Summary
Stres granüller (SGS) takılmıştır ribonükleoprotein parçacıklar (RNP) ve çeşitli gerilimlere, hücresel yanıt olarak önemli sitoplazmik RNA ihtiva eden granüller bulunmaktadır. SG-Dinamiği stresten sonra transfekte primer hücrelerde SGS etiketli bileşeninin lokalizasyonu görselleştirerek canlı hücrelerde takip edilebilir.
Abstract
SGS spesifik protein bileşenlerinin ya da poli A + mRNA immuno hücrelerinde görselleştirilebilir. SGS son derece dinamik ve bunların montaj ve kader çalışma stres hücresel yanıtı anlamak önemlidir. G3BP (RasGAP SH3 alanı Binding Protein) gibi SGS önemli faktörler eksikliği fareler ve Merkezi Sinir Sistemi değişiklikler gelişim kusurlarına yol açar. Bir organizmanın, bir kutu kültürü birincil hücrelerden hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek ve SGS transfekte etiketli bileşenin lokalizasyonu izleyin. Biz Fare Embriyonik Fibroblastlar G3BP1 içeren SGS (MEF'ler) gözlemlemek için time-lapse deneyi tarif. Bu teknik aynı zamanda, yakın zamanda, bu SGS Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı oluşan göstermiştir gibi önemli olan, canlı nöronlar G3BP içeren SGS incelemek için kullanılabilir. Bu yaklaşım, başka bir hücre gövdesi ve granül protein bileşeni üzere uyarlanmış ve yapılabilirtransgenik hayvanlar, bu granüller belirli bir faktör yokluğunda, örneğin granüller dinamiklerinin canlı bir çalışma sağlar.
Introduction
Stres granüller (SGS) gibi yüksek bir sıcaklıkta, oksidatif stres, hipoksi, ozmotik şok, UV ışınlama, glikoz yoksunluğu, ya da viral enfeksiyon 1. çevresel strese, bir hücre koruyucu bir cevap olarak meydana olmayan zar sitoplazmik odak noktasıdır. Bu, oksidatif stres tetikler sodyum arsenit gibi bileşikler ile muamele ile kimyasal olarak indüklenebilir. SGS durdu çeviri tutuklandı haberci ribonükleoprotein (mRNPs) birikir öteleme makine gelen mRNA'larını kenetleyerek, 2 kompleksleri ve bunların montaj eIF2α fosforlaştırılmasına (ökaryotik başlatma faktörü 2 α) tarafından tetiklenebilir. SGS P-organları gibi polisomlar ve diğer tanecikler ile bileşenler alışverişinde dinamik yapılardır. Onlar mRNAlar sıralanır ve stabil olmayan polysomal mRNPs 3 çevrilmesinden, yeniden başlatılması, bozulması, veya paketleme ya için işlenen bir "triyaj merkezi" oluşturmaktadır. SGS montajı hızlı but daha büyük granüller halinde birleşerek ilk sayıda küçük agrega ile aşamalı bir süreçtir. Mikrotübülleri stabilize bozmak veya kimyasal inhibitörlerinin kullanımı, mikrotübül ağı tertibatı olup, birleşme ve demontaj işlemleri dahil SG dinamikleri için gerekli olduğunu göstermektedir.
SG-dinamik tertibatı aynı zamanda TIA-1 (T-hücresi iç antijen-1) ve RNA gibi özel bağlayıcı proteinlerin (RNA-BP) agregasyonu ile yükseltilir TIAR dimerize edebiliyoruz (TIA-1 ile ilişkili protein), ve SG-4 içine Polizom demontaj ve mRNAların yönlendirme teşvik. G3BP (RasGAP SH3 alan bağlayıcı protein) hücreleri arsenit yüksek sıcaklık ve stresli ve imalatçının talimatlarına G3BP aşırı ifadesi SGS montaj 5 uyarabilir zaman SG-lokalize bu tür bir RNA-BP olan.
