Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

Published: May 21, 2014 doi: 10.3791/51197
Automatic Translation
1, 1
1Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier, CNRS UMR 5535

Summary

حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي حبيبات الحمض النووي الريبي حشوية تحتوي على جزيئات بروتين نووي ريبوزي المتعثرة (RNPs)، والمهم في الاستجابة الخلوية لمختلف الضغوط. يمكن اتباعها ديناميات SGS في الخلايا الحية من خلال وضع تصور توطين عنصر الموسومة اس جي اس في الخلايا الأولية transfected بعد الإجهاد.

Abstract

SGS يمكن تصور في الخلايا المناعية التي كتبها مكونات بروتين معين أو بوليا + mRNAs و. SGS هي ديناميكية للغاية ودراسة جمعيتهم ومصير المهم أن نفهم الاستجابة الخلوية للإجهاد. نقص في العوامل الرئيسية لمثل SGS G3BP (RasGAP SH3 مجال بروتين ملزمة) يؤدي إلى عيوب التنموية في الفئران والتعديلات في النظام العصبي المركزي. لدراسة ديناميات SGS في الخلايا من كائن حي، يمكن للمرء الخلايا الأولية الثقافة واتبع توطين عنصر الموسومة transfected من SGS. نحن تصف التجربة الوقت الفاصل بين لمراقبة SGS التي تحتوي على G3BP1 في الخلايا الليفية الماوس الجنينية (MEFs). ويمكن أيضا أن تستخدم هذه التقنية لدراسة SGS التي تحتوي على الخلايا العصبية في G3BP الحية، وهو أمر حاسم كما تبين مؤخرا أن هذه SGS تتشكل في ظهور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر. يمكن تكييفها هذا النهج تجاه أي من مكونات أخرى من الجسم الخلوية والبروتينات الحبيبية، وأجرىمع الحيوانات المعدلة وراثيا، والسماح للدراسة حية من حبيبات ديناميات على سبيل المثال في حالة عدم وجود عامل معين من هذه الحبيبات.

Introduction

حبيبات الإجهاد (اس جي اس) هي بؤر حشوية غير الغشائي شكلت كرد الخلوية واقية للإجهاد البيئي، مثل درجة حرارة مرتفعة، الاكسدة، نقص الأكسجة، صدمة التناضحي، الأشعة فوق البنفسجية، والحرمان من الجلوكوز، أو عدوى فيروسية 1. أنها يمكن أن يتسبب كيميائيا عن طريق العلاج مع مركبات مثل الزرنيخ الصوديوم، والذي يطلق الاكسدة. اس جي اس تتراكم المتوقفة ترجمة القبض رسول بروتين نووي ريبوزي (mRNPs) مجمعات 2، عزل من mRNAs والآلات متعدية، ويمكن أن تسبب التجمع من قبل الفسفرة من eIF2α (بدء حقيقية النواة عامل 2 α). SGS هي هياكل دينامية تبادل المكونات مع polysomes وحبيبات أخرى مثل الهيئات-P. أنها تشكل "مركز الفرز" حيث يتم فرز mRNAs ومعالجتها وإما ترجمة، باستعادة وتدهور، أو التعبئة والتغليف في غير مستقرة mRNPs polysomal-3. تجميع SGS سريع بالتحرير هو عملية تدريجية مع العديد من المجاميع الصغيرة الأولية التي تتجمع في حبيبات أكبر. استخدام مثبطات الكيميائية التي تعطل أو استقرار الأنابيب الدقيقة تبين أن الشبكة أنيبيب هو مطلوب لديناميات SG بما في ذلك عمليات التجميع، التحام والتفكيك.

يتم الترويج لتجميع حيوي من SGS أيضا تجميع البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي محددة (RNA-BP) مثل TIA-1 (T-الخلية الداخلية مستضد-1) وTIAR (البروتين المتصلة TIA-1)، والتي هي قادرة على dimerize وتعزيز polysome التفكيك والتوجيه من mRNAs وإلى SGS 4. G3BP (RasGAP SH3 مجال البروتين ملزمة) مثل هذا RNA-BP أن يموضع لاس جي اس عندما تتعرض لإجهاد الخلايا مع الزرنيخ أو ارتفاع في درجة الحرارة، وoverexpression من G3BP dephosphorylated يمكن أن تحدث SGS التجمع 5.

