Summary
Стресс гранулы (SGS) являются цитоплазматические гранулы РНК, содержащие зашедших в тупик частицы рибонуклеопротеин (мяРНП), и важно в клеточного ответа на различных стрессов. Динамика ИК может следовать в живых клетках, визуализируя локализацию помеченной составляющей ИК в трансфектированных первичных клеток после стресса.
Abstract
SGs могут быть визуализированы в клетках иммунным окрашиванием конкретных белковых компонентов или полиА + мРНК. SGs очень динамичны и изучение их собраний и судьбы Важно понимать, клеточный ответ на стресс. Дефицит в ключевых факторов ПГ как G3BP (домен связывающий белок RasGAP SH3) приводит к дефектам развития у мышей и изменениями центральной нервной системы. Для изучения динамики ИК в клетках из организма, можно культуры первичных клеток и следуйте локализацию трансфицированной меткой компонента ПГ. Мы описываем покадровой эксперимент наблюдать G3BP1 содержащих ГХ в мышиных эмбриональных фибробластов (MEFs). Этот метод также может быть использован для изучения G3BP содержащих ГХ в живых нейронов, что имеет решающее значение, как недавно было показано, что эти SGs формируются в начале нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера. Этот подход может быть адаптирован к любым другим компонентом клеточного тела и гранулы белка, и выполняетсяс трансгенными животными, позволяя живой исследование динамики гранул, например, в отсутствие конкретного фактора этих гранул.
Introduction
Стресс гранулы (SGS) не являются мембранные цитоплазматический очаги образуются в клеточном защитной реакции на воздействия окружающей среды, например, повышенной температуре, окислительный стресс, гипоксия, осмотического шока, УФ-облучения, лишение глюкозы или вирусной инфекции 1. Они могут быть индуцирован химически путем обработки соединений, таких как арсенита натрия, который вызывает окислительный стресс. SGs накапливаются тупик перевода арестован посыльного рибонуклеопротеин (mRNPs) комплексы 2, наложение ареста мРНК от трансляционного аппарата, и их сборка может быть вызвано фосфорилирования eIF2α (коэффициент эукариотической инициации 2 α). SGs динамические структуры, которые обмениваются компоненты с полисом и других гранул, как Р-органов. Они представляют собой «сортировки центр", где мРНК сортируются и обрабатываются либо перевода, реинициацию, деградации или упаковки в стабильных, не полисомной mRNPs 3. Сборка ПГ быстро бут это постепенный процесс с начальными многочисленных мелких агрегатов, которые сливаются в более крупные гранулы. Использование химических ингибиторов, которые нарушают или стабилизации микротрубочек показывает, что микротрубочки сети требуется для динамики SG включая монтаж, слияний и разборки процессов.
Динамическая сборка ПГ способствует также агрегации конкретных РНК-связывающих белков (РНК-ВР), как TIA-1 (Т-клеток внутреннего антиген-1) и TIAR (TIA-1, связанных белка), которые способны димеризуются и способствовать полисом разборку и маршрутизацию мРНК в ИК 4. G3BP (RasGAP SH3 домен связывающий белок) такова, РНК-ВР, что локализуется в ИК когда клетки подчеркнуть, с арсенитом или при высокой температуре, и избыточная экспрессия дефосфорилированного G3BP может индуцировать SGS узел 5.
G3BP является эволюционно консервативными РНК-ВР, который был первоначально характеризуется через его взаимодействия с белка, активирующего Рас-GTPase (RasGAP р120 6); но это взаимодействие было недавно повторно 7. Семья G3BP входят два члена у млекопитающих, G3BP1 (именуемые G3BP) и G3BP2 8. Оба белка локализуются в ИК, когда клетки подвергаются стрессу 9. G3BPs включают N-концевой домен NTF2 предложил оказывать влияние на их локализацию и олигомеризации, а затем пролина (PxxP) мотивы, то С-концевые мотивы, связанные с связывания РНК: каноническое РНК-Recognition Motif (RRM) с консервативных RNP1 и RNP2 мотивов , с последующим богатой (РГГ) окне аргинин-глицин. Интересно, что анализ различных частях белка путем построения разные домены, слитые с EGFP показали, что NTF2-подобного домена и РНК-связывающий домен были наиболее эффективно нанят для ПГ, предполагая важность свойств димеризации и связывания РНК в сборка ПГ. Разнообразные модели выявили различные функции G3BP белков в пробирке 10-13.Срыв G3BP в мышах показали важность этого белка в росте развития и выживания 14, а также важную роль для G3BP в центральной нервной системы (ЦНС), характеризуется атаксией и дефектов в пространственной рабочей памяти 15. Дефицит G3BP приводит к измененной нейронов пластичности и кальция гомеостаза, устанавливая прямую связь между формированием SG и нейродегенеративных заболеваний 15. Таким образом, важно, чтобы иметь возможность изучить динамику ПГ в первичных клеток, как нейроны.