G3BP ilk RasGAP p (a-Ras GTPaz aktive edici protein ile etkileşim yoluyla karakterize edildi evrimsel olarak muhafaza edilmiş bir RNA-BP120 6); ancak bu etkileşim son zamanlarda 7 dönülmüş oldu. G3BP ailesi iki memelilerde üyeleri, G3BP1 (G3BP olarak anılacaktır) ve G3BP2 8 içerir. Hücreler strese 9 tabi olduğunda her iki proteinin de, SGS de colocalize. Kanonik RNA-tanıma Motif (RRM) korunmuş RNP1 ve RNP2 motifli: G3BPs bir N-terminal domain NTF2 prolin açısından zengin (PxxP) motifleri, ardından da lokalizasyonu ve oligomerizasyon, etkilemek için önerilen ihtiva eder, daha sonra C-terminal motifi RNA bağlama ile ilişkili , bir arginin-glisin zengin (RGG) kutusu izledi. İlginç bir şekilde, EGFP kaynaşmış farklı etki oluşturarak bu proteinin farklı parçaların analiz NTF2-benzeri domain ve RNA-bağlama alanı en verimli şekilde dimerizasyonunun özelliklerinin önemini işaret, SGS alınmış ve RNA bağlama olduğunu göstermiştir SG-montaj. Çeşitli in vitro modelleri 10-13 içinde G3BP proteinlerin farklı işlevler ortaya koymuştur.Farelerde G3BP bozulması gelişim büyüme ve hayatta kalma 14, hem de uzaysal çalışma belleği 15'te ataksi ve bozuklukları ile karakterize olan Merkezi Sinir Sistemi (CNS) içinde G3BP için önemli bir rol bu proteinin önemini göstermiştir. G3BP eksikliği SG oluşumu ve nörodejeneratif hastalıklar 15 arasında doğrudan bir bağlantı kurarak, değişmiş nöronal plastisite ve kalsiyum dengesindeki yol açar. Bu nöronlar gibi primer hücrelerde SG-dinamiklerini incelemek edebilmek için bu nedenle önemlidir.
Bu protokol arsenit tedavi altında primer hücrelerde G3BP1 içeren SG-montajını gözlemlemek için basit bir yol sağlar. Bu gerilmeler, örneğin farklı türde, farklı koşullar altında SGS montaj incelemek için kullanılabilir. Ayrıca, SGS diğer granüller veya diğer bileşenler için adapte edilebilir. Nitekim, bu protokol G3BP1 üzerinde duruluyor, ancak TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2 gibi diğer stres granülleri belirteçler vardırFMRP (Fragile X Mental Retardasyon Sendromu protein) 16, TDP-43 (transactive yanıtı DNA bağlayıcı protein 43) 17 veya 18 Staufen. Özellikle, TIA-1 / R benzeri proteinler aşırı ekspreyonlandıkları zaman farklı oluşan SGS fonksiyonu, düzenlenmesi ve ilgili transkript farklı olsa bile, montaj SGS uyarabilir RNA bağlayıcı proteinler çekirdek, G3BP benzerleridir. SG-bu önemli bileşenlerinden herhangi birini veya çekirdeği oluşturucu bir flüoroforla etiketli versiyonu transfeksivonu görüntü özellikle SGS montaj ve dinamiklerine yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol tüm hayvan prosedürleri 24 Kasım 1986 (86-609/EEC) Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi kurallarına sıkı sıkıya bağlı bulunmaktadır. Yiyecek ve su ad libitum izin grubundaki fareler Evi. 12 saat ışık: karanlık döngüsü (7:00 ışık) bir 12 saat, kontrollü bir ortamda (22 ± 1 ° C,% 55 ± 5 nem) onları korumak.
1 Murin Primer Hücre Kültürü:. Fare Embriyonik Fibroblastlar (MEF'ler)
- Ince forseps gibi kavisli bir forseps ve diseksiyon makas otoklavlayın. Steril bir kapta saklayın. Steril D-PBS (Dulbecco'nun Fosfat-Tamponlu Tuzu) kullanınız. Tam MEF'ler orta hazırlayın:% 10 fetal dana serumu (FBS), 1 mM L-glutamin, 1 mM sodyum piruvat,% 1 temel olmayan amino asitler ve 0.5 mM 2-merkaptoetanol ile takviye edilmiş Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM) / F12 ve 37 ° C'de sıcak
- 13.5 gün sonrası coïtum (DPC hamile bir fareyi (Euthanize)), Boyunları kırılarak. % 90 EtOH ile dezenfekte fareden rahim boynuzları çıkarın. Steril ve temiz Kaputun altında, 37 ° C embriyolar ile boynuzları yerleştirmek D-PBS prewarmed. Boynuzları, yer açın 100 mm steril plastik Petri kabındaki embriyolar, göbek kordonu malzemeden onları temizlemek ve kan aşırı kaldırmak için ılık D-PBS ile yıkayın. Bir binoküler altında, embriyonun bacaklarda, iç organları kaldırmak ve beyin içeren başın üst kısmı.