G3BP هو الحفاظ تطويريا RNA-BP التي تميزت في البداية من خلال تفاعلها مع بروتين تفعيل رأس GTPase (ع RasGAP120 6)؛ ولكن هذا التفاعل تم مؤخرا إعادة النظر 7. ويشمل الأسرة G3BP عضوين في الثدييات، G3BP1 (المشار إليها باسم G3BP) وG3BP2 8. كل من البروتينات colocalize في اس جي اس، عندما تتعرض الخلايا للإجهاد 9. تشمل G3BPs اقترح مجال NTF2 N-محطة للتأثير على توطين وoligomerization، تليها البرولين الغنية (PxxP) الزخارف، ثم الزخارف C-محطة المرتبطة الحمض النووي الريبي ملزمة: الكنسي RNA-التعرف على الحافز (RRM) مع الحفظ RNP1 والزخارف RNP2 ، تليها الغنية (RGG) مربع أرجينين الجلايسين. ومن المثير للاهتمام، وأظهر تحليل أجزاء مختلفة من البروتين عن طريق بناء مختلف المجالات لتنصهر EGFP أن NTF2 مثل النطاق والمجال ملزم RNA كانت جندت أكثر كفاءة لSGS، مما يدل على أهمية خصائص dimerization والحمض النووي الريبي ملزمة في تجميع SGS. وقد كشفت نماذج متنوعة وظائف مختلفة من البروتينات G3BP في المختبر 10-13.وقد أظهرت اضطراب G3BP في الفئران أهمية هذا البروتين في النمو والبقاء على قيد الحياة 14 التنموية، فضلا عن الدور الهام للG3BP في الجهاز العصبي المركزي (CNS)، وتتميز ترنح وعيوب في الذاكرة العاملة المكانية 15. نقص G3BP يؤدي إلى تغير الخلايا العصبية اللدونة والكالسيوم التوازن، وإقامة صلة مباشرة بين تشكيل SG وأمراض الاعصاب 15. بالتالي فمن المهم أن تكون قادرة على دراسة ديناميات SGS في الخلايا الأولية مثل الخلايا العصبية.

يوفر هذا البروتوكول طريقة بسيطة لمراقبة تجميع المحتوية على G3BP1 SGS في الخلايا الأولية تحت العلاج الزرنيخ. ويمكن استخدامه لدراسة SGS التجمع في ظل ظروف مختلفة، على سبيل المثال أنواع مختلفة من الضغوط. فإنه يمكن أيضا أن تتكيف مع حبيبات أو غيرها من المكونات الأخرى من SGS. في الواقع، ويركز هذا البروتوكول على G3BP1، ولكن هناك علامات أخرى حبيبات الإجهاد مثل TIA-1 / R، TTP (tristetraprolin) 2،FMRP (X الهشة تخلف العقلي متلازمة البروتين) 16، TDP-43 (DNA استجابة transactive بروتين ملزمة 43) 17 أو 18 ستاوفن. على وجه الخصوص، والبروتينات مثل TIA-1 / R هي، مثل G3BP، nucleating البروتينات ملزمة الحمض النووي الريبي التي يمكن أن تحدث عند التجميع SGS بإفراط (overexpressed)، حتى لو كان SGS شكلت مختلفة يمكن أن تختلف في وظيفة والتنظيم والنصوص المرتبطة بها. ترنسفكأيشن من النسخة الموسومة fluorophore من أي من هذه المكونات الرئيسية أو nucleators من SGS لا يمكن أن يؤديها لصورة معينة التجمع اس جي اس والديناميات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

جميع الإجراءات الحيوان في هذا البروتوكول في الالتزام الصارم للمبادئ التوجيهية توجيهات المجلس الجماعة الأوروبية في 24 نوفمبر 1986 (86-609/EEC). بيت الفئران في المجموعة، مما يسمح للطعام والماء بالمال وبالشهرة أيضا الإعلانية. المحافظة عليها في بيئة تسيطر عليها (22 ± 1 درجة مئوية، 55 ± 5٪ الرطوبة) مع 12 ساعة: 12 ساعة ضوء: دورة الظلام (الضوء على الساعة 7:00 صباحا).

1 ثقافة خلايا الفئران الابتدائية: الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFs)