Этот протокол обеспечивает простой способ наблюдать сборку G3BP1 содержащих ИК в первичных клеток на лечении арсенит. Он может быть использован для изучения SGS сборки при различных условиях, например, различные виды нагрузок. Он также может быть приспособлен к другим гранул или других компонентов ПГ. В самом деле, этот протокол фокусируется на G3BP1, но есть и другие гранулы стресс маркеры, как TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (ломкой Х Умственная отсталость Синдром белок) 16, TDP-43 (ответ транзактивной ДНК-связывающего белка 43) 17 или Staufen 18. В частности, белки, такие как TIA-1 / R, подобно G3BP, зародышеобразования РНК связывающих белков, которые могут вызвать SGS сборку при избыточной экспрессии, даже если различные образованные SGs может отличаться в зависимости, регулирования и связанных с ними транскриптов. Трансфекция флуорофора с метками версии любой из этих ключевых компонентов или нуклеаторов из ИК могут быть выполнены, чтобы изображения конкретной сборки и динамики SGS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные процедуры в настоящем Протоколе в строгом соответствии с руководящими принципами Директивы Европейского сообщества Совета от 24 ноября 1986 (86-609/EEC). Дом мышей в группе, что позволяет пищу и воду без ограничений. Поддерживать их в контролируемой среде (22 ± 1 ° С, 55 ± 5% влажности) с 12 часов: 12 часов света: темно-цикла (свет на в 7:00).
1 Культура мышиный первичных элементов:. Мышиных эмбриональных фибробластов (МЭФ)
- Автоклав тонкие щипцы, а также изогнутые щипцы и рассекает ножницы. Хранить в стерильный контейнер. С помощью стерильного D-PBS (Дульбекко забуференным фосфатом физиологическим раствором). Подготовить всю MEFs среда: модифицированный Дульбекко среде Игла (DMEM) / F12 с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS), 1 мМ L-глутамина, 1 мМ пирувата натрия, 1% заменимых аминокислот и 0,5 мМ 2-меркаптоэтанола и теплый при 37 ° С
- Усыпить беременную мышь (на 13,5 дней после коитуса (DPC)) Путем смещени шейных позвонков. Удалите рога матки от мыши продезинфицировать с 90% этанола. Под стерильной и чистой капотом, разместить рога с эмбрионов в 37 ° С, предварительно нагретую D-PBS. Откройте рога, место эмбрионы в 100 мм стерильный пластиковый чашку Петри, очистить их от пупочной материала мозга и мыть их теплой D-PBS для удаления избытка крови. Под бинокль, удалить конечности эмбриона, внутренние органы и верхняя часть головы, содержащей мозг.
- В новом чашку Петри, пропустить через мясорубку эмбрионов в очень мелкие кусочки хирургический стерильный лезвие или ножницы (по крайней мере в течение 1 мин). В случае эмбрионов разных генотипов, будьте осторожны, чтобы поставить каждого эмбриона в отдельных чашках Петри и держать хвост или верхнюю головку для генотипирования.