- Yeni bir Petri tabağında, kıyma steril bir cerrahi ile çok küçük parçalar halinde embriyolar bıçak ağzı ya da makas (en az 1 dakika boyunca). Farklı genotiplerinin embriyo durumunda, tek tek her bir Petri tabaklarında embriyo koymak ve genotipleme için kuyruk ya da üst baş tutmaya dikkat edin.
- 1x tripsin-EDTA (% 0.25 tripsin, 1 mM EDTA) ile embriyo örtün. 30 dakika bir 37 ° C kuluçka makinesi içinde 1 saat için kuluçkalayın. Tam 10 ml EkleTripsin reaksiyonu durdurmak için MEF'ler ortamı. Pipet yukarı ve aşağı tüm agrega kaldırmak için. 10 dakika boyunca (tam ortam ile doldurulmuş) bir 50 ml tüp içine hücre süspansiyonu bekletin, ve oda sıcaklığında 300 x g'de 5 dakika boyunca santrifüj süpernatant. Tam bir ortam (1 embriyo için 6 ml) 'de pelet tekrar. Canlı çekirdekli hücreler tripan kullanılarak sayılabilir mavi (Yaklaşık 5 x 10 6 hücre bir embriyodan beklenebilir.) 60 mm Petri çanağı başına Levha 3 mi.
- Ertesi gün orta değiştirin ve hücrelerin büyümesine izin yemekler birleştirilebilmeli kadar. Çok hücre tipleri görülebilir ancak fibroblastlar alt kültür hayatta kalacaktır.
- Hücreleri bölmek ve bunları nakil için% 50-70 confluency kadar, cam altındaki (time lapse deney için önemli) ile 35 mm yemekleri büyümeye olanak sağlar. Mikoplazma ve fare patojenler için bir test.
2.. KültürüNöronlar Durumunda daptations
- Kültür bir gün önce, poli-L-lisin, steril ve temiz bir başlık altında (0.1 mg / ml 200 ul) ile kat 35 mm cam alt Petri kapları bir gece bekletin.
- Ertesi sabah, iki kez 45 dakika saat 1 için bir kez 5 dakika boyunca, steril saf su ile durulayın. 2 ml DMEM artı% 10 FBS ortamı ile değiştirin ve 37 ° C inkübatör tutun.
- 18.5 DPC embriyolar teşrih. Steril ve temiz bir başlık altında, 100 mm Petri tabağına steril soğuk HBSS (Hank Dengeli Tuz Çözeltisi) 'de embriyolar ile boynuzları yerleştirin. Yeni doğan yavrular da baraj ömrünü korumak ve özellikle elde etmek zor olabilir transgenik hayvanların durumda, daha fazla yavrular üretmek için sağlamak amacıyla yerine embriyo kullanılabilir. Bireysel Petri yemekleri, her embriyo veya yenidoğan almak ve makas ile başını kesti. , Gözlerinin içine kavisli bir forseps takarak kafa tutun deri kesilmiş ve dikkatle arkasından yumuşak kafatasını açmakbaş gözünde kadar başın her iki tarafında. Optik sinirler ve beyin sapı kesmek, beyin kaldırmak ve HBSS içeren yeni bir Petri kabındaki koymak. Stereoskop altında, iki ince forseps kullanarak tüm meninksler kaldırmak. Hipokampları, korteks veya çalışma yapısına bağlı olarak beynin başka bir bölümünü ayırın.
- Soğuk HBSS 4.5 ml kesilmiş beyin yapısı daldırın 15 ml tüpler içinde önceden hazırlanmış ve tripsin ile sindirme kadar buz üzerinde tutun. % 2.5 tripsin 0.5 ml eklenir ve 20 dakika için 15 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin. Sindirilmiş beyin parçalarını atmak değil son derece dikkatli olmak, HBSS ile tripsin 3x durulayın.