  1. الأوتوكلاف ملقط رقيقة، وكذلك ملقط منحنية ومقص تشريح. تخزين في حاوية معقمة. استخدام معقم D-PBS (Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة). إعداد كاملة المتوسطة MEFs: Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) / F12 تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FBS)، 1 ملم L-الجلوتامين، 1 ملي البيروفات الصوديوم، 1٪ الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 0.5 مم 2 المركابتويثانول ودافئة في 37 درجة مئوية.
  2. الموت ببطء ماوس الحوامل (13.5 في أيام تال للجماع (DPC)) قبل خلع عنق الرحم. إزالة قرون الرحم من الماوس مطهرة مع 90٪ ETOH. تحت غطاء محرك السيارة معقمة ونظيفة، ووضع قرون مع الأجنة في 37 ° C D-prewarmed PBS. فتح قرون، ومكان الأجنة في 100 ملم العقيمة البلاستيك طبق بتري، تنظيفها من المواد الحبل السري وغسلها بالماء الدافئ D-PBS لإزالة الزائدة في الدم. تحت مجهر، إزالة أطرافه الجنين، الأعضاء الداخلية و الجزء العلوي من الرأس الذي يحتوي على الدماغ.
  3. في طبق بتري جديدة، اللحم المفروم و الأجنة إلى قطع صغيرة جدا مع العقيمة الجراحية شفرة أو مقص (على الأقل لمدة 1 دقيقة). في حالة الأجنة من المورثات مختلفة، وتوخي الحذر لوضع كل جنين في أطباق بتري الفردية والحفاظ على الذيل أو الرأس العلوي لالتنميط الجيني.
  4. تغطية الجنين مع 1X التربسين EDTA-(0.25٪ التربسين، 1 ملم EDTA). احتضان لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة في الحاضنة 37 درجة مئوية. إضافة 10 مل من اكتمالMEFs المتوسطة لوقف رد الفعل التربسين. الماصة صعودا وهبوطا لإزالة كافة المجاميع. ترك الجلوس تعليق الخلية في أنبوب مل 50 (مليئة المتوسطة كاملة) لمدة 10 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لطاف لمدة 5 دقائق في 300 XG في درجة حرارة الغرفة. resuspend الكرية في المتوسط ​​كاملة (6 مل ل1 الجنين). الخلايا الأنوية قابلة للحياة يمكن عدها باستخدام التريبان أزرق (حوالي 5 × 10 6 خلايا يمكن توقعه من جنين واحد). لوحة 3 مل لكل 60 مم طبق بتري.
  5. تغيير المتوسطة في اليوم التالي و تسمح للخلايا أن تنمو حتى يتم متموجة الأطباق. كثير ويمكن رؤية أنواع الخلايا، ولكن الخلايا الليفية فقط سوف البقاء على قيد الحياة ثقافة فرعية.
  6. تقسيم الخلايا والسماح لها أن تنمو في 35 ملم مع أطباق أسفل الزجاج (مهم لتجربة مرور الوقت)، حتى 50-70٪ confluency لترنسفكأيشن. اختبار لالميكوبلازما ومسببات الأمراض الماوس.

2. الثقافة وdaptations في حالة من العصبية

  1. قبل يوم من الثقافة، ومعطف 35 ملم الزجاج أطباق بتري أسفل مع بولي-L-يسين (200 ميكرولتر من 0.1 ملغ / مل) تحت غطاء معقمة ونظيفة، وترك بين عشية وضحاها.
  2. على صباح اليوم التالي، وشطف مع الماء النقي المعقم، مرتين لمدة 5 دقائق ومرة ​​واحدة لمدة 45 دقيقة إلى 1 ساعة. استبدال مع 2 مل من DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS المتوسطة وتبقى في الحاضنة 37 درجة مئوية.
  3. تشريح الأجنة في 18.5 DPC. تحت غطاء محرك السيارة معقمة ونظيفة، ووضع قرون مع الأجنة في HBSS العقيمة البارد (محلول الملح المتوازن هانك) في 100 ملم طبق بيتري. ويمكن أيضا الجراء حديثي الولادة أن تستخدم بدلا من الأجنة من أجل الحفاظ على حياة السد وتمكينها من انتاج المزيد من النسل، لا سيما في حالة من الحيوانات المعدلة وراثيا والتي يمكن أن يكون من الصعب الحصول عليها. في أطباق بتري الفردية، واتخاذ كل جنين أو الوليد وخفض الرأس مع مقص. عقد رئيس عن طريق إدراج ملقط المنحني في العيون، وقطع الجلد وبعناية فتح الجمجمة لينة من الخلفمن الرأس حتى العيون، وعلى كل جانب من الرأس. قطع الأعصاب البصرية وجذع الدماغ، وإزالة الدماغ، ووضعها في طبق بتري جديدة تحتوي على HBSS. تحت المجسام، وإزالة جميع السحايا باستخدام اثنين من ملقط رقيقة. فصل الحصين، القشرة أو أي جزء آخر من الدماغ اعتمادا على هيكل للدراسة.
  4. تزج بنية الدماغ تشريح في 4.5 مل من HBSS الباردة أعدت سابقا في 15 مل أنابيب والحفاظ على الجليد حتى الهضم مع التربسين. إضافة 0.5 مل من 2.5٪ التربسين واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى 20 دقيقة. شطف 3X مع التربسين HBSS، والحرص على عدم تجاهل غاية أجزاء الدماغ هضمها.
  5. resuspend في 500 ميكرولتر (الحصين) إلى 1 مل (القشرة) DMEM بالإضافة إلى 10٪ FBS والماصة صعودا وهبوطا عدة مرات مع 1 مل micropipette مجهزة تلميح 1 مل، ثم مجهزة 1 مل زائد 200 نصائح ميكرولتر، حتى يكون هناك لا الكلي مرئية.
  6. توزيع 100-200 ميكرولتر من تعليق خلية لكل 35 مم الزجاج بوتوم صحن يحتوي DMEM زائد FBS 10٪ والسماح للخلايا العصبية الالتزام عند 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 3 ساعة. استبدال الخلايا العصبية التي كتبها prewarmed المتوسطة كاملة (المتوسطة Neurobasal تستكمل مع 250 ميكرومتر L-الجلوتامين وNS21، أعد كما هو موضح في تشن وآخرون 19) وترك عند 37 درجة مئوية للسماح للنمو الخلايا العصبية. بالنقل الخلايا العصبية في 5-14 أيام في المختبر (شعبة) (كفاءة ترنسفكأيشن هو أعلى بعد بضعة اتصالات شعبة متشابك ولكن هي رسوخا 7-10 شعبة).