- Крышка эмбрион с 1x трипсина-ЭДТА (0,25% трипсина, 1 мМ ЭДТА). Выдержите в течение 30 мин до 1 часа в 37 ° C инкубаторе. Добавьте 10 мл в комплектеMEFs среднего остановить реакцию трипсина. Внесите вверх и вниз, чтобы удалить все агрегаты. Пусть сидят клеточной суспензии в 50 мл пробирку (наполненной полной среде) в течение 10 мин, и супернатант центрифугируют в течение 5 мин при 300 х г при комнатной температуре. Ресуспендируют осадок в полной среде (6 мл на 1 эмбриона). Жизнеспособные ядерных клеток можно пересчитать с помощью Трипановый синий (Около 5 х 10 6 клеток можно ожидать от одного эмбриона). Пластинчатые 3 мл на 60 мм чашки Петри.
- Измените среду на следующий день и позволяют клеткам расти пока блюда не сливающийся. Многие типы клеток можно видеть, но только фибробласты выживет субкультуру.
- Сплит клетки и позволить им не расти в 35 мм чашки с стеклянным дном (важно для эксперимента длительной записи), пока 50-70% слияния для трансфекции. Тест на микоплазмы и патогенов мыши.
2. Культураdaptations в случае нейронов
- За день до культуры, слой 35 мм со стеклянным дном чашки Петри с поли-L-лизина (200 мкл 0,1 мг / мл) в стерильном и чистый капот, и оставьте на ночь.
- На следующее утро, промыть стерильной чистой воды, дважды в течение 5 мин и один раз в течение 45 мин до 1 часа. Заменить с 2 мл DMEM плюс 10% FBS среды и держать в инкубаторе 37 ° C.
- Проанализируйте эмбрионов на 18,5 DPC. Под стерильной и чистой капотом, разместить рога с эмбрионов в холодной стерильной HBSS (Хэнка сбалансированный солевой раствор) в 100 мм чашки Петри. Новорожденных щенков также может быть использован вместо эмбрионов в целях сохранения жизни плотины и дать ему возможность производить больше потомства, особенно в случае трансгенных животных, которые могут быть трудно получить. В отдельных чашках Петри, принимать каждый эмбрион или новорожденного и отрезать голову ножницами. Держите голову, вставив изогнутых щипцов в глаза, порезать кожу и осторожно откройте мягкую череп со спиныголовы до глаз, на каждой стороне головки. Разрежьте зрительные нервы и ствол головного мозга, удалить мозг, и положил его в новом чашку Петри, содержащую HBSS. Под стереоскоп, удалить все мозговые оболочки, используя две тонкие щипцы. Отделите гиппокампа, коры или любой другой части мозга в зависимости от структуры, чтобы учиться.
- Погрузите расчлененный структуру мозга в 4,5 мл холодного HBSS подготовлен ранее в 15 мл пробирки и держать на льду до расщеплением трипсином. Добавляют 0,5 мл 2,5% трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 15 мин до 20 мин. Промойте трипсина 3 раза с HBSS, будучи чрезвычайно осторожны, чтобы не отказаться от переваренных части мозга.
- Ресуспендируют в 500 мкл (гиппокамп) в 1 мл (кора) DMEM плюс 10% FBS и пипетки вверх и вниз несколько раз с 1 мл микропипетки, снабженной наконечником 1 мл, а затем оснащен 1 мл плюс 200 кончиков мкл, пока не будет нет видимая совокупность.
- Распределить 100-200 мкл клеточной суспензии в каждую 35 мм стекла Bottoм Петри, содержащие DMEM плюс 10% FBS, и пусть нейроны придерживаться при 37 ° С в течение по крайней мере 3 часов. Заменить на предварительно нагретые нейронов полной среде (Neurobasal среде, дополненной 250 мкМ L-глутамина и NS21, полученного, как описано в Chen и соавт. 19) и оставить на 37 ° С, чтобы позволить роста нейронов. Трансфекции нейронов от 5 до 14 дней в пробирке (дел) (эффективность трансфекции выше через пару див, но синаптических связей лучше создана с 7-10 дел).
3. Трансфекцию EGFP-G3BP1 Construct
Трансфекции клеток вектором, содержащим кДНК вашего интерес белка (любой компонент ПГБ), слитого с флуоресцентным маркером (GFP, YFP и т.д.), с использованием 3 мкг очищенной плазмиды в 35 мм чашку.
- Трансфекции MEFs используя коммерческий метод, следуя протоколу производителя (см. таблицу материалов / Реагенты).
