Summary
Stress korrels (SG) zijn cytoplasmatische RNA korrels die geïnstalleerd ribonucleoproteïnepartikels (RNP), en belangrijk in cellulaire reactie op diverse spanningen. Dynamiek van SG's kunnen in levende cellen worden gevolgd door het visualiseren van de lokalisatie van een gelabeld onderdeel van SG in getransfecteerde primaire cellen na stress.
Abstract
SG kan in cellen worden gevisualiseerd door immunokleuring specifieke eiwitcomponenten of polyA + mRNA. SG zeer dynamisch en de studie van hun assemblage en lot is belangrijk om de cellulaire respons op stress te begrijpen. Het tekort in de belangrijkste factoren van de SG's zoals G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) leidt tot defecten in de ontwikkeling bij muizen en veranderingen van het centrale zenuwstelsel. Om de dynamiek van de SG's bestuderen in cellen van een organisme, kan men cultuur primaire cellen en volg de lokalisatie van een getransfecteerde gelabeld onderdeel van SGS. We beschrijven time-lapse experiment om-G3BP1 bevattende SGs in muis embryonale fibroblasten (MEF) observeren. Deze techniek kan ook worden gebruikt om G3BP bevattende SG bestuderen levende neuronen, wat cruciaal zoals onlangs aangetoond dat deze SG gevormd bij het begin van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer. Deze benadering kan worden aangepast aan andere cellulaire lichaam en granule eiwitcomponent en uitgevoerdtransgene dieren, waarbij de levende studie korrels dynamiek bijvoorbeeld bij gebrek aan een specifieke factor van deze korrels.
Introduction
Stress korrels (SG) niet-membraneuze cytoplasmatische foci gevormd als een beschermende cellulaire reactie op omgevingsstress, zoals verhoogde temperatuur, oxidatieve stress, hypoxie, osmotische schok, UV-bestraling, glucose deprivatie of virale infectie 1. Ze kunnen chemisch worden geïnduceerd door behandeling met verbindingen zoals natriumarseniet, die oxidatieve stress veroorzaakt. SG's accumuleren vastgelopen vertaling gearresteerd boodschapper ribonucleoproteïne (mRNPs) complexen 2, sequestering mRNA's van de translationele machines, en de montage kan worden geactiveerd door de fosforylering van eIF2α (eukaryote initiatie factor 2 α). SG zijn dynamische structuren die componenten wisselen met polysomen en andere granulaten zoals de P-organen. Zij vormen een "triage center" waar mRNA's worden gesorteerd en verwerkt voor een van beide vertalingen, een herstart, degradatie of verpakking in stabiele niet-polysomal mRNPs 3. De assemblage van de SG's is snel but het is een geleidelijk proces met initiële talrijke kleine aggregaten die samenvloeien tot grotere korrels. Het gebruik van chemische inhibitoren die verstoren of microtubuli stabiliseren blijkt dat het microtubule netwerk vereist SG dynamiek inbegrip van assemblage, coalescentie en demontage processen.
De dynamische samenstel van SG wordt ook bevorderd door aggregatie van specifieke RNA-bindende eiwitten (RNA-BP) zoals TIA-1 (T-cel intern antigeen-1) en TIAR (TIA-1 verwant eiwit), die kunnen dimeriseren zijn en het bevorderen van polysome demontage en de routering van mRNA's in SG 4. G3BP (RasGAP SH3 domein bindend eiwit) is zo'n RNA-BP dat lokaliseert SGS wanneer cellen worden benadrukt met arseniet en hoge temperatuur, en overexpressie van gedefosforyleerd G3BP kan SGs assemblage 5 induceren.
G3BP is een evolutionair geconserveerd RNA-BP dat in eerste instantie werd gekenmerkt door de interactie met een Ras-GTPase activerend eiwit (RasGAP p120 6); maar deze interactie is onlangs revisited 7. De familie G3BP omvat twee leden bij zoogdieren, G3BP1 (hierna G3BP) en G3BP2 8. Beide eiwitten colocalize in SG, wanneer cellen worden blootgesteld aan spanning 9. G3BPs omvatten een N-eindstandig domein NTf2 voorgesteld hun lokalisatie en oligomerisatie, gevolgd door proline rijke (PxxP) motieven beïnvloeden, dan C-eindstandige motieven geassocieerd met RNA binding: de canonieke RNA-herkenningsmotief (RRM) met behouden RNP1 en RNP2 motieven , gevolgd door een rijke box arginine-glycine (RGG). Interessant is dat de analyse van verschillende delen van het eiwit door het construeren verschillende domeinen gefuseerd met EGFP bleek dat de NTf2-achtige domein en de RNA-bindende domein zijn de meest efficiënte gerekruteerd SG, Dit suggereert dat de eigenschappen van dimerisatie en RNA binding in de assemblage van SGS. Diverse modellen hebben verschillende functies van G3BP eiwitten bleek in vitro 10-13.Verstoring van G3BP in muizen hebben het belang van dit eiwit in de ontwikkeling groei en overleving 14, evenals een belangrijke rol G3BP in het centrale zenuwstelsel (CZS), gekenmerkt door ataxie en gebreken in ruimtelijk werkgeheugen 15. G3BP deficiëntie leidt tot een gewijzigde neuronale plasticiteit en calcium homeostase, tot oprichting van een rechtstreeks verband tussen SG vorming en neurodegeneratieve ziekten 15. Het is dus belangrijk om de dynamiek van SG in primaire cellen zoals neuronen te bestuderen.