3. ترنسفكأيشن من EGFP-G3BP1 تعبيد

بالنقل الخلايا مع متجه يحتوي على [كدنا] من البروتين اهتمامك (أي مكون من اس جي اس) لتنصهر علامة فلوري (GFP، YFP، الخ)، وذلك باستخدام 3 ميكروغرام من البلازميد المنقى في 35 ملم الطبق.

  1. بالنقل وMEFs باستخدام طريقة التجارية، بعد بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد / الكواشف).
  2. بالنقل الخلايا العصبية مع الكالسيومطريقة الفوسفات مقتبس من شيا وآخرون 20 لفترة وجيزة.:
    1. إعداد الحلول: DMEM غسل: DMEM تحتوي على 25 ملي بوكل؛ الحل ترنسفكأيشن: DMEM غسل تحتوي على 1X DMKY (HEPES 5 مم، MgCl 2 10 ملي، الفينول الحمراء)؛ والحل صدمة: أنواع البسكويت العالي الطاقة 1X، DMKY 1X، وDMSO 2٪ (V / V)؛ والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية.
    2. إزالة وسائل الإعلام من الخلايا العصبية، الترشيح، والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية. تغسل مع DMEM غسل ثم استبدل مع ترنسفكأيشن المتوسطة والحفاظ على 37 درجة مئوية خلال إعداد الكالسيوم فوسفات البلازميد رواسب الحمض النووي.
    3. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة (في هذا النظام) براون المياه (الحجم النهائي 50 ميكرولتر)، 5 ميكرولتر من 2.5 و CaCl 2 M، و 3 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد. إسقاط هذا المزيج على 50 ميكرولتر من أنواع البسكويت العالي الطاقة 2X أدخلت بالفعل في الجولة أنبوب أسفل البولي بروبلين. مزج أنبوب بالتناوب مع إسقاط. السماح للشكل راسب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
    4. إضافة precipitatه قطرة قطرة على الخلايا العصبية وترك عند 37 درجة مئوية خلال 30 إلى 50 دقيقة.
    5. استبدال الحل صدمة لمدة 1 دقيقة، ثم يشطف DMEM غسل وأخيرا إعادة العمل المتوسطة شروطا مسبقة. إبقاء الخلايا في 37 درجة مئوية.