- Трансфекции нейронов с кальциемфосфат метод адаптирован из Ся и др. 20 кратко.:
- Подготовка решения: DMEM-стирка: DMEM, содержащей 25 мМ KCl; трансфекции решение: DMEM-краска, которая содержит 1x DMKY (HEPES 5 мМ, MgCl 2, 10 мМ, фенол красный); и шок решение: HeBS 1x, 1x DMKY и ДМСО 2% (объем / объем); и держать их при 37 ° С
- Извлеките носитель из нейронов, фильтрата, и держать его при 37 ° С Промыть DMEM стирки затем заменить трансфекции среды и держать при температуре 37 ° С в течение подготовки фосфата кальция-плазмиды осадков ДНК.
- В 1,5 мл трубки микроцентрифужных, добавить (в этом порядке) Braun воды (конечный объем 50 мкл), 5 мкл CaCl 2 2,5 м, и 3 мкг ДНК плазмиды. Оставьте эту смесь на 50 мкл HeBS 2x уже введенных в круглом снизу полипропиленовую трубку. Смешайте трубки при вращении вместе с опусканием. Пусть форму осадка при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Добавьте precipitatе капл м на нейронах и оставить при 37 ° С в течение от 30 до 50 мин.
- Замените ударной раствор в течение 1 мин, затем смыть DMEM стирки и, наконец, вновь ввести выдержано среду. Держите клетки при 37 ° С.
4. Визуализация G3BP Содержит SGS Ассамблею и динамика
- Заменить среда клеток, который содержит фенол красный по фенолового красного среде.
- Используйте конфокальной микроскопии, оснащенный флуоресценции для приобретений. Включите систем микроскопа: ртутная лампа, компьютер и лазеры. Разминка в камеру до 37 ° С не менее 20 мин до начала приобретений.
- Над выражением G3BP индуцирует спонтанное формирование типа ПГ. Эти клетки могут таким образом быть соблюдены для сборки SGs 24 часами сразу после трансфекции без индукции стресса. Кроме того, стресс может быть вызван в дальнейшем вызвать сборку ПГ. Добавить 0,5 мм арсенит натрия и звездут о приобретении сразу после добавления соединения (гранулы будут хорошо сформированной в течение 1 часа).
- Добавить масло в иммерсионного объектива (использовать 40x или 63x целей) и установить чашку Петри над целью в адаптированном 35 мм держатель микроскопа, стабилизировалась на держателе стадии. Убедитесь, что блюдо плоским иначе приобретения будут изменены. Включите света флуоресценции в соответствии с соответствующим флуорофора и визуализировать трансфицированных клеток. Выключите флуоресценции раз клетка представляет интерес в области, чтобы минимизировать отбеливание и цитотоксичность.
- В "приобрести вкладке" выберите лазеров в зависимости от длины волны возбуждения флуорофора тега (488 нм в нашем протоколе, который использует EGFP-тегами G3BP) и выберите адаптированный длину выбросов для ФЭУ (ФЭУ). Регулировка мощности лазера (обычно не более чем 10%), чтобы минимизировать шум и перенасыщение, а также токсичности, и установки усиления и смещения для изменения отношения сигнал-шум.Сканирование быстро (1000 Гц), с тем чтобы свести к минимуму продолжительность лазерного экспозиции (строка средний 2, рама средний 1). При желании, установить параметры для Z стека, чтобы иметь возможность восстановить изображение в 3D (Z шаг 1 мкм, как правило, хорошо с клетками). Определить интервал времени между каждым приобретения: меньшие интервалы позволяют получить более согласованной фильм, но это может вызвать фотообесцвечивания и токсичность (интервал 20 сек была использована в описанных опытах). Продолжительность полного приобретения может варьироваться в зависимости от типа стресса. Многие G3BP содержащих SGs формируются очень быстро проходит лечение арсенит и хорошо видны через 1 час лечения: в этом случае, выберите быстро клетки, чтобы фильм и начать приобретений сразу после стресса, с общей продолжительностью приобретения 15 - 20 мин в основном достаточно заметить, сборку нескольких ПГ.