- Olana kadar, 1 ml ucu ile donatılmış bir 1 ml mikropipet ile 1 ml (korteks) DMEM artı% 10 FBS ve yukarı ve aşağı pipetleme için birkaç kez 500 ul (hipokampi) içinde süspanse edin, daha sonra, 1 ml artı 200 ul ipuçları ile donatılmış hiçbir görünür agrega.
- Her biri 35 mm cam botto hücre süspansiyonu 100-200 ul dağıtmaDMEM artı% 10 FBS ihtiva eden ve nöronlar, en az 3 saat boyunca 37 ° C'de uygun izin m çanak. Nöron önceden ısıtılmış tam ortam ile değiştirin (Neuro temelli vasat, 250 uM L-glutamin ile takviye edilmiş ve NS21 Chen et al. 19 'de tarif edildiği gibi hazırlanmıştır) ve nöronal büyümeyi sağlamak için 37 ° C'de bırakın. (Div) (transfeksiyon verimliliği div ancak sinaptik bağlantıların bir çift daha iyi 7-10 div kurulmuş olduktan sonra daha yüksektir), in vitro olarak 5-14 gün sonra nöronları transfekte.
EGFP-G3BP1 Construct 3. Transfeksiyonu
35 mm tabak başına saflaştırılmış plazmid 3 ug kullanılarak, bir flüoresan işaretleyici (GFP gibi, YFP) kaynaşmış ilgi protein cDNA (SGS herhangi bir bileşen) ihtiva eden bir vektör ile transfekte hücreleri.
- Üreticinin protokolü (Malzemeler / Reaktiflerin Tablo bak) sonra, ticari bir yöntemi kullanarak MEFS transfekte.
- Bir kalsiyum ile transfekte nöronlar. Xia ve arkadaşları 20 Kısaca uyarlanmıştır fosfat yöntemi:
- Çözümler hazırlayın: DMEM yıkama: 25 mM KCI içeren DMEM; transfeksiyon çözüm: 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, fenol kırmızı) içeren DMEM-yıkama; ve şok çözelti: HeBS 1x, DMKY 1x, DMSO ve% 2 (v / v); ve 37 ° C'de muhafaza edin
- Nöronlar, filtre ortamı çıkarın ve 37 ° C'de tutmak DMEM-yıkama ile yıkanmakta, daha sonra transfeksiyon ortamı ile değiştirin ve kalsiyum fosfat plazmid DNA çökeltilerinin hazırlanması sırasında 37 ° C'de tutun.
- Bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü içinde, (bu sırayla) Braun, su (50 ul son hacim), 2.5 M CaCI2 5 ul, ve plasmid DNA 3 mikrogram ekleyin. Zaten bir yuvarlak dipli polipropilen tüp tanıtıldı HeBS 2x 50 ul üzerine bu karışımı bırakın. Düşmesi ile birlikte dönmesi ile tüp karıştırın. 30 dakika boyunca oda ısısında çökelti şeklinde olsun.
- Precipitat Eklee nöronlar üzerine, damla damla ve 30-50 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
- 1 dakika boyunca şok çözümü ile değiştirin, sonra DMEM-yıkama ile durulayın ve nihayet koşullanan orta reintroduce. 37 ° C'de hücreleri tutun
SGS Meclisi ve Dinamikleri İçeren G3BP 4. Görselleştirme
- Fenol kırmızısı içermeyen ortam ile fenol kırmızı içeren hücrelerin orta değiştirin.
- Satın almalar için floresan ile donatılmış bir konfokal mikroskop kullanın. Mikroskop sistemleri açın: cıva lamba, bilgisayar, ve lazerler. En az 20 dk satın almalar başlamadan önce 37 ° C'ye odasını ısıtın.
- G3BP ve üzerinde ifadesi SG-bir tür kendiliğinden oluşumunu uyarmaktadır. Hücreler, bu nedenle stres oluşumu olmadan transfeksiyondan sonra 24 saat SGS hakkının montajı için gözlenebilir. Alternatif olarak, daha fazla gerilme SG-montajını uyarılması için indüklenebilir. 0.5 mM sodyum arsenit ve yıldız ekleşu bileşik (granüller de 1 saat içinde oluşturulacak) eklenmesinden sonra kazanılmasını t.
