition. Hommes CTL utilisés la stratégie de recherche directe plus souvent au cours de la période d'essai de 7 jours consécutifs de tous les autres groupes, sauf faible dose de BPA mâles et femelles EE2 (toutes les valeurs de P <0,05). CTL = contrôle; EE2 = éthinylestradiol, BPA = bisphénol A Adapté avec la permission de.0; 13. Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 8
Figure 8. Effets de l'exposition in utero des souris mâles et femelles cerfs au BPA ou EE2 (mêmes groupes que dans la figure 3) sur la latence pour localiser la cage d'échappement dans le labyrinthe Barnes. A) Hommes. B) Femmes. CTL mâles plus rapidement situé la cage d'échappement correct, comme en témoigne latences plus courtes, que les femmes CTL (p = 0,0103), mâles EE2-exposées (P <0,0008), et hommes supérieurs et à dose moyenne de BPA (P = 0,03, P = 0,02, respectivement). Hommes CTL, cependant, ont montré des réponses similaires à faibles doses de BPA mâles et femelles EE2 (P> 0,05). En revanche, les femelles avaient d La EE2périodes de latence ecreased dans la période d'essai que les hommes EE2 exposés (p = 0,0013). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Adapté avec la permission de Jasarevic et al. 13 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 9
Figure 9. D'exposition in utero des souris mâles et femelles cerfs au BPA et EE2 (mêmes groupes que dans la figure 3) sur les erreurs d'échappement. A) Les hommes. B) Femmes. Mâles de CTL ont montré qu'environ la moitié du nombre d'erreurs ou d'entrées incorrectes dans des trous par rapport à des femelles de CTL (P = 0,0002) et EE2 mâles (p = 0,02). En outre, les hommes CTL commis moins d'erreurs que la dose supérieure hommes BPA (P =0,02) mais ne diffèrent pas du taux d'erreur (P> 0,05) par dose, soit au milieu ou bas de BPA hommes. D'autre part, les femmes EE2 ont démontré une réponse masculinisée tel que ce groupe avait le même taux d'erreur que les hommes CTL et la réduction des erreurs (P = 0,002) que chez les hommes EE2. Dose Moyen femelles BPA exposés ont également montré moins d'erreurs que les faibles doses de BPA et CTL femelles (P = 0,0005 et 0,01, respectivement). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Adapté avec la permission de Jasarevic et al. 13 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 10
Figure 10. Les stratégies de recherche de souris mâles et femelles de la Californie dans les tests de labyrinthe Barnes. Stratégies de recherche are couleur: aléatoire (jaune), série (vert), et direct (noir). Au cours de la période d'essai de 7 jours, il n'y avait pas d'effets significatifs de substances toxiques ou de sexe sur l'utilisation de la stratégie de recherche de ces animaux. Adapté avec la permission de Williams et al. 10 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 11
Figure 11. Latence de localiser la cage d'échappement et d'échapper à des erreurs dans les tests de labyrinthe Barnes pour les hommes (A & C) et femelle (B & D) chez la souris Californie (mêmes groupes que dans la figure 6). A et B) Temps de latence. C et D) Escapade erreurs . Au cours de la période d'essai de 7 jours, il n'y avait pas signi ficant effets du toxique ou sexe sur l'utilisation de la stratégie de recherche de ces animaux. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM. Adapté avec la permission de Williams et al. 10 Cliquez ici pour agrandir l'image .

Figure 12
Figure 12. Latence pour localiser la cage d'échappement pour les rats mâles et femelles Sprague-Dawley évalués les jours postnatals 47-51 (1 essai / jour). Lors de la dernière journée (jour 5), la cage d'évacuation a été déplacé 180 ° à partir de son origine emplacement. Femelles exposées latences significativement plus courtes que les hommes et les latences les jours 2-5 étaient significativement plus courte que la latence du jour 1. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM.tp :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51194/51194fig12highres.jpg "target =" _blank "> Cliquez ici pour agrandir l'image.