- Сохранить фотографии и реконструировать стеки и кино, используя ImageJ программного обеспечения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Формирование Стресс гранула имеет важное значение в реакции клеток на стресс, позволяя сотовый адаптации с заблокированным перевода, пока стресс не освободится, связанные с предотвращением апоптоза. Разрешения на этом анализе для изучения ГХ в первичных клеток, следуя локализации ключевых компонентов SGS белка (рис. 1). G3BP, ключевым фактором SGS сборки, присутствует довольно диффузно в цитоплазме культивируемых MEFs или нейронов (рис. 2A а и с), и, очевидно, присутствует в виде дискретных гранул на лечении арсенит в MEFs, а также нейроны (рис. 2А б и г). Первичные клетки могут быть получены из трансгенных мышиных моделей, что позволяет, например, изучение гранул напряжение в отсутствие одного из их компонентов. Интересно, что дефицит G3BP1 в мыши приводит к тяжелым дефектов центральной нервной системы, в частности в атаксическая рhenotype характеризуется неспособностью правильно координировать движения (как видно в тесте конечностей сжимая, рис. 2б) и изменение пространственной рабочей памяти. G3BP1 присутствует в стрессовых гранул в нейронах, и это тем более интересно, что SGs было показано, что образуют в начале нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера.
Этот анализ (рис. 1), таким образом, позволяет изучать ГХ в первичных элементов, необходимых для изучения их состав и сборку в естественных условиях. Кроме того, он позволяет изучать живые клетки и таким образом могут быть использованы для проследить динамику SGS, визуализируя один или несколько их сверхэкспрессируется компонентов в режиме реального времени. Рисунок 3 показывает репрезентативные покадровой изображения, позволяющие следить за сборку и динамику G3BP1 содержащих ГХ в MEFs после лечения арсенит. На фиг.4А, тот же эксперимент проводится с мышиных нейронов гиппокампа в культеЮр. Локализация EGFP-G3BP1 идет от крупных субклеточных гранулированных структур в более определенным и более мелкие гранулы, SGS, после лечения арсенит. SGs были все более и более определен, если были продолжены приобретения (не показано), но морфология клеток начала меняться, вероятно, из-за жары и токсичности, вызванной лазерного возбуждения.
Временной интервал позволяет захват видео непосредственно наблюдать динамику SGS. Кроме того, использование конфокального микроскопа позволяет реконструировать изображение в Z стека и, таким образом, чтобы следовать полностью динамику тел по всей клетке в 3 измерениях (как показано на нейрона в определенное время на фиг.4В).
Рисунок 1. Описательный из основных шагов протокола. Первичные клетки культивируютиз эмбрионов (18,5 DPC (дней после коитуса) (или неонатальные щенков) для нейронов (а), 13.5 сантиметр для MEFs (б)). После трансфекции плазмидой, содержащей EGFP-G3BP1 кДНК клетки стресс и полученную с использованием лазерной сканирующей конфокальной микроскопии. Динамика G3BP1 содержащих ИК наблюдаются. Нейроны визуализировали с помощью МАР2 (ассоциированный с микротрубочками белок 2) окрашивание в (а), MEFs окрашиванием G3BP1 в (б). Они приведены в качестве иллюстративных фотографий, а также EGFP-G3BP1 трансфецировали мышиный нейрон (с) и фибробластов (г), которые являются самостоятельными картинами и не соответствуют клеткам, приведенных в (а) и (б).
Рисунок 2. (A). G3BP локализация в культивируемых MEFs и нейронов гиппокампа, лечить или стресс с арсенита натрия. G3BP в основном цитоплазматический, с диффузным окрашиванием в MEFs (а) или в крупных зернистых структур в сомы нейронов (с), когда клетки не подчеркнуто. Через 1 ч лечения арсенит натрия, G3BP локализуется в дискретных цитоплазматических гранул (MEFs, В и нейронов, г). Здесь, клетки фиксировали и иммунологически окрашивали с анти-G3BP1 антитела. Окрашивания MAP2 разрешений для выявления нейронов в) и г). ДНК счетчик окрашенных в голубой с Hoechst. Масштабные полосы представляют 2 мкм (А и В) и 10 мкм (в, г). (B). Когда поднял за хвост к полу (протезно-обхватив тест), мыши WT расширить свои ноги (слева) в то время как мыши G3BP1 KO показывает неправильное лапы-обхватив рефлекс близко к летучей мыши, как позы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
fig3highres.jpg "ширина =" 500 "/>
Рисунок 3. Последовательные приобретения в покадровой эксперимента, полученные с MEFs трансфекцированных EGFP-G3BP1, используя Leica SP5 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (возбуждение при длине волны 488 нм). Приобретения были начаты 10 мин после добавления арсенита натрия и полученный в течение 10 мин с интервалами в 20 сек. Шесть представительные изображения приведены с т времени в сек после добавления арсенита натрия (0,5 мм). Стрелки показывают две области, где мы можем увидеть сборку ПГ. Шкала бар = 2 мкм.
