Summary
גרגרי מתח (SGS) הם גרגרי cytoplasmic RNA המכילים חלקיקים נתקע ribonucleoprotein (RNPs), וחשובים בתגובה תאית ללחצים שונים. דינמיקה של SGS יכולה להיות מיושמת בתאי חיים על ידי הדמיה הלוקליזציה של רכיב מתויג של SGS בתאים ראשוניים transfected אחרי המתח.
Abstract
ניתן דמיינו SGS בתאים על ידי immunostaining של מרכיבי חלבון מסוימים או הפולה + mRNAs. SGS הם מאוד דינמי והמחקר של ההרכבה וגורלם חשוב להבין התגובה התאית ללחץ. המחסור בגורמים מרכזיים של SGS כמו G3BP (חלבון קושר תחום RasGAP SH3) מוביל לפגמים התפתחותיים בעכברים ובשינויים של מערכת העצבים המרכזית. כדי ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים מאורגניזם, תאים ראשוניים ניתן תרבות ובצע את הלוקליזציה של transfected רכיב מתויג של SGS. אנו מתארים ניסוי הזמן לשגות להתבונן SGS המכיל G3BP1 בfibroblasts העכבר עוברי (MEFs). גם טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור SGS המכיל G3BP בנוירונים בשידור חי, שהוא חיוני כפי שהוצג לאחרונה כי SGS אלה נוצרים בהתפרצות של מחלות ניווניות כמו אלצהיימר. גישה זו יכולה להיות מותאמת לכל מרכיב גוף סלולארי וחלבון גרגר אחר, ובביצועעם בעלי חיים מהונדסים, המאפשר הלימוד החי של דינמיקת גרגרים למשל בהעדר גורם ספציפי של גרגרים אלה.
Introduction
גרגרי מתח (SGS) הם מוקדי cytoplasmic שאינם קרומיים נוצרו כתגובה מגן סלולרית ללחץ סביבתי, כגון טמפרטורה גבוהה, סטרס חמצוני, היפוקסיה, הלם אוסמוטי, קרינת UV, מניעת גלוקוז, או זיהום ויראלי 1. הם יכולים להיגרם על ידי טיפול כימי עם תרכובות כמו arsenite נתרן, אשר מפעיל לחץ חמצוני. SGS לצבור ribonucleoprotein נתקעה תרגום נעצר שליח (mRNPs) קומפלקסים 2, sequestering mRNAs ממכונות translational, וההרכבה שלהם יכולה להיות מופעלת על ידי זירחון של eIF2α (גורם ייזום אוקריוטים 2 α). SGS הם מבנים דינמיים אשר מחליפים רכיבים עם polysomes וגרגרים אחרים כמו P-הגופות. הם מהווים "מרכז מיון" שבו mRNAs מסודרים ומעובד או תרגום, reinitiation, השפלה, או אריזה לmRNPs הלא polysomal היציב 3. ההרכבה של SGS היא ב מהירut זה תהליך הדרגתי עם אגרגטים קטנים רבים ראשוניים שלהתגבש לתוך גרגרים גדולים יותר. השימוש במעכבים כימיים המשבשים או לייצב microtubules מראה כי רשת microtubule נדרשת לדינמיקת SG כוללים תהליכי הרכבה, גיבוש ופירוק.
ההרכבה הדינמית של SGS גם מקודמת על ידי צבירה של חלבוני קושרי RNA ספציפיים (RNA-BP) כמו TIA-1 (T-cell פנימי אנטיגן-1) וTIAR (חלבון הקשורים ל-TIA-1), אשר מסוגל dimerize ולקדם polysome פירוק והניתוב של mRNAs ל4 SGS. G3BP (חלבון RasGAP SH3 תחום מחייב) הוא RNA-BP כזה שמתאים לSGS כאשר תאים הדגישו עם arsenite או טמפרטורה גבוהה, וביטוי יתר של G3BP dephosphorylated יכול לגרום להרכבת SGS 5.