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Discussion

Les étapes critiques dans les tests de labyrinthe Barnes comprennent: 1) fournir le stimulus légèrement aversion propre à motiver l'animal pour localiser la cage d'évacuation, 2) assurer des conditions uniformes sont maintenus à travers les essais sur les animaux (par exemple, la durée du test, essai personnel, lutte contre le bruit externe, et d'autres stimuli qui pourraient affecter la performance), 3) si les essais sont la vidéo enregistrée, optimiser et assurer l'enregistrement de vidéo correcte et déposer back up, et 4) le nettoyage du labyrinthe avec 70% d'éthanol pour éliminer les signaux olfactifs entre les essais.

Identifier les meilleurs stimuli pour motiver l'objet de localiser la cage d'échappement peut exiger certaines modifications et / ou dépannage. Le stimulus lumineux typique est en tête d'éclairage. Toutefois, cela peut ne pas être suffisant pour certaines espèces. Bien que seulement noté anecdotique par nous, les rats qui ont été largement évalués comportemental (et donc largement traitées) semblent moins motivés en vertu de la norme Barnes labyrinthe conditions, probablement parce qu'ils deviennent plus dociles et habitués à l'appareil et / ou dans des environnements différents. Stimuli auditifs (p. ex prédateur sons) peuvent être envisagées, mais ce qui limite la capacité de s'habituer simultanément d'autres animaux à la salle d'examen. D'autres stimuli qui ont été utilisées avec succès comprennent des ventilateurs de plafond pour diriger l'air au sommet 57,58 labyrinthe ou de modifier le labyrinthe Barnes être appétitive, au lieu de 56 aversif.

Extra-labyrinthe repères visuels sont la norme pour les tests de labyrinthe Barnes avec des rats. Chez les espèces typiques de souris de laboratoire, il a été suggéré que extra-labyrinthe indices peuvent produire de meilleurs résultats que les indices intra-labyrinthe 59,60. Cependant, les souris sylvestres peuvent réussir à utiliser intra-labyrinthe des indices pour localiser la cage d'échappement et ne convertir avec succès au cours de la période d'essai à l'utilisation du 8,9 directe de la stratégie de recherche. En outre, une paroi extérieure empêche les animaux de tomber ou de sauter du labyrinthe. Comme les souris Californie sont plus faciles à manipuler et à environ 2 à 3 fois plus importante que les souris sylvestres, d'autres ont testé avec succès cette espèce dans le labyrinthe Barnes sans l'utilisation d'un mur 40,61. Toutefois, le labyrinthe dans cette affaire était plus petit (65 cm de diamètre) avec 16 trous qui ont été placés plus vers l'intérieur (1,3 cm).

Sur le plan méthodologique, il ya des détails importants qui pourraient avoir une incidence sur la procédure de labyrinthe Barnes et intrepretation des résultats. Le sommet de labyrinthe pour les rongeurs est relativement grande et la chambre d'essai doit être suffisamment grande pour permettre à l'appareil de contrôle de se déplacer librement dans le labyrinthe. Placer le labyrinthe dans un coin n'est pas recommandé que le testeur doit être capable de se déplacer autour du périmètre pour récupérer le rat et placer la cage d'échappement dans l'emplacement approprié. les niveaux de l'rongeur anxieux, comme en témoigne par une concentration accrue de corticostérone plasmatique 44, sont élevés au cours des essais et des stimuli externes pourraient être aggravant. Rongeurs geler généralement à des stimuli auditifs brusqueset, par conséquent, il est important que l'environnement de test n'est pas situé dans la zone bruyante. Parce que cela peut être une longue évaluation sur un jour donné, et au fil des jours, il peut être difficile pour le testeur de rester attentif à l'essai, mais attirer l'attention sur le comportement de l'objet est essentielle. Pour cette raison et pour éviter les effets circadiens sur la performance, il est optimal pour tester un nombre limité d'animaux pour une fenêtre de sélection de temps (par exemple, le matin ou l'après-midi) sur un jour donné. Enfin, l'odeur de l'éthanol peut être agressive pour le sujet, même si cela n'a pas été explicitement testé. Plusieurs cages d'échappement et faux fonds supplémentaires sont suggérées afin que les cages aient le temps de sécher à l'air après avoir été pulvérisé avec de l'éthanol.

Les principaux avantages du labyrinthe Barnes sont sa facilité d'utilisation par rapport à d'autres types de labyrinthe et les critères d'évaluation supplémentaires qui peuvent être obtenus que peut fournir une évaluation plus complète de impairm induite expérimentalementents. En outre, ce labyrinthe de terre sèche peut mieux résumer l'environnement naturel pour les rongeurs de terre-logement. La période d'essai de plusieurs jours pourrait fournir des preuves plus solides de la performance altérée, comme en témoigne la latence, taux d'erreur, et la conversion au cours de l'essai d'une stratégie de recherche inefficace (aléatoire ou de série) à une stratégie de recherche directe.

Les résultats de l'labyrinthe Barnes peuvent être vérifiées avec d'autres tests de navigation spatiale. En outre, il est important d'établir que les potentiels des déficits de performance de labyrinthe Barnes sont pas le résultat d'altérations de l'anxiété, l'activité, ou les capacités motrices. Ainsi, les résultats de l'anxiété et / ou évaluations de l'appareil locomoteur, comme labyrinthe surélevé ou le comportement en plein champ, peuvent déterminer si Barnes labyrinthe dépréciations reflètent de véritables changements dans la navigation spatiale. Cependant, les tests murins communs de l'anxiété ne sont pas toujours prédictives de Barnes performance dans le labyrinthe 44. Si de véritables changements de navigation spatiales sont présents, momoléculaire, des changements histopathologiques, électrophysiologiques, ou synaptogenic pourraient être apparente dans l'hippocampe, le cortex entorhinal, ou d'autres aires corticales, comme les régions du cerveau semblent régir cette réponse apprentissage et la mémoire 62-64.

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Disclosures

Ce document a été examiné conformément à la politique des États-Unis Food and Drug Administration (FDA) a approuvé la publication. Cette approbation ne signifie pas que le contenu reflète nécessairement la position ou les opinions de la FDA ni mention des noms de commerce ou de produits commerciaux ne constitue approbation ou une recommandation à l'emploi. Les résultats et les conclusions de ce rapport sont celles des auteurs et ne représentent pas nécessairement les vues de la FDA. Les auteurs n'ont aucun intérêt concurrentes et rien à révéler.

Acknowledgments

Les auteurs remercient M. Eldin Jašarević, M. Scott Williams, M. Roger W. Meissen, Sarah A. Johnson, le Dr R. Michael Roberts, le Dr Mark R. Ellersieck, et le Dr David C. Geary à l'Université de Missouri, et M. C. loi Delbert et le personnel de soins aux animaux au Centre national de la recherche toxicologique / FDA. Ce travail a été soutenu par une subvention défi de NIH Grant à la RSE (RC1 ES018195), un avantage Grant Mizzou à (RSE et DCG), l'Université de Missouri Collège de médecine vétérinaire de l'attribution du corps professoral (RSE), et le protocole e7318 au Centre national pour la recherche toxicologique / FDA.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
NOTE: Those items that are for small rodents only are bolded. Those items that are for large rodents only are italicized. Items neither bolded nor italicized are for both.
Barnes Maze platform with 12 or 20 escape holes every 30°. For rats, each hole is 10.5 cm in diameter and 4 cm from the maze top edge. For use with automated tracking programs, a black top for white rodents or a white top for pigmented rodents is needed. For mice and rats, this circular top is 95 and 122 cm in diameter, respectively. US Plastics Corp, Lima, OH 42625 This is the top of the Barnes Maze and the surface that the rodent is placed upon. It can be constructed from a variety of materials (e.g., Plexiglas), but for endocrine disruptor work, polypropylene BPA-free material is optimal. One of the holes leads to the an escape cage; all other holes are blind-ending or false-bottomed. For the rat maze, small slides on the underside of the maze platform allow the escape cage and false bottoms to slide in.
2 in Polypropylene pipe plug (24)
2 in 90° Black polypropylene elbow (12)
2 in x 6 in Polypropylene pipe nipple (1)		 US Plastics Corp, Lima, OH 30724
32086
30712		 These are only necessary for the small rodent (e.g. mouse) Barnes Maze. These adaptations are either blind-ending tubes/elbows or one of the tubes is connected to the pipe nipple that then leads to the escape cage.
False bottoms for rat Barnes Maze These were custom made of ABS plastic and vacuum molded for the rat maze apparatus.
Circular aluminum wall/barrier (50 cm high) around the maze Ace Hardware, Columbia, MO In the case of small rodents (e.g., mice), this barrier prevents them from falling off the maze; the rat apparatus generally does not require this. The wall may not be needed for laboratory mice that are relatively tame.
Support stand for maze platform top US Plastics Corp, Lima, OH 42625 The stand supports the maze platform top such that it is elevated above the floor (typically, 70-100 cm) to motivate the rodent to locate the escape cage. The stand can be constructed of any material.
White noise SleepMate Sound Conditioner,
Marpac, Rocky Point, NC		 980A Background noise may be used to block out peripheral acoustic cues that may confound Barnes Maze testing across trials and animals
Light fixtures and 300-500 W bulbs encased in aluminum shells. For example, Utilitech 500 W halogen portable work lights. Ace Hardware or Lowes Bright lights provide a mildly aversive stimulus which motivate the rodent to locate the escape cage. The lights are generally suspended ~150 cm above the maze top.
Escape cage. For small rodents, this can be a polypropylene cage (27.8 cm x 7.5 cm x 13 cm). Ancare, Bellmore, NY N40 PP The rat escape cage here was custom built and has a ramp leading into the escape cage.
Opaque tube (rats only) (27 cm diameter; 23 cm height) with a piece of thick cardboard to cover the top. The tube is placed in the center of the maze and the rat is placed into the tube from the top which is covered with the cardboard. A handle on the outside of the tube allows easier lifting of the tube, which then begins the trial. The tube can be constructed of any material, but should be opaque.
High resolution video camera (e.g., Panasonic Digital Video Camera) Panasonic, Secaucus, NJ ICV19458 The video camera is positioned overhead and records trials for later analysis.
Extra- or intra-maze geometric cues made of high quality cardboard construction paper any office supply store, such as Staples These visual cues orient the animal within the maze environment, providing cues as to the spatial location of the escape cage; in rats, extra-maze cues on the walls work well, whereas in small rodents that require a wall around the maze, intra-maze cues must be used.
Black curtain to surround the maze (small rodents only) any fabric and crafts store, such as Jo-Ann Fabrics A black curtain is used in small rodents (especially wild species, e.g. Peromyscus) to maintain attention within the maze confines.
70% Ethanol Fisher Scientific BP2818-4 After each trial, the maze top and escape cage are cleaned to eliminate potential odor cues for consecutively tested rodents.
Tracking software program, such as Ethovision, and computer with appropriate video card and substantial (1 TB or more) hard-drive space. Alternatively, videos can be recorded directly to the computer for later analysis using a program such as Win TV (Hauppauge Computer Works, Inc.). Noldus (Leesburg, VA) Tracking software is required to analyze trials for latency to locate the escape cage, velocity, distance traveled, time spent resting, time spent moving, time spent in the correct versus incorrect quadrants, time spent around the escape hole, number of errors or entries into incorrect holes, and overall search strategy employed to find the escape cage.
External hard drives, such as Seagate or WD, with a minimum 1-2 TB of memory Any office supply store, such as Staples. Videorecordings should be backed up in at least one separate location.
Videorecording program, e.g. WinTV program Hauppauge Computer Works, Inc.,
Hauppauge, NY		 If tracking software is not available at the time of the testing,
the trials should be video-recorded for later analysis

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Comportement Numéro 84 la navigation spatiale les rats Peromyscus souris intra-et extra-labyrinthe des indices l'apprentissage la mémoire la latence la stratégie de recherche échapper à la motivation
Barnes Maze Stratégies de test avec les petites et grandes des modèles de rongeurs
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Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A.… More

Rosenfeld, C. S., Ferguson, S. A. Barnes Maze Testing Strategies with Small and Large Rodent Models. J. Vis. Exp. (84), e51194, doi:10.3791/51194 (2014).

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