Рисунок 4. (A). Последовательные приобретения в покадровой эксперимента получены с мышиных нейронов гиппокампа трансфекцированных EGFP-G3BP1, используя Leica SP5 лазерной сканирующей конфокальной микроскопии (возбужденияна длине волны 488 нм). Приобретения были начаты 5 мин после добавления арсенита натрия и полученный в течение 40 мин с интервалами в 20 сек. Шесть представительные изображения приведены с т времени в сек после добавления арсенита натрия (0,5 мм). Стрелки показывают две области, где мы можем увидеть сборку ПГ. Шкала бар составляет 5 мкм д:. Дендритов; : Аксон. (B). Реконструкция 3-измерение от Z стека (5 приобретений в оси Z над общей сложности 10 мкм) нейрона трансфицированной EGFP-G3BP1 и обрабатывают арсенита натрия п:. Аксонов (дендритов или аксонов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть больше версия этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наиболее важные шаги в протоколе озабоченностью трансфекции и более конкретно приобретений промежуток времени, которые должны быть тщательно проверены, чтобы снизить вниз цитотоксичность.
Культура первичных элементов не является трудной частью, пока стерильные условия поддерживаются и осторожность берется для того, чтобы предотвратить повреждение во время вскрытия и диссоциации клеток шагов. MEFs можно хранить в замороженном на ранних проходов. Neuron трансфекции с фосфатом кальция было показано, хорошо работать 21 и этот протокол адаптирован из Xia соавт. 20 дает хороший уровень трансфекции, однако это может вызвать определенную гибель клеток. Важно трансфекции нейронов в течение нескольких дней следующие культуры, проверить рН растворов и контролировать инкубации нейронов с фосфатом кальция-плазмиды осадка, который не должен превышать 1 час. Проверьте под световым микроскопом и снимите Transfection среднего, если наблюдаются агрегаты. Количество промывок DMEM может быть увеличена.
За выражение некоторых компонентов SGS белка приводит к спонтанному сборки гранул, который, кажется включать олигомеризации и РНК привязки свойства этих белков, а в случае TIA-1 / R 4 или 5 G3BP. Таким образом, важно определить время, в которое вы можете начать временные приобретения недействительной. Несколько SGs могут видеть, как только 24 часа после EGFP-G3BP трансфекции, когда белок экспрессируется. Тем не менее, вызывая дополнительное напряжение приводит к образованию дополнительных гранул, которые могут отличаться как различные виды ИК с различными ключевых компонентов были определены при различных напряжений 1,22,23. Ассамблея ПГ быстро в живых клетках (так быстро, как 10-20 мин), и многие гранулы полностью сформирован в течение 1 часа лечения арсенит, он, таким образом, важно начать процесс приобретения как можно скорее кормеэ индукция стресса, если сборка должна быть изучена. На более поздних стадиях, однако, динамика ПГ также можно изучать, как маленькие гранулы могут сливаться в более крупные структуры, и эти структуры не являются фиксированными: их компоненты могут быть обменены с цитоплазме или других видов гранул, как P-органов, сайтов РНК распада 3. Rapid Eye-обнаружение трансфицированных клеток и быстрое мониторинг параметров поглощения (особенно X, Y, и Z координаты) позволяют получить фильм в том числе собраний гранул, а также для ограничения фотообесцвечивания и лазерно-индуцированной цитотоксичности, которая является другом важным шагом в живого изображения. Действительно, в некоторых случаях, мы могли наблюдать важные изменения в морфологии клеток и даже смерть нескольких клеток, если приобретения были выполнены в течение длительного периода времени (более 1 часа после индукции окислительного стресса с лечением арсенит). Для того чтобы предотвратить эти явления, можно закрепить сканирование и увеличить интервалыпродолжительность между каждым приобретения. Тем не менее, более короткие разрешения интервал, чтобы лучше проследить динамику ИК содержащих визуализировать белок, и чтобы получить более полный фильм. Таким образом, следует адаптировать параметры для каждого эксперимента, чтобы получить наилучшее фильм с ограниченной фотообесцвечивания и токсичности, в зависимости от основного типа клеток, от компонента гранул которым следует, и на соответствующем флуорофора молекулы.