Dit protocol biedt een eenvoudige manier om de assemblage van-G3BP1 bevattende SGs observeren in primaire cellen onder arseniet behandeling. Het kan worden gebruikt om SG montage bestuderen onder verschillende omstandigheden, bijvoorbeeld verschillende spanningen. Het kan ook worden aangepast aan andere korrels of andere bestanddelen van SG. Inderdaad, dit protocol gericht op G3BP1, maar er zijn andere stress granulaat merker TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) 2,FMRP (Fragiele X mentale retardatie syndroom eiwit) 16, TDP-43 (transactieve reactie DNA-bindend eiwit 43) 17 of Staufen 18. In het bijzonder eiwitten zoals TIA-1 / R zijn zoals G3BP, kiemvormende RNA-bindende eiwitten die SG samenstel kan induceren wanneer tot overexpressie gebracht, hebben de diverse gevormde SG kunnen verschillen in functie, regulering en geassocieerde transcripten. Transfectie van fluorofoor gelabeld versie van een van deze belangrijke componenten of kiemvormers van SG's kunnen worden uitgevoerd om bepaalde beeld SGs assemblage en dynamiek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierlijke procedures in dit protocol de in strikte naleving van de richtlijnen van de richtlijn Europese Gemeenschap van de Raad van 24 november 1986 (86-609/EEC). Het huis van de muizen in de groep, waardoor voedsel en water ad libitum. Behouden ze in een gecontroleerde omgeving (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% vocht) met een 12 uur: 12 uur licht: donker cyclus (licht aan om 7.00 uur).
1 Cultuur van Muriene primaire cellen:. Muis embryonale fibroblasten (MEF)
- Autoclaaf dunne tang, evenals gebogen tang en dissectieschaar. Bewaren in een steriele container. Gebruik steriele D-PBS (Dulbecco's fosfaat-gebufferde zoutoplossing). Bereid volledige MEF medium: Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) / F12 gesupplementeerd met 10% foetaal kalfsserum (FBS), 1 mM L-glutamine, 1 mM natriumpyruvaat, 1% niet-essentiële aminozuren, en 0,5 mM 2-mercaptoethanol en warm bij 37 ° C.
- Euthanaseren een zwangere muis (13,5 dagen na de coïtus (dpc)) Door cervicale dislocatie. Verwijder de baarmoederhoorns van de muis ontsmet met 90% EtOH. Onder een steriele en schone kap, plaats de hoorns met de embryo's in 37 ° C voorverwarmde D-PBS. Open de horens, plaats de embryo's in een 100 mm steriele plastic petrischaal, schoon ze uit de navelstreng materiaal en was ze in warm D-PBS om bloed overtollige te verwijderen. Onder een verrekijker, verwijder de embryo's ledematen, de inwendige organen en het bovenste deel van het hoofd met de hersenen.
- In een nieuwe petrischaal, gehakt de embryo's in kleine stukjes met een steriele chirurgische mes of schaar (tenminste gedurende 1 min). In het geval van embryo's van verschillende genotypen, wees voorzichtig om elk embryo in individuele petrischaaltjes zetten en houden de staart of de bovenste kop voor genotypering.
- Bedek het embryo met 1 x trypsine-EDTA (0,25% trypsine, 1 mM EDTA). Incubeer gedurende 30 min tot 1 uur in een 37 ° C incubator. Voeg 10 ml compleetMEF medium tot trypsine reactie te stoppen. Pipet op en neer om alle aggregaten te verwijderen. Laat zitten de celsuspensie in een 50 ml buisje (gevuld met compleet medium) gedurende 10 min, en het supernatant gecentrifugeerd gedurende 5 minuten bij 300 g bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in compleet medium (6 ml voor 1 embryo). Levensvatbare cellen met kernen te tellen met behulp van trypan blauw (Ongeveer 5 x 10 6 cellen kunnen worden verwacht van een embryo). Plaat 3 ml per 60 mm petrischaal.
- Verander het medium de volgende dag en laat de cellen groeien totdat de gerechten worden confluent. Veel celtypen te zien, maar alleen fibroblasten zal subcultuur overleven.
- Splits de cellen en hen in staat stellen om te groeien in 35 mm schalen met glazen bodem (belangrijk voor time-lapse experiment), tot 50-70% confluentie voor de transfectie. Test voor Mycoplasma en muis ziekteverwekkers.
2. Cultuurdaptations in de zaak van Neuronen
- De dag voor de cultuur, vacht 35 mm glazen bodem petrischaaltjes met poly-L-lysine (200 pl van 0,1 mg / ml) onder een steriele en schone kap, en laat het een nacht.
- De volgende morgen, spoelen met steriel zuiver water, tweemaal gedurende 5 min en eenmaal gedurende 45 minuten tot 1 uur. Vervang 2 ml DMEM plus 10% FBS medium en in een 37 ° C incubator houden.
- Ontleden embryo's in 18.5 dpc. Onder een steriele en schone kap, plaats de hoorns met de embryo's in koude steriele HBSS (Hank's gebalanceerde zoutoplossing) in 100 mm petrischaal. Neonatale pups kan ook in plaats van embryo's worden gebruikt om de levensduur van de dam behouden en in staat om meer nageslacht, vooral in het geval van transgene dieren die moeilijk te verkrijgen zijn. In individuele petrischaaltjes, nemen elk embryo of pasgeboren en snijd het hoofd met een schaar. Houd het hoofd door het invoegen van gebogen pincet in de ogen, snijd de huid en open voorzichtig de zachte schedel van de achterkantvan de kop tot de ogen, aan elke kant van de weg. Snijd de oogzenuwen en de hersenstam, verwijder de hersenen, en zet het in een nieuwe petrischaal met HBSS. Onder een stereoscoop, verwijder alle hersenvliezen met twee dunne tang. Scheid de hippocampus, de cortex of een ander deel van de hersenen afhankelijk van de structuur te bestuderen.
- Dompel de ontleed hersenstructuur in 4,5 ml koud HBSS eerder bereid in 15 ml buizen en blijf op ijs tot digestie met trypsine. Voeg 0,5 ml 2,5% trypsine en incubeer bij 37 ° C gedurende 15 min tot 20 min. Spoel de trypsine 3x met HBSS, uiterst voorzichtig om de verteerde hersendelen niet weg.
- Resuspendeer in 500 pl (hippocampus) 1 ml (cortex) DMEM met 10% FBS en pipet op en neer meerdere malen met een 1 ml micropipet met een 1 ml tip, vervolgens met 1 ml plus 200 ul tips, totdat er geen zichtbare aggregaat.
- Verdeel 100-200 ul van celsuspensie aan elk 35 mm glas bottom schaaltje met DMEM met 10% FBS en laat de neuronen hechten bij 37 ° C gedurende ten minste 3 uur. Vervangen door voorverwarmd neuron compleet medium (Neurobasal medium aangevuld met 250 uM L-glutamine en NS21, bereid zoals beschreven in Chen et al.. 19) en verlaat deze bij 37 ° C neuronale groei mogelijk. Transfecteren de neuronen bij 5 tot 14 dagen in vitro (div) (de efficiëntie van transfectie hoger na een paar div maar synaptische verbindingen beter vastgesteld van 7-10 div).
3. Transfectie van EGFP-G3BP1 Construct
Transfecteren van de cellen met een vector die het cDNA van het eiwit van interesse (een onderdeel van SG) gefuseerd aan een fluorescente merker (GFP, YFP, enz.), met 3 ug van gezuiverd plasmide per 35 mm schaal.
- Transfecteren de MEF met een commerciële methode, volgens het protocol van de fabrikant (zie tabel van materialen / Reagentia).
- Transfecteren de neuronen met calciumfosfaat methode aangepast van Xia et al. 20 kort.:
- Bereid de oplossingen: DMEM-wash: DMEM met 25 mM KCl; transfectieoplossing: DMEM-wash bestaande uit 1x DMKY (HEPES 5 mM, MgCl2 10 mM, fenol rood); en shock oplossing: HeBS 1x, DMKY 1x, en DMSO 2% (v / v); en houd ze bij 37 ° C.
- Verwijder het papier uit de neuronen, filtraat, en houd het bij 37 ° C. Wassen met DMEM-wash vervolgens te vervangen door transfectiemedium en houden bij 37 ° C tijdens de voorbereiding van de calciumfosfaat-plasmide-DNA neerslagen.
- In een 1,5 ml microcentrifugebuis, voegen (in deze volgorde) Braun water (eindvolume 50 pl), 5 ul 2,5 M CaCl2, en 3 ug plasmide DNA. Laat dit mengsel op 50 pi 2x HeBS reeds een ronde bodem polypropyleen buis geïntroduceerd. Meng de buis door de rotatie samen met de dropping. Laat het neerslag vorm bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- Voeg de precipitate druppelsgewijs op de neuronen en verlaat deze bij 37 ° C gedurende 30 tot 50 minuten.
- Vervang shock oplossing gedurende 1 minuut en spoel na met DMEM-wash en tenslotte opnieuw het geconditioneerd medium. Laat de cellen bij 37 ° C.
4. Visualisatie van G3BP bevattende SG's Vergadering en Dynamics
- Vervang het medium van de cellen die fenolrood bevat met fenolrood-vrij medium.
- Gebruik een confocale microscoop uitgerust met fluorescentie voor de acquisities. Zet de microscoop systemen: kwiklamp, computer, en lasers. Warmen de kamer tot 37 ° C ten minste 20 minuten vóór het begin van de acquisities.
- De overexpressie van G3BP induceert de spontane vorming van een type SGS. De cellen kunnen dus worden waargenomen voor de montage van SG 24 uur direct na de transfectie zonder stressinductie. Als alternatief, kan stress worden veroorzaakt aan de montage van SG's verder te induceren. Voeg 0,5 mM natriumarseniet en stert de acquisitie direct na de toevoeging van de verbinding (granules goed gevormd binnen 1 uur).
- Olie toe te voegen aan de immersie-objectief (gebruik 40X of 63X doelstellingen) en installeer de petrischaal op het streven in de aangepaste 35 mm microscoop houder, gestabiliseerd op het podium houder. Controleer of het gerecht is plat anders de acquisities zal worden gewijzigd. Zet de fluorescentie licht overeenkomstig de desbetreffende fluorophore en visualiseren getransfecteerde cellen. Schakel fluorescentie eens een cel van belang is in het veld in om te bleken en cytotoxiciteit te minimaliseren.
- In het "verwerven tabblad", selecteer de lasers, afhankelijk van de golflengte van de tag fluorofoor (488 nm in ons protocol waarin EGFP-tagged G3BP gebruikt) en selecteer de aangepaste emissie lengte voor de PMT (fotomultiplicatorbuis). Stel het laservermogen (gewoonlijk niet meer dan 10%) om ruis en oververzadiging en toxiciteit te minimaliseren en stel de versterking en offset signaal wijzigen ruisverhouding.Scan snel (1000 Hz) om de duur van de laser expositie (lijn gemiddeld 2, kader gemiddeld 1) te minimaliseren. Indien gewenst, de parameters voor de Z-stack kunnen de afbeelding in 3D (een Z stap 1 urn is gewoonlijk goed met cellen) te reconstrueren. Bepaal het interval tussen elke verwerving: kleiner tussenpozen, tot een coherente film te vinden, maar kan fotobleken en toxiciteit (een interval van 20 seconden werd gebruikt in de experimenten beschreven) induceren. Duur van de totale aankoopprijs kan variëren afhankelijk van het type stress. Veel-G3BP bevattende SGs zeer snel gevormd onder arseniet behandeling en goed zichtbaar zijn na 1 uur van de behandeling: in dat geval kiest u snel de cellen om te filmen en start de acquisities direct na de stress, met een totale duur van acquisities van 15 - 20 min ruim voldoende om de assemblage van verschillende SG's te observeren.
- Sla de foto's en reconstrueren de stacks en film met ImageJ software.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stress granulevorming is belangrijk in de respons van cellen op stress, waardoor een cellulaire adaptatie bij geblokkeerde vertaling, totdat de spanning is verdwenen, geassocieerd met het voorkomen van apoptose. Deze test maakt het mogelijk de SG primaire cellen te bestuderen, door de lokalisatie van SG belangrijkste eiwitbestanddelen (figuur 1). G3BP, een belangrijke factor SG samenstel, aanwezig tamelijk diffuus in het cytoplasma van MEF gekweekte neuronen (Figuur 2A a en c) en duidelijk aanwezig in discrete korrels onder arseniet behandeling MEFs en neuronen (figuur 2A en B d). Primaire cellen kunnen worden verkregen uit transgene muismodellen, waardoor bijvoorbeeld de studie van stress korrels in afwezigheid van een van de onderdelen. Interessant tekort aan G3BP1 in muizen leidt tot ernstige afwijkingen van het centrale zenuwstelsel, met name een atactisch phenotype gekenmerkt door onvermogen te kunnen coördineren van de bewegingen (zoals te zien in een ledemaat clasping test, Figuur 2B) en een wijziging van het ruimtelijk werkgeheugen. G3BP1 aanwezig stress korrels in neuronen, en dit is des te interessanter SGS is aangetoond te vormen bij het begin van neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer.
Deze assay (figuur 1) aldus toelaat SGS in primaire cellen, onmisbaar samenstelling en assemblage in in vivo. Bovendien maakt de studie van levende cellen en kan dus worden gebruikt om de dynamiek van SG volgen door visualiseren een of meer van hun overexpressie componenten in real time. Figuur 3 toont representatieve time-lapse beelden mogelijk maakt de montage en dynamiek follow -G3BP1 bevattende SGs in MEF na arseniet behandeling. In figuur 4A, is hetzelfde experiment uitgevoerd met muizen hippocampale neuronen cultUre. EGFP-G3BP1 lokalisatie gaat van grote subcellular granulaire structuren om meer gedefinieerde en kleinere korrels, de SGS, na arseniet behandeling. SG werden steeds gedefinieerd als de verwervingen voortgezet (niet getoond), maar de cel morfologie begon te veranderen, waarschijnlijk door de hitte en toxiciteit geïnduceerd door de laser excitatie.
Time lapse maakt het vastleggen van een video naar de SGS dynamiek direct waar te nemen. Bovendien is het gebruik van een confocale microscoop maakt een beeld te reconstrueren Z stack en aldus volledig de dynamiek van het lichaam volgen door de cel in 3 dimensies (zoals geïllustreerd voor een neuron op een bepaald moment in fig. 4B).
Figuur 1. Beschrijving van de belangrijkste stappen van het protocol. Primaire cellen worden gekweektuit embryo (18,5 dpc (dagen na coïtus) (of neonatale pups) voor neuronen (a), 13,5 DPC voor MEF (b)). Na transfectie van een plasmide dat EGFP-G3BP1 cDNA worden cellen gestresst en belicht met een laser scanning confocale microscoop. Dynamiek van G3BP1 met SG's worden waargenomen. Neuronen worden gevisualiseerd door MAP2 (microtubuli geassocieerd proteïne 2) kleuring in (a), MEF door G3BP1 kleuring in (b). Zij worden als illustratief beelden, evenals EGFP-getransfecteerde muizen G3BP1 neuron (c) en fibroblast (d), die onafhankelijk afbeeldingen zijn en niet overeenkomen met de cellen die in (a) en (b).
Figuur 2. (A). G3BP lokalisatie in gekweekte MEF en hippocampale neuronen, onbehandeld of benadrukt met natriumarseniet. G3BP is vooral cytoplasma, met een diffuse kleuring in MEF (a) of in grote granulaire structuren in de soma van neuronen (c) wanneer de cellen niet gestresst. Na 1 uur natriumarseniet behandeling wordt G3BP gelokaliseerd in afzonderlijke cytoplasmatische korrels (MEFs, b en neuronen, d). Hier werden de cellen gefixeerd en immunologisch gekleurd met een anti-G3BP1 antilichaam. MAP2 kleuring toelaat om neuronen te identificeren c) en d). DNA werd contra-gekleurd in blauw met Hoechst. Schaalbalken vertegenwoordigen 2 urn (a en b) en 10 urn (c en d). (B). Wanneer opgetild door de staart naar de vloer (ledematen clasping test), WT muizen breiden hun benen (links) terwijl G3BP1 KO muizen vertonen een abnormale-poot omklemde reflex dicht bij een vleermuis-achtige houding. Klik hier om een grotere versie te bekijken van dit cijfer.
fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figuur 3. Opeenvolgende acquisities tijdsverloop experiment verkrijgbaar MEFs getransfecteerd met EGFP-G3BP1, met een Leica SP5 confocale laser scanning microscoop (excitatie bij een golflengte van 488 nm). Acquisities zijn gestart 10 minuten na de toevoeging van natriumarseniet, en verkregen gedurende 10 min met tussenpozen van 20 sec. Zes representatieve beelden worden gegeven, met t de tijd in seconden na de toevoeging van natriumarseniet (0,5 mM). De pijlen tonen twee gebieden waar we de assemblage van SG's kunt zien. Schaal bar = 2 micrometer.
Figuur 4. (A). Opeenvolgende overnames in time-lapse experiment verkregen met muizen hippocampusneuronen getransfecteerd met EGFP-G3BP1, met behulp van een Leica SP5 confocale laser scanning microscoop (excitatiebij een golflengte van 488 nm). Acquisities zijn gestart 5 minuten na de toevoeging van natriumarseniet, en verkregen tijdens 40 min met tussenpozen van 20 sec. Zes representatieve beelden worden gegeven, met t de tijd in seconden na de toevoeging van natriumarseniet (0,5 mM). De pijlen tonen twee gebieden waar we de assemblage van SG's kunt zien. Schaalbalk vertegenwoordigt 5 micrometer d:. Dendriet; a: axon. (B). 3-dimensionale reconstructie van Z-stack (5 overnames in Z-as over een totaal van 10 micrometer) van een neuron getransfecteerd met EGFP-G3BP1 en behandeld met natriumarseniet n:. Neuriet (dendriet of axon). Klik hier voor een grotere weergave versie van deze figuur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De meest kritische stappen in het protocol betreffen de transfectie en meer in het bijzonder de time lapse overnames, die moeten zorgvuldig worden gevolgd om lager op de cytotoxiciteit.
Kweek van primaire cellen is niet een moeilijke deel, mits steriele omstandigheden worden gehandhaafd en voorzichtigheid is genomen om schade tijdens de dissectie en celdissociatie stappen voorkomen. MEF kan op vroege passages bevroren bewaard. Neuron transfectie met calciumfosfaat is aangetoond goed te werken 21 en het protocol aangepast van Xia et al.. 20 kunnen goed niveau van transfectie, maar het kan een zekere celdood. Het is belangrijk om de neuronen binnen enkele dagen na de kweek te transfecteren, om de pH van de oplossingen controleren en de incubatie van de neuronen met de calciumfosfaat-plasmide precipitaat, dat minder dan 1 uur volgen. Controleer onder een lichtmicroscoop en verwijder de transfection medium als aggregaten worden waargenomen. Het aantal wassingen met DMEM worden verhoogd.
De overexpressie van bepaalde SG eiwitcomponenten leidt tot de spontane assemblage van granules, die lijkt op de oligomerisatie en RNA-bindende eigenschappen van deze eiwitten, zoals bij TIA-1 / R4 of G3BP 5 omvatten. Zo is het belangrijk om het tijdstip waarop u de time lapse overnames beginnen definiëren. Enkele SG zichtbaar zodra 24 uur na EGFP-G3BP transfectie, wanneer het eiwit tot expressie wordt gebracht. Echter, induceren een extra belasting leidt tot de vorming van extra korrels, die als verschillende soorten SG kan verschillen met verschillende sleutelcomponenten geïdentificeerd onder verschillende spanningen 1,22,23. Montage SG snel in levende cellen (zo snel als 10-20 min) en vele granules volledig gevormd binnen 1 uur van arseniet behandeling is dus belangrijk om de acquisities zo snel mogelijk achter startener de inductie van stress als het samenstel moet worden onderzocht. In latere stadia kan echter de dynamiek van SG worden bestudeerd, kleine korrels kunnen samenvloeien tot grotere structuren, en deze structuren zijn niet vastgesteld: de componenten worden uitgewisseld met het cytoplasma of anderszins granulaten zoals P-organen, plaatsen RNA verval 3. Rapid eye-detectie van getransfecteerde cellen en snelle controle van de parameters acquisities (vooral X, Y en Z-coördinaten) toestaan om een film inclusief assemblage van granules te verkrijgen, alsmede fotobleken en laser geïnduceerde cytotoxiciteit, de andere beperken cruciale stap in levende beeldvorming. In sommige gevallen konden belangrijke veranderingen in celmorfologie en zelfs de dood van een paar cellen nemen, indien de acquisities werden uitgevoerd gedurende een lange tijd (meer dan 1 uur na de inductie van oxidatieve spanning met arseniet behandeling). Om deze verschijnselen te voorkomen, is het mogelijk om de scan bevestigen en de onderhoudstermijnentijdsduur tussen elke overname. Echter, een kortere interval laat toe om beter de dynamiek van SG met de gevisualiseerde eiwit te volgen, en een meer complete film te verkrijgen. Zo moet men de parameters aan elk experiment om de beste film met beperkte fotobleken en toxiciteit te verkrijgen, afhankelijk van het primaire celtype, de granule component die wordt gevolgd, en de bijbehorende fluorofoor molecuul.
Fluorescerende eiwitten tags zijn meestal voldoende photostable te beelden gedurende de duur van het experiment. Verschillende fluorescente proteïnen kan goed werken, zolang ze een sterk signaal, langzaam te bleken en niet giftig. Belangrijk, moeten zij helder genoeg zijn om signaal boven de autofluorescentie van de cellen en worden derhalve betrouwbaar worden gedetecteerd. Inderdaad, kan primaire cellen een achtergrond signaal induceren als gevolg van de autofluorescentie van organellen (zoals mitochondria en lysosomen). Maar in onze handen, autofluorescence waserg laag in vergelijking met de helderheid van EGFP-G3BP en was het gemakkelijk om de EGFP signaal getransfecteerde cellen versus niet getransfecteerde cellen onderscheiden. In het algemeen zal de keuze van de optimale filters en laserlicht intensiteitsniveaus kritisch voor de juiste signaal-ruisverhouding, gekoppeld aan lage toxiciteit verkrijgen. Tenslotte, indien afbeeldingen moeten kwantitatief worden bestudeerd, is het belangrijk om zeker te zijn dat de fluorescentie-intensiteit van het eiwit niet gevoelig voor omgevingsfactoren, zoals componenten van het kweekmedium.
SG dynamiek kunnen inderdaad worden vergeleken (snelheid van vergadering, de grootte en het aantal korrels) tussen verschillende omstandigheden (cellen van wild-type en knock-out dieren bijvoorbeeld). Om statistisch significante resultaten te krijgen, moet men kweekcellen uit ten minste drie verschillende dieren van elk genotype of conditie (bij drie verschillende nesten) en beeld tussen 10 en 50 cellen in elke onafhankelijk experiment. Het is mogelijk om verschillende posities markerende acquisities software en aldus het aantal getransfecteerde cellen tegelijk, waardoor de verkregen in een relatief korte tijd data te verhogen. Imaging meerdere cellen tegelijk is interessant omdat het moeilijk zal zijn om hetzelfde petrischaal verder gebruikt zodra de cellen gestresst en afgebeeld (wanneer het samenstel van SG wordt onderzocht, of de experimentele omstandigheden lange acquisities induceren cytotoxiciteit). Wanneer kwantificering van de parameters "nummer" en "grootte" van SG - en om het aantal cellen afgebeeld meer statistische relevantie te vinden (meer dan 50 cellen van elk) verhogen - cellen kan worden vastgesteld nadat arseniet behandeling, zodat dat meer cellen in dezelfde petrischaal worden bestudeerd. Video nog steeds gebruikt als kwalitatieve resultaten in dit geval.
De hier beschreven protocol toelaat-G3BP bevattende SG in primaire levende cellen, en kan worden aangepast aan andere cellulaire organen en andere eiwitten components van deze organen (zoals TIA-1 / R voor SGS, FRMP en Staufen voor SGS en neuronale transport korrels). Het gebruik van primaire cellen is bijzonder interessant in verband met fysiologische studies, waarbij bijvoorbeeld transgene dieren. Inderdaad, G3BP1 KO muizen onthullen bijvoorbeeld de essentiële functie van een SG factor overleving en ontwikkeling van een organisme, en in het CZS werkende 14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
De auteurs willen graag de Montpellier Rio Imaging (MRI)-platform waar de overnames werden uitgevoerd erkennen. Ze bedanken Isabel Cristina Lopez Mejia, Alexandra Metz, Irina Lassot, Solange Desagher, Fabien Loustalot en Virginie Georget voor hun hulp in verschillende delen van het protocol. Dit werk werd ondersteund door de Fondation pour la Recherche Medicale (FRM) (Equipe FRM 2011-n ° DEQ20111223745).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F12 | Gibco | 21331 | Prewarm at 37 °C |
| Sodium pyruvate | Gibco | 11360 | |
| Nonessential amino acids | Gibco | 11140 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 | |
| Trypsin | Gibco | 15096 | |
| Glass bottom B-35 | Greiner | 627860/627861 | Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells) |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| DMEM | Gibco | 31966 | Prewarm at 37 °C |
| HeBS | Sigma-Aldrich | 51558 | |
| Neurobasal | Gibco | 21103 | Prewarm at 37 °C |
| 2-mercaptoethanol | Gibco | 31350 | |
| Forceps | Biotek | DU-110-A | Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges) |
| Curved forceps | Biotek | P-110-BUF | Very thin, tips 0.1 mm |
| Small scissors | Biotek | CM-85-BS | Can be useful to remove hippocampi |
| Polyplus transfection JetPEI reagent | Ozyme | 101-10 | MEFs transfection, follow the forward protocol |
| Inverted laser scanning confocal microscope | Leica | SP5 |
References
- Thomas, M. G., Loschi, M., Desbats, M. A., Boccaccio, G. L. RNA granules: The good, the bad and the ugly. Cellular Signalling. 23 (2), 324-334 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Stress granules: sites of mRNA triage that regulate mRNA stability and translatability. Biochemical Society transactions. 30 (6), 963-969 (2002).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in Biochemical Sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Gilks, N., et al. Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1. Molecular biology of the cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).
- Tourrière, H., et al. The RasGAP-associated endoribonuclease G3BP assembles stress granules. The Journal of Cell Biology. 160 (6), 823-831 (2003).
- Parker, F., et al.
- Annibaldi, A., Dousse, A., Martin, S., Tazi, J., Widmann, C. Revisiting G3BP1 as a RasGAP binding protein: sensitization of tumor cells to chemotherapy by the RasGAP 317-326 sequence does not involve G3BP1. PLOS ONE. 6 (12), (2011).
- Kennedy, D., French, J., Guitard, E., Ru, K., Tocque, B., Mattick, J. Characterization of G3BPs: tissue specific expression, chromosomal localisation and rasGAP(120) binding studies. Journal of Cellular Biochemistry. 84 (1), 173-187 (2001).
- Kobayashi, T., Winslow, S., Sunesson, L., Hellman, U., Larsson, C. PKCα Binds G3BP2 and Regulates Stress Granule Formation Following Cellular Stress. PLOS ONE. 7 (4), (2012).
- Tourrière, H., et al. RasGAP-associated endoribonuclease G3Bp: selective RNA degradation and phosphorylation-dependent localization. Molecular and Cellular Biology. 21 (22), 7747-7760 (2001).
- Costa, M., Ochem, A., Staub, A., Falaschi, A. Human DNA helicase VIII: a DNA and RNA helicase corresponding to the G3BP protein, an element of the ras transduction pathway. Nucleic acids research. 27 (3), 817-821 (1999).
- Solomon, S., et al. Distinct structural features of caprin-1 mediate its interaction with G3BP-1 and its induction of phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 2alpha, entry to cytoplasmic stress granules, and selective interaction with a subset of mRNAs. Molecular and Cellular Biology. 27 (6), 2324-2342 (2007).
- Soncini, C., Berdo, I., Draetta, G. Ras-GAP SH3 domain binding protein (G3BP) is a modulator of USP10, a novel human ubiquitin specific protease. Oncogene. 20 (29), 3869-3879 (2001).
- Zekri, L., et al. Control of fetal growth and neonatal survival by the RasGAP-associated endoribonuclease G3BP. Molecular and Cellular Biology. 25 (19), 8703-8716 (2005).
- Martin, S., et al. Deficiency of G3BP1, the stress granules assembly factor, results in abnormal synaptic plasticity and calcium homeostasis in neurons. Journal of neurochemistry. , (2013).
- Mazroui, R., Huot, M. -E., Tremblay, S., Filion, C., Labelle, Y., Khandjian, E. W. Trapping of messenger RNA by Fragile X Mental Retardation protein into cytoplasmic granules induces translation repression. Human molecular genetics. 11 (24), 3007-3017 (2002).
- Colombrita, C., et al. TDP-43 is recruited to stress granules in conditions of oxidative insult. Journal of neurochemistry. 111 (4), 1051-1061 (2009).
- Thomas, M. G., Tosar, L. J. M., Desbats, M. A., Leishman, C. C., Boccaccio, G. L. Mammalian Staufen 1 is recruited to stress granules and impairs their assembly. Journal of Cell Science. 122 (4), 563-573 (2009).
- Chen, Y., Stevens, B., Chang, J., Milbrandt, J., Barres, B. A., Hell, J. W. NS21: re-defined and modified supplement B27 for neuronal cultures. Journal of neuroscience. 171 (2), 239-247 (2008).
- Xia, Z., Dudek, H., Miranti, C. K., Greenberg, M. E. Calcium Influx via the NMDA Receptor Induces Immediate Early Gene Transcription by a MAP Kinase/ERK-Dependent Mechanism. The Journal of Neuroscience. 16 (17), 5425-5436 (1996).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Current protocols in neuroscience. 3, (2001).
- Reineke, L. C., Dougherty, J. D., Pierre, P., Lloyd, R. E. Large G3BP-induced granules trigger eIF2α phosphorylation. Molecular biology of the cell. 23 (18), (2012).
- Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies. Methods in enzymology. 448, 521-552 (2008).