4. التصور من G3BP تحتوي على الجمعية SGS وحيوية

  1. استبدال المتوسطة من الخلايا التي تحتوي على الفينول الحمراء الفينول الحمراء الخالية المتوسط.
  2. استخدام المجهر متحد البؤر مضان مجهزة لعمليات الاستحواذ. بدوره على أنظمة المجهر: مصباح الزئبق، والكمبيوتر، وأجهزة الليزر. الاحماء الغرفة إلى 37 درجة مئوية على الأقل 20 دقيقة قبل بداية عمليات الاستحواذ.
  3. التعبير أكثر من G3BP الحث على تشكيل عفوية من نوع اس جي اس. وبالتالي يمكن لاحظت خلايا لتجميع اس جي اس 24 ساعة مباشرة بعد ترنسفكأيشن دون إجهاد الاستقراء. بدلا من ذلك، والإجهاد يمكن أن يتسبب في مزيد من حمل التجمع من SGS. إضافة 0.5 ملي الزرنيخ الصوديوم ونجمةر اكتساب الحق بعد إضافة المركب (سيتم تشكيل حبيبات جيدا في حدود 1 ساعة).
  4. إضافة إلى النفط الهدف الغمر (استخدام 40X 63X أو أهداف) وتثبيت طبق بيتري على الهدف في تكييفها 35 مم حامل المجهر، استقرت على حامل المرحلة. تأكد من أن طبق مسطح وإلا سيتم تغيير الاستحواذ. بدوره على ضوء مضان وفقا لfluorophore ذات الصلة ووضع تصور الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل. إيقاف مضان مرة واحدة في خلية من الفائدة في الميدان من أجل تقليل تبيض وسمية الخلايا.
  5. في "الحصول على علامة التبويب"، حدد الليزر اعتمادا على الطول الموجي الإثارة من fluorophore علامة (488 نانومتر في بروتوكول لدينا والذي يستخدم G3BP الموسومة EGFP) وحدد طول الانبعاثات تكييفها لPMT (أنبوب مضخم). ضبط قوة الليزر (عادة لا تزيد عن 10٪) للحد من الضوضاء وoversaturation فضلا عن سمية، وتعيين مكسب وتعويض لتعديل إشارة إلى نسبة الضوضاء.مسح سريع (1،000 هرتز) من أجل تقليل مدة المعرض ليزر (الخط المتوسط ​​2، والإطار متوسط ​​1). إذا رغبت في ذلك، تعيين المعلمات لZ المكدس لتكون قادرة على إعادة بناء الصورة في 3D (خطوة Z من 1 ميكرومتر عادة ما يكون على ما يرام مع الخلايا). تحديد الوقت الفاصل بين كل اقتناء: تسمح فترات أصغر للحصول على الفيلم أكثر تماسكا ولكن هذا قد تحفز photobleaching من وسمية (تم استخدام فاصل زمني من 20 ثانية في التجارب وصفه). مدة الاستحواذ الكلي قد تختلف تبعا لنوع من الإجهاد. وشكلت العديد من SGS التي تحتوي على G3BP بسرعة كبيرة تحت العلاج الزرنيخ وتكون مرئية بشكل جيد بعد 1 ساعة من العلاج: في هذه الحالة، واختيار الخلايا بسرعة إلى السينما وبدء عمليات الاستحواذ مباشرة بعد الإجهاد، مع المدة الإجمالية من عمليات الاستحواذ من 15 - 20 دقيقة كافية إلى حد كبير لمراقبة تجميع العديد من SGS.
  6. حفظ الصور وإعادة بناء المداخن والفيلم باستخدام برنامج ImageJ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تشكيل الإجهاد الحبيبية مهم في استجابة الخلايا للإجهاد، والسماح التكيف الخلوية مع الترجمة المتعثرة، حتى طهر الإجهاد، ويرتبط لمنع موت الخلايا المبرمج. تصاريح هذا الاختبار لدراسة SGS في الخلايا الأولية، وذلك باتباع توطين المكونات الرئيسية البروتين اس جي اس (الشكل 1). G3BP، عاملا رئيسيا من SGS التجمع، هو الحاضر بدلا diffusively في سيتوبلازم الخلايا العصبية MEFs مثقف أو (الشكل 2A ألف وجيم)، وموجودة بشكل واضح في حبيبات منفصلة تحت العلاج الزرنيخ في MEFs وكذلك الخلايا العصبية (الشكل 2A ب و د). ويمكن الحصول على الخلايا الأولية من نماذج الماوس المعدلة وراثيا، مما يسمح على سبيل المثال دراسة حبيبات التوتر في غياب أحد مكوناتها. ومن المثير للاهتمام، ونقص في G3BP1 الماوس يؤدي إلى عيوب شديدة من الجهاز العصبي المركزي، وخاصة في ص رنحيhenotype تميزت عدم القدرة على تنسيق الحركات بشكل صحيح (كما رأينا في اختبار أطرافهم الشبك، الشكل 2B) وتغيير المكانية الذاكرة العاملة. G3BP1 موجودة في حبيبات التوتر في الخلايا العصبية، وهذا هو كل شيء أكثر إثارة للاهتمام التي ثبت اس جي اس لتشكيل في ظهور الأمراض العصبية مثل مرض الزهايمر.

هذا الاختبار (الشكل 1) وهكذا تصاريح لدراسة SGS في الخلايا الأولية، التي لا غنى عنها لدراسة تكوينها والتجمع في الجسم الحي. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح للدراسة الخلايا الحية وبالتالي يمكن أن تستخدم لتتبع تحركات اس جي اس، من خلال وضع تصور واحد أو أكثر من مكونات بإفراط (overexpressed) في الوقت الحقيقي. الشكل 3 يبين الصور الوقت الفاصل بين ممثل السماح لمتابعة التجمع وديناميات اس جي اس في MEFs بعد العلاج الزرنيخ التي تحتوي على G3BP1. في الشكل 4A، يتم تنفيذ نفس التجربة مع الخلايا العصبية قرن آمون الفئران في عبادةلدى عودتهم. EGFP-G3BP1 توطين يذهب من هياكل الحبيبية التحت خلوية كبيرة إلى حبيبات أصغر وأكثر تحديدا، اس جي اس، وبعد العلاج الزرنيخ. SGS كانوا أكثر وأكثر تحديدا إذا استمرت عمليات الاستحواذ (لا يظهر) ولكن بدأت التشكل خلية للتغيير، وربما يرجع ذلك إلى الحرارة والسمية الناجمة عن الإثارة الليزر.

الفاصل الزمني يسمح التقاط شريط فيديو لمراقبة مباشرة ديناميات SGS. وعلاوة على ذلك، واستخدام المجهر متحد البؤر يسمح لإعادة بناء صورة في Z المكدس وبالتالي لمتابعة تماما ديناميات الهيئات في جميع أنحاء الخلية في 3 أبعاد (كما هو موضح لالخلايا العصبية في وقت المحدد في الشكل 4B).