G3BP הוא RNA-BP אבולוציונית שימור שהיה בתחילה אפיין דרך האינטראקציה שלו עם חלבון הפעלת ראס-GTPase (RasGAP p120 6); אך אינטראקציה זו הייתה לאחרונה וביקרה 7. משפחת G3BP כוללת שני חברים ביונקים, G3BP1 (המכונה G3BP) וG3BP2 8. שני חלבוני colocalize בSGS, כאשר תאים נחשפים למתח 9. G3BPs מהווה תחום NTF2 N-מסוף הציע להשפיע על הלוקליזציה שלהם וoligomerization, ואחריו פרולין עשיר מוטיבים (PxxP), ולאחר מכן מוטיבים בטרמינל C-קשורים RNA מחייב: RNA-ההכרה המוטיב הקנונית (RRM) עם מוטיבים RNP1 וRNP2 שימור , ואחריו תיבת ארגינין-גליצין עשיר (RGG). מעניין לציין, כי הניתוח של חלקים שונים של החלבון על ידי בניית תחומים שונים התמזגו EGFP הראה כי תחום כמו NTF2 ותחום המחייב-RNA היו מגויס באופן יעיל ביותר לSGS, המצביע על חשיבותם של המאפיינים של dimerization ו-RNA מחייב ב ההרכבה של SGS. מודלים מגוונים חשפו פונקציות שונות של חלבוני G3BP במבחנה 10-13.שיבוש של G3BP בעכברים הראו את החשיבות של חלבון זה בגידול התפתחותית והישרדות 14, כמו גם תפקיד חשוב לG3BP במערכת העצבים המרכזית (CNS), המתאפיינת באטקסיה וליקויים בזיכרון עבודה המרחבי 15. מחסור G3BP מוביל להומאוסטזיס פלסטיות עצבי וסידן שהשתנה, הקמת קשר ישיר בין היווצרות SG ומחלות ניווניות 15. זה כן חשוב להיות מסוגל ללמוד את הדינמיקה של SGS בתאים ראשוניים כמו תאי עצב.
פרוטוקול זה מספק דרך פשוטה לבחון את ההרכבה של SGS המכיל G3BP1 בתאים ראשוניים תחת טיפול arsenite. זה יכול לשמש כדי לחקור הרכבה SGS בתנאים שונים, לדוגמא סוגים שונים של לחצים. זה גם יכול להיות מותאם לגרגירים או מרכיבים אחרים אחרים של SGS. ואכן, בפרוטוקול זה מתמקד בG3BP1, אבל יש סמני גרגרי מתח אחרים כמו TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (פיגור שחלבון ה-X שביר תסמונת נפשית) 16, (חלבון קושר DNA תגובת transactive 43) TDP-43 17 או Staufen 18. בפרט, חלבונים כמו TIA-1 / R הם, כמו G3BP, nucleating חלבוני RNA מחייבים שיכול לגרום להרכבת SGS כאשר ביטוי יתר, גם אם SGS נוצר השונים יכול להיות שונה בתפקוד, ויסות ותמלילים כרוכים בכך. Transfection של גרסה מתויג fluorophore של כל אחד מהמרכיבים המרכזיים אלה או nucleators של SGS יכול להתבצע להרכבת תמונה מסוימת SGS ודינמיקה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכי בעלי החיים בפרוטוקול זה הם בהקפדה עם ההנחיות של הוראת מועצת הקהילה האירופית של 24 נובמבר 1986 (86-609/EEC). בית העכברים בקבוצה, המאפשרים כרצונך מודעת מזון ומים. לשמור אותם בסביבה מבוקרת (C ° 22 ± 1, ± 55 לחות 5%) עם שעות 12: שעות אור 12: מחזור כהה (אור על שעת 7:00 בבוקר).
1 תרבות של תאי Murine ראשיים:. Fibroblasts העכבר עוברי (MEFs)
- החיטוי מלקחיים דקים, כמו גם מלקחיים מעוקלים ולנתח מספריים. לאחסן במכל סטרילי. השתמש D-PBS סטרילי (פוספט שנאגר מלוח של Dulbecco). להכין מדיום MEFs מלא: בינוני הנשר שונה Dulbecco (DMEM) / F12 בתוספת 10% עוברי עגל בסרום (FBS), 1 מ"מ L-גלוטמין, פירובט נתרן 1 מ"מ, חומצות אמינו לא חיוני 1%, ו0.5 מ"מ 2-mercaptoethanol וחם על 37 ° C.
- להרדים עכבר בהריון (ב13.5 ימים לאחר coïtum-(DPC)) על ידי נקע בצוואר הרחם. הסר את קרן הרחם מהעכבר מחוטא עם 90% EtOH. מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, הניחו את הקרניים עם העוברים ב37 ° C prewarmed D-PBS. פתח את הקרניים, המקום העוברים בצלחת פלסטיק סטרילי 100 מ"מ פטרי, לנקות אותם מחומר חבל הטבור ולשטוף אותם עם D-PBS החם כדי להסיר את עודפי דם. תחת משקפת, להסיר גפיים של העובר, האיברים הפנימיים ו את החלק העליון של הראש המכיל את המוח.