- Daldırma hedefi yağ ekleyin (40X veya 63X hedefleri kullanın) ve uyarlanmış 35 mm mikroskop tutucu hedefin üzerine Petri çanak kurmak, sahne tutucuya stabilize. Çanak satın almalar değişmiş olacak, aksi takdirde düz olduğunu kontrol edin. İlgili florofor göre flüoresans ışığı açın ve transfekte hücreler görselleştirmek. Ilgi konusu bir hücre sitotoksisitesini ağartma ve en aza indirmek için alanında bir kez floresan kapatın.
- "Kazanmak sekmesi", etiket flüorofor (EGFP-etiketli G3BP kullandığı protokolde 488 nm) uyarma dalga boyuna bağlı olarak lazerler seçin ve PMT için uyarlanmış emisyon uzunluğunu (photomultiplier tüp) seçin. Gürültü ve doyma hem de toksisite en aza indirmek için lazer gücü (genellikle% 10'dan fazla) ayarlayın ve kazancı ayarlanır ve gürültü oranının sinyali modifiye etmek için ofset.Lazer fuar süresini (line ortalama 2, kare ortalama 1) en aza indirmek için (1000 Hz) hızlı tarama. Eğer arzu edilirse, Z yığını için parametreler 3D görüntü (1 um'lik bir Z aşaması hücreleri ile genellikle ince) yeniden mümkün olacak şekilde ayarlanır. Her edinimi arasındaki süreyi belirleyin: küçük aralıkları daha tutarlı bir film elde etmek izin ama bu photobleaching ve toksisite (20 sn bir aralık açıklanan deneylerde kullanılan) neden olabilir. Toplam satın alma süresi stres türüne bağlı olarak değişebilir. Birçok G3BP içeren SGS arsenit tedavi altında çok hızlı oluşur ve tedavisi 1 saat sonra iyi görünür vardır: Bu durumda, 15 satın almalar toplam süresi, sağ stres sonra satın almalar film ve başlatmak için hızlı hücreleri seçin - 20 dakika çeşitli SG-montajını gözlemlemek için büyük ölçüde yeterli değildir.
- Resimleri kaydetmek ve ImageJ yazılımı kullanarak yığınları ve filmi yeniden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stres granül oluşumu stres apoptozun önlenmesi ile ilişkili, temizlendikten kadar durmuş çeviri hücresel adaptasyon izin, strese hücre yanıt olarak önemlidir. Bu tahlil izin anahtar SGS protein bileşenlerinin lokalizasyonu (Şekil 1) takip ederek, primer hücrelerde SGS çalışma. G3BP, SGS tertibatının önemli bir faktör, kültürlü MEF'ler veya nöronların (Şekil 2A, ve c) sitoplazmasında oldukça dağılmak mevcut olduğu, ve açık bir şekilde MEF'ler içerisinde arsenit tedavi yanı sıra nöron (Şekil 2A b altında ayrı granüller içinde mevcut olan ve d). Birincil hücreler, örneğin, kendi bileşenlerinden birinin yokluğunda stres granüllerin çalışmayı sağlayan, transgenik fare modellerinde elde edilebilir. İlginçtir, fare G3BP1 bir eksikliği, Merkezi Sinir Sistemi ağır kusurları başta olmak üzere Ataksik p açarve mekansal çalışma belleği bir değişiklik (a uzuv kopça testi, Şekil 2B'de görüldüğü gibi) doğru hareketlerini koordine etmek yetersizlik ile karakterize henotype. G3BP1 nöronlarda stres granüllerde mevcut olan ve bu SGS Alzheimer hastalığı gibi nörodejeneratif hastalıkların başlangıcı ile oluşturulması için gösterilmiştir ki daha da ilginç.