Флуоресцентные метки белка, как правило, достаточно, чтобы фотостабильным быть отображены в течение всего срока эксперимента. Различные флуоресцентные белки могут работать хорошо, пока они производят сильный сигнал, медленно, чтобы отбелить и нетоксичны. Важно отметить, что они должны быть достаточно ярким, чтобы дать сигнал над флуоресценции клеток и, таким образом, быть надежно обнаружен. Действительно, первичные клетки могут индуцировать фонового сигнала за счет флуоресценции органелл (например, митохондрий и лизосом). Однако в наших руках, аутофлюоресценция былоочень низкий по сравнению с яркостью EGFP-G3BP, и это было легко отличить EGFP сигнал трансфекции клеток по сравнению с не трансфицированных клеток. В целом, выбор оптимальных фильтров и уровней интенсивности лазерного света будет иметь решающее значение для получения правильного сигнал-шум, связанный с низкой токсичностью. Наконец, если изображения должны быть количественно изучены, важно, чтобы убедиться, что интенсивность флуоресценции белка не чувствителен к факторам окружающей среды, таких как компоненты культуральной среды.
SGS динамика действительно можно сравнить (скорость сборки, размера и количества гранул) между различными условиями (клетки от дикого типа и нокаут-животных, например). Для того чтобы получить статистически значимые результаты, следует культур клеток из по меньшей мере трех различных животных каждого генотипа или состояния (от трех разных пометов), и изображение от 10 до 50 клеток в каждом независимом эксперименте. Можно отметить несколько позицийв программном обеспечении поглощений и, таким образом, чтобы изображения нескольких трансфицированных клеток в то же время, позволяющих увеличить полученные в относительно короткий период времени данных. Визуализация несколько ячеек одновременно интересно, как это будет трудно в дальнейшем использовать ту же чашку Петри, как только клетки подчеркнул и образ (в случаях, когда монтаж ИК изучается, или если условия эксперимента в длинных приобретений вызвать цитотоксичность). Однако, когда количественной оценки параметров "количество" и "размер" ИК - и для того, чтобы увеличить количество клеток отображаемого получить больше статистической значимости (более 50 клеток каждого индивида) - клетки могут быть исправлены после лечения арсенит, так что больше клеток на одной чашке Петри могут быть изучены. Видео будет по-прежнему использоваться в качестве качественных результатов в этом случае.
Протокол, описанный здесь позволяет исследовать G3BP содержащих ГХ в первичных живых клеток, и могут быть адаптированы к других клеточных тел и другой комп белкаОненца этих органов (например, TIA-1 / R для SGS, FRMP и Staufen для ПГ и нейронных транспортных гранул). Использование первичных клеток особенно интересно в контексте физиологических исследований с участием например трансгенных животных. Действительно, мыши G3BP1 KO выявить, например, важную функцию фактора SGS в выживание и развитие организма, а также в центральной нервной системе функционирования 14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что они не имеют конкурирующие финансовые интересы.
Acknowledgments
Авторы хотели бы выразить признательность за Монпелье Рио томография (МРТ) платформу, где были проведены приобретения. Они благодарят Isabel Cristina Lopez Mejia, Александра Мец, Ирина Lassot, Соланж Desagher, Фабьен Loustalot и Виржини Жорже за помощь в разных частях протокола. Эта работа была поддержана Fondation Pour La Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-п ° DEQ20111223745).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Prewarm at 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0.1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al.
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