الشكل 1
الشكل 1. وصفية من الخطوات الرئيسية للبروتوكول. الخلايا الأولية هي مثقفمن الأجنة (18.5 DPC (أيام تال للجماع) (أو الجراء حديثي الولادة) عن الخلايا العصبية (أ)، 13.5 DPC لMEFs (ب)). بعد ترنسفكأيشن من البلازميد التي تحتوي على EGFP-G3BP1 [كدنا]، وشدد الخلايا والمصورة مع مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر. لوحظ ديناميات SGS التي تحتوي على G3BP1. وتصور الخلايا العصبية التي كتبها MAP2 (أنيبيب المرتبطة بروتين 2) تلطيخ في (أ)، MEFs بواسطة G3BP1 تلطيخ في (ب). التي تقدم لهم من الصور التوضيحية، وكذلك EGFP-G3BP1 transfected الخلايا العصبية الفئران (ج) والخلايا الليفية (د)، والتي هي مستقلة والصور لا تتوافق مع الخلايا الواردة في (أ) و (ب).

الرقم 2
الشكل 2 (أ). G3BP التعريب في MEFs مثقف والخلايا العصبية قرن آمون، أو غير المعالجة شدد مع الزرنيخ الصوديوم. G3BP هو أساسا حشوية، مع تلطيخ منتشر في MEFs (أ) أو في الهياكل الحبيبية الكبيرة في سوما من الخلايا العصبية (ج) عندما لا يتم شدد على الخلايا. بعد 1 ساعة من الصوديوم علاج الزرنيخ، G3BP يصبح المترجمة في حبيبات منفصلة هيولي (MEFs، ب والخلايا العصبية، د). هنا، تم إصلاح الخلايا وimmunostained مع الأضداد المضادة للG3BP1. تصاريح MAP2 تلطيخ لتحديد الخلايا العصبية في ج) و د). كانت ملطخة مكافحة الحمض النووي في الزرقاء مع هويشت. أشرطة النطاق تمثل 2 ميكرومتر (أ و ب) و 10 ميكرون (ج و د). (B). عندما رفع من ذيله نحو الأرض (اختبار الشبك أطرافهم)، الفئران WT تمديد أرجلهم (يسار) في حين تظهر الفئران G3BP1 KO-الشبك ومخلب الشاذ المنعكس على مقربة من وضعية تشبه الخفافيش. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

fig3highres.jpg "العرض =" 500 "/>
الرقم 3. الاستحواذ متتالية في تجربة الوقت الفاصل بين الحصول عليها مع MEFs transfected مع EGFP-G3BP1، وذلك باستخدام المجهر متحد البؤر المسح بالليزر لايكا SP5 (الإثارة في الطول الموجي من 488 نانومتر). وقد بدأت عمليات الاستحواذ 10 دقيقة بعد إضافة الزرنيخ الصوديوم، والتي تم الحصول عليها خلال 10 دقيقة مع فترات من 20 ثانية. وترد ست صور ممثل، مع تي مرة ثانية في بعد إضافة الزرنيخ الصوديوم (0.5 ملم). تظهر الأسهم مجالين حيث يمكننا أن نرى تجميع SGS. شريط النطاق = 2 ميكرون.

الرقم 4
الشكل 4. (A). الاستحواذ على التوالي في تجربة الوقت الفاصل بين الحصول عليها مع الخلايا العصبية قرن آمون الفئران transfected مع EGFP-G3BP1، وذلك باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهر لايكا SP5 (الإثارةفي طول موجة من 488 نانومتر). وقد بدأت عمليات الاستحواذ 5 دقائق بعد إضافة الزرنيخ الصوديوم، والتي تم الحصول عليها خلال 40 دقيقة مع فترات من 20 ثانية. وترد ست صور ممثل، مع تي مرة ثانية في بعد إضافة الزرنيخ الصوديوم (0.5 ملم). تظهر الأسهم مجالين حيث يمكننا أن نرى تجميع SGS. يمثل شريط النطاق 5 ميكرون د: التغصنات؛ و: محور عصبي. (B). إعادة الإعمار 3-Z البعد من المكدس (5 الاستحواذ في محور Z على ما مجموعه 10 ميكرون) من الخلايا العصبية transfected مع EGFP-G3BP1 وتعامل مع الزرنيخ الصوديوم ن:. محوار (التغصنات أو محور عصبي). الرجاء انقر هنا لعرض أكبر نسخة من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

الخطوات الأكثر أهمية في قلق بروتوكول ترنسفكأيشن وأكثر من ذلك وخاصة عمليات الاستحواذ الفاصل الزمني، والتي يجب مراقبتها بعناية من أجل خفض أسفل السمسة.