- בצלחת פטרי חדשה, ברר עוברים לחתיכות קטנות מאוד עם סטרילי כירורגים להב או מספריים (לפחות 1 דקות). במקרה של עוברים של גנוטיפים שונים, להיות זהיר לשים כל עובר בצלחות פטרי פרט ולשמור על הזנב או עליון הראש לגנוטיפ.
- כסה את העובר עם 1x טריפסין-EDTA (טריפסין 0.25%, 1 mM EDTA). דגירה במשך 30 דקות עד 1 שעה ב37 מעלות צלזיוס חממה. הוסף 10 מיליליטר של שלםבינוני MEFs לעצור תגובת טריפסין. Pipet מעלה ומטה כדי להסיר את כל אגרגטים. בואו לשבת ההשעיה התא לתוך צינור מיליליטר 50 (מלא בינוני מלא) עבור 10 דקות, ו צנטריפוגות supernatant במשך 5 דקות ב300 XG בטמפרטורת חדר. Resuspend את הכדור במדיום מלא (6 מיליליטר לעובר 1). ניתן לספור תאי בעלי גרעין קיימא באמצעות trypan כחול (ניתן לצפות מעובר אחד בסביבות 5 x 10 6 תאים). צלחת 3 מיליליטר ל60 מ"מ צלחת פטרי.
- לשנות את המדיום למחרת ו מאפשר לתאים לגדול עד המנות ומחוברות. רבים ניתן לראות סוגי תאים, אבל רק fibroblasts ישרוד תת.
- לפצל את התאים ולאפשר להם לגדול ב35 מנות מ"מ עם תחתית זכוכית (חשובה לניסוי זמן לשגות), עד confluency 50-70% עבור transfection. מבחן לMycoplasma ופתוגנים עכבר.
2. תרבותdaptations במקרה של נוירונים
- היום לפני התרבות, צלחות פטרי זכוכית תחתונה מ"מ מעיל 35 עם פולי-L-ליזין (200 μl של 0.1 מ"ג / מיליליטר) מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, ולהשאיר למשך לילה.
- בבוקר שלמחרת, לשטוף עם מים טהורים סטרילי, פעמיים למשך 5 דקות ופעם אחת עבור 45 דקות עד 1 שעה. החלף עם 2 מיליליטר של DMEM בתוספת 10% בינוניים FBS ולשמור בחממה 37 מעלות צלזיוס.
- לנתח עוברים ב18.5 DPC. מתחת למכסת מנוע סטרילית ונקי, הנח את הקרניים עם העוברים בHBSS הקר סטרילי (תמיסת מלח מאוזנת של האנק) ב100 מ"מ צלחת פטרי. יכולים לשמש גם גורי ילודים במקום עוברים על מנת לשמור על חייו של הסכר ותאפשר לה לייצר יותר צאצאים, במיוחד במקרה של בעלי חיים מהונדסים שיכול להיות קשה להשיג. בצלחות פטרי אישיות, לקחת כל עובר או יילוד וחתך את ראשו במספריים. החזק את ראשו על ידי החדרת מלקחיים מעוקלים לתוך העיניים, לחתוך את העור ולפתוח בזהירות את הגולגולת הרכה מהחלק האחורישל הראש עד לעיניים, בכל צד של הראש. חותכים את עצבי ראייה ואת גזע המוח, להסיר את המוח, ושם אותו בצלחת פטרי המכילה HBSS חדשה. תחת stereoscope, להסיר את כל קרומי המוח באמצעות שני מלקחיים דקים. הפרד את hippocampi, קליפה או כל חלק אחר של המוח בהתאם למבנה ללימודים.
- לטבול את מבנה המוח גזור ב4.5 מיליליטר של HBSS הקר שהוכן קודם לכן ב15 צינורות מיליליטר ולשמור על קרח עד לעיכול עם טריפסין. הוסף 0.5 מיליליטר של טריפסין 2.5% ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ל20 דקות. יש לשטוף 3x טריפסין עם HBSS, להיות זהיר מאוד שלא להשליך את חלקי המוח מתעכלים.
- Resuspend ב 500 μl (היפוקמפוס) ל 1 מיליליטר DMEM (קליפת המוח) בתוספת 10% FBS ו pipet מעלה ומטה מספר פעמים עם micropipette מיליליטר 1 מצויד עם טיפ 1 מיליליטר, ולאחר מכן מצויד עם 1 מיליליטר בתוספת 200 טיפים μl, עד שלא יהיה ללא צבירה גלויה.
- הפץ 100-200 μl של השעיה תא לכל botto זכוכית 35 מ"ממנה מ 'המכילה DMEM בתוספת 10% FBS ולתת נוירונים לדבוק ב37 מעלות צלזיוס למשך לפחות 3 שעות. החלף על ידי בינוני מלא נוירון prewarmed (הבינוני Neurobasal בתוספת 250 מיקרומטר L-גלוטמין וNS21, שהוכן כפי שמתואר בחן et al. 19) ולהשאיר על 37 ° C כדי לאפשר צמיחה עצבית. Transfect נוירונים ב5-14 ימים במבחנה (DIV) (היעילות של transfection היא גבוהה יותר אחרי כמה קשרים סינפטיים div אבל הם טובים יותר הוקמו 7-10 div).
3. Transfection של Construct EGFP-G3BP1
Transfect התאים עם וקטור המכיל cDNA של חלבון עניין שלך (כל רכיב של SGS) התמזגו סמן פלואורסצנטי (GFP, YFP, וכו '), באמצעות 3 מיקרוגרם של פלסמיד מטוהר ל35 מנה מ"מ.
- Transfect MEFs בשיטה מסחרית, בעקבות הפרוטוקול של היצרן (ראה טבלה של חומרים / ריאגנטים).
- Transfect נוירונים עם סידןשיטת פוספט הותאמה מ שיה ואח' 20 בקצרה.:
- הכן את הפתרונות: DMEM שטיפה: DMEM המכיל 25 מ"מ KCl; פתרון transfection: DMEM שטיפה המכילה 1x DMKY (HEPES 5 מ"מ, MgCl 2 10 מ"מ, פנול אדום); ופתרון הלם: HeBS 1x, DMKY 1x, וDMSO 2% (v / v); ולשמור אותם על 37 ° C.
- הסר את המדיה מהנוירונים, התסנין, ולשמור אותו על 37 ° C. לשטוף עם DMEM לשטוף לאחר מכן להחליף עם מדיום transfection ולשמור על 37 מעלות צלזיוס במהלך תקופת ההכנה של משקעים DNA פוספט-פלסמיד סידן.
- בצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, להוסיף (לפי סדר זה) מים בראון (μl 50 הנפח סופי), 5 μl של CaCl 2 2.5 M, ו3 מיקרוגרם של ה-DNA פלסמיד. ירידה זו תערובת על גבי 50 μl של HeBS 2x כבר הציג בצינור פוליפרופילן תחתית עגול. מערבבים את הצינור על ידי סיבוב יחד עם השחרור. בואו צורת המשקע בטמפרטורת חדר במשך 30 דקות.
- הוסף את precipitatדואר dropwise על גבי תאי העצב ולהשאיר על 37 מעלות צלזיוס במהלך 30-50 דקות.
- החלף עם פתרון הלם דקות 1, ולאחר מכן לשטוף עם DMEM לשטוף וסופו של דבר להחזיר את מדיום preconditioned. שמור את התאים על 37 ° C.
4. ויזואליזציה של G3BP מכילה SGS הרכבה וDynamics
- החלף את המדיום של התאים המכיל פנול אדום על ידי אדום בינוני ללא פנול.
- השתמש במיקרוסקופ confocal מצויד בקרינה עבור הרכישות. הפעל את מערכות מיקרוסקופ: מנורת כספית, מחשב, ולייזרים. לחמם את החדר ל37 מעלות צלזיוס לפחות 20 דקות לפני תחילת הרכישות.
- ביטוי היתר של G3BP גורם להיווצרות הספונטנית של סוג של SGS. התאים עשויים כך שנצפו להרכבה של SGS 24 תקין שעות לאחר transfection ללא אינדוקציה לחץ. לחלופין, לחץ יכול להיגרם כדי לגרום להרכבה של SGS נוסף. הוספת arsenite נתרן 0.5 מ"מ וכוכבt הרכישה מייד לאחר התוספת של המתחם (גרגרים יוקמו גם בתוך שעה 1).