Bu deney, (Şekil 1) bu şekilde izin in vivo bileşimi ve montaj çalışma için gerekli birincil hücreler, SGS çalışma. Ayrıca, canlı hücre çalışma sağlar ve bu nedenle bir veya gerçek zamanlı olarak aşırı eksprese bileşenlerinin çeşitli görselleştirerek, SG-dinamiklerini takip etmek için kullanılabilir. Şekil 3 montaj ve dinamikleri takip etmek için temsili izin zaman atlamalı görüntüleri gösterir G3BP1 içeren arsenit tedaviden sonra MEF'ler SGS. Şekil 4A, aynı deney kült sıçangil hipokampal nöronlar ile yapılırure. EGFP-G3BP1 yerelleştirme arsenit tedaviden sonra, büyük subsellüler taneli yapılara daha belirgin ve daha küçük granüller, SGS gider. SGS daha fazla olduğunu ve satın alma devam eden (gösterilmemiştir), ancak, hücre morfolojisi değişmeye başlamıştır olsaydı daha muhtemelen lazer uyarımı ile uyarılan ısı ve toksisite için tanımlandığı gibidir.
Zaman atlamalı doğrudan SGS dinamiklerini gözlemlemek için bir video yakalama izin verir. Ayrıca, konfokal mikroskop kullanımı Z yığın bir görüntüyü yeniden oluşturmak için ve böylece (Şekil 4B'de tanımlanan bir zamanda bir nöron için tasvir edildiği gibi) 3 boyutlu hücre boyunca cisimlerin tamamen dinamiklerini izin verir.
Şekil 1. Protokolünün ana adımlardan Tipik. Birincil hücreler kültürlenirembriyolardan (nöronların (a) için 18.5 DPC (gün post-coitum) (ya da yenidoğan yavrular) MEF'ler için 13.5 DPC (b)). EGFP-G3BP1 cDNA içeren bir plazmidin transfeksiyon sonrasında hücreler stresli ve bir lazer tarama konfokal mikroskop ile görüntülendi. G3BP1 içeren SG-Dinamiği gözlenmektedir. Nöronlar, MAP2 (b) in G3BP1 lekeleme ile (a), MEF'ler içerisinde (mikrotübül İlgili Protein 2) boyama tarafından görüntülenmiştir. Bu açıklayıcı resimler, hem de EGFP-G3BP1 bağımsız resim ve (a) ile verilen hücrelere uygun olmayan nöron murin (c) ve fibroblast (d) transfekte edilmiş olarak (b).
Şekil 2,. (A). Kültürlü MEF'ler ve hipokampal nöronlar G3BP lokalizasyon, tedavi edilmemiş veya sodyum arsenit vurguladı. G3BP, esas olarak sitoplazmiktir MEF'ler (a) ve yaygın boyama ile ya da nöron hücreler stresli değildir (c) 'nin soma büyük granül yapıları. Sodyum arsenit tedavi 1 saat sonra, G3BP ayrı sitoplazmik granüllerde lokalize olur (b MEF'ler ve nöronlar, d). Burada hücreler, sabit ve bir anti-G3BP1 ile immunosteyn edildi. MAP2 boyama c nöronlar tanımlamak için izin) ve d). DNA Hoechst ile mavi karşı lekeli. Ölçek çubukları 2 um (A ve B) temsil eden ve 10 um (c ve d). (B). Katta (uzuv-clasping testi) doğru kuyruk tarafından kaldırdı G3BP1 KO fareler, bir yarasa gibi duruş yakın anormal bir pençe-clasping refleks gösterir, oysa WT fareler (sol) ayaklarını uzatmak. daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız Bu rakamın.
fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Şekil 3,. Bir Leica SP5 lazer konfokal tarama mikroskobu (488 nm bir dalga boyunda uyarma) kullanılarak EGFP-G3BP1 transfekte MEF'ler elde zaman atlamalı deneyde Ardışık satın alma. Satın Alma sodyum arsenit ilave edildikten sonra 10 dakika başladı ve 20 saniyelik aralıklar ile 10 dakika boyunca elde edilmiştir. Altı temsili resim sodyum arsenit (0.5 mM) ilave edildikten sonra saniyede zaman t ile verilmektedir. Oklar SGS montajını görebilirsiniz iki alanları göstermektedir. Ölçek çubuğu = 2 mikron.
Şekil 4,. (A). Time-lapse deneyde Ardışık satın almalar, bir Leica SP5 lazer tarama konfokal mikroskobu (uyarma kullanarak, EGFP-G3BP1 transfekte kemirgen hipokampalinden elde488 nm'lik bir dalga uzunluğunda). Satın Alma sodyum arsenit ilave edildikten sonra 5 dakika başladı ve 20 saniyelik aralıklar ile 40 dakika boyunca elde edilmiştir. Altı temsili resim sodyum arsenit (0.5 mM) ilave edildikten sonra saniyede zaman t ile verilmektedir. Oklar SGS montajını görebilirsiniz iki alanları göstermektedir. . Ölçek çubuğu 5 um d temsil: dendrite; a: akson. (B). EGFP-G3BP1 ile transfekte ve sodyum arsenit ile tedavi edilen bir nöronun Z yığını (10 mikron toplam üzerinde Z ekseninde 5 alımları) 3 boyutlu rekonstrüksiyon n:. Nörit (dendrit ve akson). daha büyük görmek için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın sürümü.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol endişe transfesktiyonu ve dikkatle sitotoksisite aşağı düşürmek için kontrol edilmesi gereken daha özel zaman atlamalı satın almalar, en kritik adımlar.
Primer hücre kültürü sürece steril koşullarda muhafaza edilir ve dikkatli diseksiyon ve hücre ayrışma adımları sırasında zarar görmesini önlemek için alınır gibi, zor bir parçası değildir. MEF'ler erken pasajlara donmuş muhafaza edilebilir. Kalsiyum fosfat ile transfeksiyon iyi Neuron 21, çalışması için gösterilmiştir ve bu protokol, et al Xia uyarlanmıştır. 20 transfeksiyon iyi düzeyde sağlayan, ancak, belirli bir hücre ölümüne neden olabilir. Bu çözeltilerin pH'ı kontrol edin ve 1 saat geçmemelidir kalsiyum fosfat plasmid çökelti ile nöronların inkübasyon izlemek için, kültürleme sonrasında, bir kaç gün içinde nöronları transfekte etmek için önemlidir. Işık mikroskobu altında kontrol edin ve tran çıkarınsfection orta agrega görülmektedir eğer. DMEM ile yıkar sayısı artabilir.
Bazı SGS protein bileşenlerinin aşırı ifadesi TIA-1 / R, 4 ya da 5 G3BP durumunda olduğu gibi, bu proteinlerin bağlanma özelliklerini oligomerizasyonu ve RNA dahil görünüyor granül kendiliğinden montajı, yol açar. Bu nedenle, bu zaman atlamalı satın alma başlayabilirsiniz süreyi tanımlamak önemlidir. Birkaç SGS kısa protein ifade edilir EGFP-G3BP transfeksiyondan sonra 24 saat olarak görebilir. Bununla birlikte, ilave bir stres yaratmadan farklı anahtar bileşenleri ile SGS olarak farklı farklılık ek granüllerin oluşumuna yol açan farklı streslere 1,22,23 altında tespit edilmiştir. SG-Meclisi (hızlı 10-20 dakika gibi) canlı hücreler hızlı ve çok granüller tamamen arsenit tedavisi 1 saat içinde oluşur, bunu en kısa sürede kıç olarak satın alma başlatmak için bu nedenle önemlidirer stres indüksiyon montaj incelenecek için varsa. Ancak daha sonraki aşamalarda küçük taneler daha büyük yapıların içine yekvücut gibi, SG-dinamikleri de ele alınabilir ve bu yapıların sabit değildir: onların komponentleri P-organları, siteler gibi granül sitoplazma ya da başka türlü ile değiştirilebilir RNA çürüme 3. Transfekte edilmiş hücrelerin hızlı göz algılama ve satın almalar parametreleri (özellikle de X, Y, Z ve koordinatları) hızlı izlenmesi photobleaching ve diğeri, lazer kaynaklı sitotoksisite, sınırlamak için granül montaj dahil olmak üzere, bir film elde etmek için izin yanı sıra, canlı görüntülemede kritik adım. Satın alma uzun bir süre (arsenit, tedaviden oxydative stres indüksiyonundan sonra daha fazla 1 saat) uygulandı Gerçekten de, bazı durumlarda, biz, önemli hücre morfolojisindeki değişiklikler ve birkaç hücre ölümüne bile gözlemlemek. Bu fenomeni önlemek için, bu tarama tutturmak için ve aralıkları artırmak mümkündürHer edinimi arasındaki süre. Ancak, daha kısa aralık izin daha iyi görsel protein içeren SG-dinamiklerini takip etmek, ve daha eksiksiz bir film elde etmek. Böylece, bir takip granül bileşende, birinci hücre tipine bağlı olarak, sınırlı ışıkla ağartma ve toksisite ile en iyi film elde etmek için her bir deney için parametreleri uyum ve ilişkili flüorofor molekül üzerinde olmalıdır.