ثقافة الخلايا الأولية ليس الجزء الصعب، طالما يتم الحفاظ على ظروف معقمة ويتم أخذ الحذر من أجل منع الضرر أثناء تشريح والتفكك الخلية الخطوات. MEFs يمكن أن تظل مجمدة في الممرات في وقت مبكر. وقد تبين عصبون ترنسفكأيشن مع فوسفات الكالسيوم للعمل بشكل جيد وهذا البروتوكول 21 مقتبس من شيا وآخرون 20 تمكن مستوى جيد من ترنسفكأيشن، ومع ذلك فإنه يمكن أن تحفز على موت الخلايا معينة. من المهم أن بالنقل الخلايا العصبية في غضون أيام قليلة بعد الثقافة، للتحقق من الرقم الهيدروجيني للحلول ورصد الحضانة من الخلايا العصبية مع فوسفات الكالسيوم البلازميد راسب، والتي يجب أن لا تتجاوز 1 ساعة. تحقق تحت المجهر الخفيفة وإزالة ترانsfection المتوسطة إذا لوحظ المجاميع. ويمكن زيادة عدد يغسل مع DMEM.

وعلى التعبير عن بعض مكونات البروتين اس جي اس يؤدي إلى التجمع العفوي للحبيبات، والذي يبدو لإشراك oligomerization والحمض النووي الريبي خصائص هذه البروتينات ملزمة، كما في حالة TIA-1 / R 4 أو 5 G3BP. وبالتالي، فمن المهم تحديد الوقت الذي يمكنك أن تبدأ عمليات الاستحواذ مرور الوقت. وهناك عدد قليل SGS مرئية في أقرب وقت 24 ساعة بعد EGFP-G3BP ترنسفكأيشن، عندما يتم التعبير عن هذا البروتين. ومع ذلك، الأمر الذي أدى إلى ضغط إضافي يؤدي إلى تشكيل حبيبات إضافية، والتي قد تختلف أنواع مختلفة من SGS مع المكونات الأساسية المختلفة تم تحديدها تحت الضغوط المختلفة 1،22،23. جمعية SGS سريع في الخلايا الحية (بأسرع 10-20 دقيقة)، وتتشكل العديد من حبيبات تماما في غضون 1 ساعة من العلاج الزرنيخ، فمن المهم بالتالي لبدء عمليات الاستحواذ في أقرب وقت ممكن الخلفإيه تحريض الإجهاد إذا كان التجمع لابد من دراستها. في مراحل لاحقة ومع ذلك، فإن ديناميات SGS كما يمكن دراستها، كما حبيبات صغيرة يمكن أن تتجمع في الهياكل الأكبر حجما، ليست ثابتة وهذه الهياكل: مكوناتها يمكن تبادلها مع السيتوبلازم أو أنواع أخرى من حبيبات مثل P-الهيئات والمواقع تسوس RNA 3. العين السريعة، الكشف عن الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل والرصد السريع للالمعلمات الاستحواذ (وخاصة X، Y، Z وإحداثيات) تسمح للحصول على الفيلم بما في ذلك تجميع حبيبات، وكذلك للحد من photobleaching من والليزر التي يسببها السمسة، والذي هو الآخر خطوة حاسمة في مجال التصوير الحية. في الواقع، في بعض الحالات، يمكن أن نلاحظ تغييرات هامة في التشكل الخلية وحتى وفاة عدد قليل من الخلايا، إذا تم تنفيذ عمليات الاستحواذ لفترة طويلة (أكثر من 1 ساعة بعد تحريض من الإجهاد oxydative مع العلاج الزرنيخ). من أجل منع هذه الظواهر، فمن الممكن لربط الفحص وزيادة فتراتالمدة بين كل الاستحواذ. ومع ذلك، أقصر فاصل تصاريح لمتابعة أفضل للديناميات SGS التي تحتوي على البروتين تصور، والحصول على الفيلم أكثر اكتمالا. وبالتالي، ينبغي للمرء أن تتكيف مع المعلمات إلى كل تجربة للحصول على أفضل فيلم مع photobleaching من محدودة وسمية، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا الأولية، على المكون الحبيبية والذي يليه، وعلى جزيء fluorophore المرتبطة بها.

به بروتين فلوري وعادة ما تكون صامد بما فيه الكفاية ليمكن تصوير لمدة التجربة. يمكن أن البروتينات الفلورية مختلفة تعمل بشكل جيد، طالما أنها تنتج إشارة قوية، بطيئة لتبييض وغير سام. الأهم من ذلك، ينبغي أن تكون مشرقة بما فيه الكفاية من أجل إعطاء إشارة فوق تألق ذاتي للخلايا وبالتالي يتم يتم الكشف بشكل موثوق به. في الواقع، يمكن أن الخلايا الأولية لحث على إشارة الخلفية بسبب تألق ذاتي من العضيات (مثل الميتوكوندريا والجسيمات الحالة). ولكن في أيدينا، وكان تألق ذاتيمنخفضة جدا بالمقارنة مع سطوع EGFP-G3BP، وكان من السهل التمييز بين إشارة EGFP من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل مقابل الخلايا لا transfected. عموما، فإن اختيار مرشحات الأمثل ومستويات كثافة ضوء الليزر ستكون حاسمة للحصول على الحق نسبة الإشارة إلى الضوضاء، والمرتبطة سمية منخفضة. أخيرا، إذا كان لديك صور لدراستها من الناحية الكمية، من المهم أن تتأكد من أن كثافة مضان من البروتين ليست حساسة لعوامل بيئية مثل مكونات ثقافة المتوسط.