- להוסיף שמן למטרת הטבילה (להשתמש 40X או 63X מטרות) ולהתקין צלחת פטרי על המטרה בבעל מיקרוסקופ 35 מ"מ המותאם, התייצב על בעל הבמה. בדוק שהצלחת שטוחה אחרת הרכישות יהיו שונה. להדליק את אור הקרינה פי fluorophore הרלוונטי ולדמיין תאי transfected. כבה את הקרינה פעם בתא של עניין הוא בתחום על מנת למזער הלבנת וcytotoxicity.
- בכרטיסייה "לרכוש", בחר בלייזרים בהתאם לגל העירור של fluorophore התג (488 ננומטר בפרוטוקול שלנו אשר משתמש G3BP מתויג-EGFP) ובחר את האורך המותאם פליטה לPMT (צינור מכפיל). להתאים את כוח הלייזר (בדרך כלל לא יותר מ -10%) כדי למזער את הרעש וoversaturation כמו גם רעיל, ולהגדיר את הרווח לקזז כדי לשנות את יחס האות לרעש.סריקה מהירה (1,000 הרץ) על מנת לצמצם את משך הזמן של אקספוזיציה לייזר (קו ממוצע 2, ממוצע פריים 1). אם תרצה, להגדיר את הפרמטרים למחסנית Z כדי להיות מסוגלים לשחזר את התמונה ב-3D (צעד Z של 1 מיקרומטר הוא בדרך כלל בסדר עם תאים). לקבוע את מרווח הזמן בין כל רכישה: מרווחים קטנים יותר נאפשר להשיג סרט קוהרנטית יותר, אבל זה עשוי לגרום photobleaching ורעילות (מרווח של 20 שניות היה בשימוש בניסויים שתוארו). משך הרכישה כוללת עשוי להשתנות בהתאם לסוג הלחץ. SGS המכיל G3BP רבים נוצרים בקצב מהיר מאוד תחת טיפול arsenite והם גם נראים לעין לאחר 1 שעות של טיפול: במקרה זה, לבחור במהירות תאים לסרט ולהתחיל את הרכישות מייד אחרי המתח, עם משך זמן כולל של רכישות של 15 - 20 דקות במידה רבה מספיק כדי לבחון את ההרכבה של כמה SGS.
- שמור את התמונות ולשחזר את הערימות וסרט באמצעות תוכנת ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
היווצרות גרגר מתח היא חשובה בתגובה של תאים ללחץ, ומאפשרת הסתגלות סלולרית עם תרגום נתקע, עד שהלחץ יש לו פינה, הקשורים למניעת מות תאים מתוכנת. היתרי assay זה ללמוד את SGS בתאים ראשוניים, על ידי ביצוע הלוקליזציה של מרכיבי חלבון SGS המרכזיים (איור 1). G3BP, גורם מפתח של ההרכבה SGS, הוא בהווה ולא diffusively בציטופלסמה של MEFs או נוירונים (איור 2 א וג) בתרבית, והוא בבירור נוכחים בגרגרים בדידים תחת טיפול arsenite בMEFs כמו גם 2A הנוירונים (איור B ו ד). ניתן להשיג תאים ראשוניים ממודלי עכבר מהונדסים, המאפשרים לדוגמא את המחקר של גרגרי מתח בהעדרו של אחד מהרכיבים שלהם. מעניין לציין, כי החסר של G3BP1 בעכבר מוביל לפגמים חמורים במערכת העצבים המרכזית, בעיקר עמ 'ataxichenotype מאופיין בחוסר היכולת לתאם בצורה נכונה תנועות (כפי שניתן לראות בבדיקת חביקת גפה, איור 2) ושינוי של זיכרון עבודה המרחבי. G3BP1 נמצא בגרגרי לחץ בתאי עצב, וזה כל מה שיותר מעניין שSGS הוכחו בצורה בהתפרצות של מחלות ניווניות כמו אלצהיימר.
assay זה (איור 1) ובכך היתרים ללמוד SGS בתאים ראשוניים, הכרחיים ללמוד הקומפוזיציה וההרכבה שלהם in vivo. יתר על כן, היא מאפשרת למחקר של תאי חיים ולכן יכולה לשמש כדי לעקוב אחר הדינמיקה של SGS, על ידי הדמיה אחד או כמה ממרכיבי ביטוי היתר שלהם בזמן אמת. איור 3 מציג זמן לשגות תמונות נציג המתירות לבצע את ההרכבה ואת הדינמיקה של SGS בMEFs לאחר טיפול arsenite המכיל G3BP1. בתרשים 4A, אותו הניסוי מבוצע עם נוירונים בהיפוקמפוס עכבריים בכתיור. לוקליזציה EGFP-G3BP1 עוברת ממבנים פרטניים subcellular גדולים לגרגרים מוגדרים יותר וקטנים יותר, SGS, לאחר טיפול arsenite. SGS היה יותר ויותר מוגדר, אם הרכישות נמשכו (לא מוצג), אבל המורפולוגיה של התאים התחילה להשתנות, ככל הנראה בשל החום והרעילות הנגרם על ידי עירור הלייזר.
זמן לשגות מאפשר לכידה של וידאו כדי לבחון ישירות את דינמיקת SGS. יתר על כן, השימוש במיקרוסקופ confocal מאפשר לשחזר תמונה בערימת Z ובכך לעקוב אחר לחלוטין את הדינמיקה של הגופים ברחבי התא ב 3 ממדים (כפי שמודגם לנוירון בזמן מוגדר באיור 4 ב).
איור 1. תיאורית של השלבים העיקריים של הפרוטוקול. תאים ראשוניים בתרביתמעוברים (18.5 DPC (ימים לאחר coitum-) (או גורי יילודים) לנוירונים (א), 13.5 DPC לMEFs (ב)). לאחר transfection של פלסמיד המכיל EGFP-G3BP1 cDNA, תאים הם הדגישו וצלמו עם מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר. דינמיקה של SGS המכיל G3BP1 הם נצפו. נוירונים הם דמיינו ידי MAP2 (חלבון microtubule משויך 2) צביעה ב( א), MEFs ידי מכתים G3BP1 ב (ב). הם מקבלים כתמונות להמחשה, כמו גם EGFP-G3BP1 transfected נוירון העכברי (ג) ופיברובלסטים (ד), שהן תמונות עצמאיות ואינו מתאימות לתאים הניתנים ב( א) ו (ב).
איור 2. (). לוקליזציה G3BP בMEFs תרבית ותאי עצב בהיפוקמפוס, שלא טופל או לחוץ עם arsenite נתרן. G3BP הוא בעיקר cytoplasmic, עם כתמים מפוזר בMEFs (א) או במבנים גרעיניים גדולים בסומה של נוירונים (ג) כאשר התאים לא נלחצו. אחרי שעה 1 של טיפול arsenite נתרן, G3BP הופך מקומי בגרגרים בדידים cytoplasmic (MEFs, ב ונוירונים, ד). הנה, תאים היו קבועים immunostained עם נוגדן אנטי G3BP1. היתרים מכתים MAP2 לזהות נוירונים בג) וד). ה-DNA היה דלפק מוכתם בכחול עם Hoechst. ברים סולם מייצגים 2 מיקרומטר (A ו-B) ו10 מיקרומטר (C ו-D). (ב '). כשהרים בזנב לכיוון הרצפה (מבחן מחבקי איבר), עכברי WT להאריך את רגליהם (משמאל) ואילו עכברי G3BP1 KO להראות רפלקס מחבקי כפה חריג קרוב ליציבה כעטלף. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של נתון זה.
"Width =" fig3highres.jpg 500 "/>
איור 3. רכישות רצופות בניסוי הזמן לשגות שהושגו עם MEFs transfected עם EGFP-G3BP1, באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר לייקה SP5 confocal (עירור באורך גל של 488 ננומטר). רכישות היו נכתבו 10 דקות לאחר התוספת של arsenite נתרן, ושהושגו במהלך 10 דקות במרווחים של 20 שניות. ניתנו שש תמונות מייצגות, עם לא את הזמן בשניות לאחר התוספת של arsenite נתרן (0.5 מ"מ). החיצים מראים שני אזורים שבם אנו יכולים לראות את ההרכבה של SGS. סרגל קנה מידה = 2 מיקרומטר.
איור 4. (). רכישות רצופות בניסוי הזמן לשגות שהושגו עם נוירונים בהיפוקמפוס עכבריים transfected עם EGFP-G3BP1, באמצעות מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר לייקה SP5 (עירורבאורך גל של 488 ננומטר). רכישות היו התחילו 5 דקות אחרי התוספת של arsenite נתרן, ושהושגו במהלך דקות 40 עם מרווחים של 20 שניות. ניתנו שש תמונות מייצגות, עם לא את הזמן בשניות לאחר התוספת של arsenite נתרן (0.5 מ"מ). החיצים מראים שני אזורים שבם אנו יכולים לראות את ההרכבה של SGS. בר סולם מייצג 5 מיקרומטר D:. דנדריט; : האקסון. (ב). שחזור 3 מימדים מערימת Z (5 רכישות בציר Z על סך של 10 מיקרומטר) של נוירון transfected עם EGFP-G3BP1 וטופל בarsenite נתרן n:. neurite (דנדריט או אקסון). אנא לחץ כאן כדי להציג גדול גרסה של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השלבים הקריטיים ביותר בדאגת פרוטוקול transfection ועוד במיוחד רכישות הזמן לשגות, שצריך להיות במעקב צמוד על מנת להפחית את cytotoxicity.
תרבות של תאים ראשוניים היא לא חלק קשה, כל עוד תנאים סטריליים נשמרים והזהירות לנקוט על מנת למנוע נזק במהלך שלבי הנתיחה ותא דיסוציאציה. MEFs יכול להישמר קפוא במעברים מוקדם. transfection Neuron עם סידן זרחה הוכח לעבוד גם 21 ופרוטוקול זה הותאם מ שיה ואח'. 20 מאפשר רמה טובה של transfection, אבל זה יכול לגרום למוות של תאים מסוימים. חשוב transfect הנוירונים בתוך כמה ימים הבאים התרבות, כדי לבדוק את ה-pH של הפתרונות ולפקח הדגירה של נוירונים עם משקע פוספט-פלסמיד סידן, אשר לא יעלה על 1 שעות. בדוק תחת מיקרוסקופ אור ולהסיר את טראןבינוני sfection אם מצרפים הם נצפו. מספר שוטף עם DMEM יכול להיות מוגבר.
על הביטוי של חלק מרכיבי חלבון SGS מוביל להרכבה הספונטנית של גרגירים, אשר נראתה לערב oligomerization וRNA מחייב מאפיינים של החלבונים האלה, כמו במקרה של TIA-1 / R 4 או G3BP 5. לפיכך, חשוב להגדיר את הזמן שבו אתה יכול להתחיל רכישות הזמן לשגות. כמה SGS נראה בהקדם 24 שעות לאחר transfection EGFP-G3BP, כאשר החלבון מתבטא. עם זאת, גרימת לחץ נוסף מובילה להיווצרות של גרגרים נוספים, אשר עשוי להיות שונים במיני SGS שונים כמו עם רכיבי מפתח שונים זוהה תחת לחצים שונים 1,22,23. ההרכבה של SGS היא מהירה בתאים חיים (מהר ככל 10-20 דק '), וגרגרים רבים נוצרים לחלוטין בתוך 1 שעות של טיפול arsenite, זה כן חשוב להתחיל את הרכישות בהקדם האפשרי ומאחוראה האינדוקציה של מתח אם האסיפה עומד להיחקר. בשלבים מאוחר יותר לעומת זאת, הדינמיקה של SGS יכולה להיות גם למדה, כגרגרים קטנים יכולים להתגבש למבנים גדולים יותר, ומבנים אלו אינם קבועים: ניתן להחליף הרכיבים שלהם עם ציטופלסמה או סוגים אחרים של גרגרים כמו P-גופים, האתרים של RNA ריקבון 3. עיניים זיהוי מהיר של תאי transfected וניטור מהיר של הפרמטרים רכישות (בעיקר X, Y ו-Z קואורדינטות) מתירים לקבל סרט כולל הרכבה של גרגירים, כמו גם להגביל את photobleaching וcytotoxicity מושרה לייזר, שהוא אחר שלב קריטי בתחום הדמיה בשידור חי. ואכן, במקרים מסוימים, אנחנו יכולים לצפות לשינויים חשובים במורפולוגיה של תאים ואף למותם של כמה תאים, אם הרכישות בוצעו במשך זמן רב (יותר משעה 1 לאחר האינדוקציה של מתח oxydative עם טיפול arsenite). על מנת למנוע תופעות אלו, ניתן להדק את הסריקה ולהגדיל את המרווחיםמשך זמן בין כל רכישה. עם זאת, היתרי מרווח קצרים יותר לעקוב טובים יותר את הדינמיקה של SGS המכיל את החלבון דמיינו, וכדי לקבל סרט שלם יותר. לפיכך, יש להתאים את הפרמטרים לכל ניסוי כדי להשיג את הסרט הטוב ביותר עם photobleaching ורעילות מוגבלים, בהתאם לסוג התא הראשוני, על מרכיב הגרגר שאחריו, ועל מולקולת fluorophore קשורה.
תגי חלבון פלואורסצנטי הם בדרך כלל מספיק photostable להיות צילם לתקופת הניסוי. חלבוני ניאון שונים יכולים לעבוד טוב, כל עוד הם מייצרים איתות חזקה, הם איטיים כדי להלבין ולא רעילים. חשוב מכך, הם צריכים להיות בהירים מספיק כדי לתת אות מעל autofluorescence של התאים ויהיו וכך היה לזהות באופן מהימן. אכן, תאים ראשוניים יכולים לגרום לאות רקע עקב autofluorescence של אברונים (כמו מיטוכונדריה וlysosomes). עם זאת בידיים שלנו, היה autofluorescenceנמוך מאוד בהשוואה לבהירות של EGFP-G3BP, וזה היה קל להבחין אות EGFP של תאי transfected לעומת תאים לא transfected. בסך הכל, הבחירה של מסננים אופטימליים ורמות עוצמת אור הלייזר תהיה קריטית כדי להשיג את היחס הנכון אות לרעש, הקשורים לרעילות נמוכה. לבסוף, אם תמונות צריכה להיחקר כמותית, חשוב להיות בטוח שעוצמת הקרינה של החלבון אינה רגישה לגורמים סביבתיים כמו מרכיבים של המדיום לתרבות.
אכן ניתן להשוות דינמיקת SGS (מהירות של ההרכבה, גודל ומספר של גרגרים) בין תנאים שונים (תאים מסוג פראי וחיות עקום החוצה לדוגמא). על מנת לקבל תוצאות מובהקות סטטיסטי, אחד צריך תאי תרבות מלפחות שלושה בעלי חיים שונים של כל גנוטיפ או מצב (משלוש המלטות שונות), ותמונה בין 10 ו50 תאים בכל ניסוי עצמאי. ניתן לסמן מספר עמדותבתוכנת רכישות ובכך לכמה תאי תמונת transfected באותו הזמן, המאפשרים להגדיל את הנתונים שהתקבלו בזמן קצר יחסית. ההדמיה כמה תאים בו זמנית היא מעניינת כמו שזה יהיה קשה לשימוש נוסף באותה צלחת פטרי ברגע שהתאים לחוצים וצלמו (במקרים בהם ההרכבה של SGS היא למד, או אם תנאי הניסוי ברכישות ארוכות לגרום cytotoxicity). עם זאת, כאשר הכימות "המספר" פרמטרים ו" גודל "של SGS - ועל מנת להגדיל את מספר התאים צילמו להשיג רלוונטיות סטטיסטיות יותר (יותר מ 50 תאים של כל פרט) - ניתן לתקן בתאים לאחר טיפול arsenite, כך שיותר תאים באותו צלחת פטרי ניתן ללמוד. וידאו עדיין לשמש כתוצאות איכותיות במקרה זה.
הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר ללמוד SGS המכיל G3BP בתאים חיים ראשוניים, והוא יכול להיות מותאם לגופים סלולריים אחרים וcomp חלבון האחרonents של גופים אלה (כמו TIA-1 / R עבור SGS, FRMP וStaufen לSGS וגרגרי תחבורה עצביים). השימוש בתאים ראשוניים הוא מעניין במיוחד בהקשר של מחקרים פיסיולוגיים, הכוללים לבעלי חיים מהונדסים למשל. ואכן, עכברי G3BP1 KO חושפים למשל את הפונקציה חיונית של גורם SGS בהישרדות ולהתפתחות של האורגניזם, כמו גם במערכת העצבים המרכזית מתפקד 14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להכיר את פלטפורמת מונפלייה ריו ההדמיה (MRI) שבו בוצעו הרכישות. הם מודים איזבל כריסטינה לופז מחייה, אלכסנדרה מץ, אירינה Lassot, סולאנז' Desagher, פביאן Loustalot, וירג'יני Georget לעזרתם בחלקים שונים של הפרוטוקול. עבודה זו נתמכה על ידי Fondation לשפוך la משוכלל ונדיר Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-N ° DEQ20111223745).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Prewarm at 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0.1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al.
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