Floresan protein etiketleri genellikle deney süresince yansıması için yeterince ışığa karşı dengelidirler. Farklı floresan proteinleri sürece, güçlü bir sinyal üretmek ağartmak için yavaş ve toksik olmayan olarak, iyi çalışabilir. Önemlisi, bu hücrelerin otoflüoresanla yukarıdaki sinyal vermek için yeterince aydınlık olmalıdır ve güvenilir bir şekilde tespit edilebilir. Nitekim, birincil hücreler nedeniyle (mitokondri ve lizozomlar gibi) organellerin otoflüoresanla için bir arka plan sinyali neden olabilir. Ancak bizim ellerde, otofloresan olduEGFP-G3BP parlaklığına karşılaştırıldığında çok düşük, ve transfekte değil hücrelerine karşı transfekte hücrelerin EGFP sinyalini ayırt etmek kolay oldu. Genel olarak, uygun filtreler ve lazer ışık şiddeti düzeylerinin seçim düşük toksisite ile ilişkili sağ sinyal-gürültü oranı elde etmek için önemli olacaktır. Görsel kantitatif incelenecek gerekir Son olarak, bu proteinin floresan yoğunluğu, kültür ortamının bileşenleri gibi çevresel faktörlere duyarlı olmadığından emin olmak için önemlidir.
SGS dinamikleri gerçekten farklı koşullar (örneğin, yabani tip ve knock-out hayvanlardan elde edilen hücreler) arasında (granül montaj, büyüklüğü ve sayısı hız) karşılaştırılabilir. Istatistiksel olarak anlamlı sonuçlar elde etmek için, bir gerektiği her genotip veya (üç farklı ikinci litre) bir durumda en az üç farklı hayvan ve her biri bağımsız bir deneyde görüntü 10 ile 50 arasında hücrelerden kültür hücreleri. Birkaç pozisyonları işaretlemek mümkünsatın alma yazılım ve bu nedenle nispeten kısa bir süre içinde elde edilen verileri geliştirmek için izin veren, aynı zamanda görüntü birkaç transfekte edilmiş hücreler, için. Bu hücreler (SGS montaj incelenmiştir olduğu durumlarda, satın alma ya da uzun deneysel koşullar, sitotoksisiteye yol ise) stresli ve görüntülü bir kez daha aynı Petri çanağı kullanımı zor olacak şekilde eş zamanlı olarak birçok hücre Görüntüleme ilginçtir. Ve (her bireyin fazla 50 hücre) daha fazla istatistiksel önemi elde etmek için görüntülü hücre sayısını arttırmak için - - parametreler "numarası" ve "boyutu" SGS miktarının Ancak, hücreler bu şekilde, arsenit tedaviden sonra tespit edilebilir, aynı Petri tabağına daha fazla hücre incelenebilir ki. Video yine bu durumda nitel sonuç olarak kullanılacaktır.
Burada açıklanan protokol birincil canlı hücrelerde G3BP içeren SGS incelemek için izin vermekte ve diğer hücresel organları ve diğer protein comp uyarlanabilir(SGS ve nöronal taşıma granüller için SGS, FRMP ve Staufen için TIA-1 / R gibi) bu organların onents. Birincil hücrelerin kullanımı, örneğin transgenik hayvan içeren, fizyolojik çalışmalar bağlamında özellikle ilgi çekicidir. Gerçekten de, G3BP1 KO farenin, örneğin 14,15 işlev gören bir SGS, bir organizmanın hayatta kalma ve gelişme faktör, hem de merkezi sinir sistemi içinde temel fonksiyonu ortaya koymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, hiçbir rakip mali çıkarlarını olmadığını beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar satın almalar yapıldı Montpellier Rio Görüntüleme (MRG) platformu kabul etmek istiyorum. Onlar protokol farklı yerlerinde kendi yardım için Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot ve Virginie GEORGET teşekkür ederim. Bu çalışma la Recherche Médicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745) Fondation tarafından dökün desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Prewarm at 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0.1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al.
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