يمكن في الواقع ديناميات SGS يمكن مقارنة (سرعة التجمع وحجم وعدد من حبيبات) بين ظروف مختلفة (الخلايا من النوع البري والحيوانات خروج المغلوب على سبيل المثال). من أجل الحصول على نتائج ذات دلالة إحصائية، واحدة ينبغي خلايا الثقافة من ثلاثة على الأقل من الحيوانات المختلفة من كل راثى أو شرط (من ثلاث ليترات مختلفة)، والصورة ما بين 10 و 50 خلايا في كل تجربة مستقلة. فمن الممكن للاحتفال العديد من المناصبفي البرنامج، وبالتالي الاستحواذ على الصور عدة الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل في نفس الوقت، مما يسمح لزيادة البيانات التي تم الحصول عليها في وقت قصير نسبيا. التصوير عدة خلايا في وقت واحد مثير للاهتمام لأنه سيكون من الصعب مواصلة استخدام نفس طبق بيتري مرة واحدة وشدد على الخلايا وتصويرها (في الحالات التي يتم دراستها تجميع اس جي اس، أو إذا كانت الظروف التجريبية في الاستحواذ طويلة لحث السمسة). ومع ذلك، عند قياس المعلمات "رقم" و "حجم" اس جي اس - ومن أجل زيادة عدد الخلايا المصورة للحصول على مزيد من أهمية إحصائية (أكثر من 50 خلايا لكل فرد) - الخلايا يمكن ان تكون ثابتة بعد العلاج الزرنيخ، لذلك أن أكثر الخلايا على نفس طبق بيتري يمكن دراستها. ستظل تستخدم أشرطة الفيديو والنتائج النوعية في هذه الحالة.

بروتوكول الموصوفة هنا يسمح للدراسة التي تحتوي على G3BP SGS في الخلايا الحية الأولية، ويمكن أن تتكيف مع الهيئات الخلوية الأخرى وغيرها من شركات البروتينonents من هذه الهيئات (مثل TIA-1 / R لاس جي اس، FRMP وستاوفن لSGS وحبيبات النقل العصبية). استخدام الخلايا الأساسي هو اهتمام بوجه خاص في سياق الدراسات الفسيولوجية، والتي تنطوي على سبيل المثال الحيوانات المعدلة وراثيا. في الواقع، الفئران G3BP1 KO تكشف على سبيل المثال وظيفة أساسية من عامل اس جي اس في البقاء والنمو للكائن الحي، وكذلك في الجهاز العصبي المركزي يعمل 14،15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

فإن الكتاب أود أن أنوه مونبلييه ريو التصوير (MRI) منصة حيث أجريت عمليات الاستحواذ. أنها أشكر إيزابيل كريستينا لوبيز ميخيا، الكسندرا ميتز، إيرينا Lassot، صولانج Desagher، فابيان Loustalot، وفيرجيني جورجيت لمساعدتهم في أجزاء مختلفة من البروتوكول. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة بحوث صب لا MEDICALE (FRM) (إيكيب FRM 2011-N ° DEQ20111223745).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 Gibco 21331 Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate Gibco 11360
Nonessential amino acids Gibco 11140
L-Glutamine Gibco 25030
Trypsin Gibco 15096
Glass bottom B-35 Greiner 627860/627861 Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine Sigma-Aldrich P2636
DMEM Gibco 31966 Prewarm at 37 °C
HeBS Sigma-Aldrich 51558
Neurobasal Gibco 21103 Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol Gibco 31350
Forceps Biotek DU-110-A Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps Biotek P-110-BUF Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors Biotek CM-85-BS Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent  Ozyme 101-10 MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope Leica SP5

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
  2. Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
  3. Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
  4. Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
  5. Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
  6. Parker, F., et al. A Ras-GTPase-activating protein SH3-domain-binding protein. Molecular and Cellular Biology. 16 (6), 2561-2569 (1996).
  7. Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
  8. Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
  9. Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
  10. Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
  11. Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
  12. Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
  13. Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
  14. Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
  15. Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
  16. Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
  17. Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
  18. Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
  19. Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
  20. Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
  21. Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
  22. Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
  23. Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).

Tags

علم الأحياء الخلوية، العدد 87، الحبيبية الإجهاد (SG)، G3BP والخلايا الأساسية، الخلايا العصبية
تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Martin, S., Tazi, J. Visualization… More

Martin, S., Tazi, J. Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells. J. Vis. Exp. (87), e51197, doi:10.3791/51197 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter