Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Live Primärceller

Summary

Stress granulat (SGS) är cytoplasmiska RNA-granulat innehåller strandade ribonukleoprotein partiklar (RNP), och viktigt i cellulär reaktion på olika påfrestningar. Dynamik i SGS kan följas i levande celler genom att visualisera lokalisering av ett taggat komponent SGS i transfekterade primära celler efter stress.

Abstract

SGs kan visualiseras i celler genom immunfärgning av specifika proteinkomponenter eller polyA + mRNA. SGs är mycket dynamisk och studiet av deras montering och öde är viktigt att förstå den cellulära svar på stress. Bristen på nyckelfaktorer SGS som G3BP (RasGAP SH3 domän Binding Protein) leder till utvecklingsdefekter hos möss och förändringar i det centrala nervsystemet. För att studera dynamiken SGS i celler från en organism, en kan kulturen primära celler och följa lokaliseringen av en transfekterade taggad komponent i SGS. Vi beskriver tidsförlopp experiment för att observera G3BP1 innehåller SGs i mus embryonala fibroblaster (MEF). Denna teknik kan också användas för att studera G3BP innehållande SGs i levande nervceller, vilket är viktigt eftersom det var nyligen visat att dessa SGs bildas vid uppkomsten av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom. Denna metod kan anpassas till alla andra mobila kropp och granul proteinkomponent, och utförtmed transgena djur, så att den levande studie av granuler dynamiken exempelvis i frånvaro av en specifik faktor av dessa granuler.

Introduction

Stress granuler (SGS) är icke-membranös cytoplasmatisk foci bildas som ett cellulärt skyddande svar på miljöstress, såsom förhöjd temperatur, oxidativ stress, hypoxi, osmotisk chock, UV-bestrålning, glukosbrist, eller virusinfektion ^1. De kan induceras kemiskt genom behandling med föreningar såsom natriumarsenit, som utlöser oxidativ stress. SGs ackumuleras avstannade översättning greps budbärare ribonukleoprotein (mRNPs) komplex ^2, komplexbildare mRNA från translationell maskiner, och deras församling kan utlösas av fosforylering av eIF2α (eukaryota initiering faktor 2 α). SGs är dynamiska strukturer som utbyter komponenter med polysomerna och andra korn som P-organ. De utgör en "triage center" där mRNA sorteras och bearbetas för antingen översättning, återinsättande, nedbrytning eller förpackning till stabila icke-polysomal mRNPs ^3. Monteringen av SGS är snabb but det är en gradvis process med inledande många små aggregat som smälter samman till större korn. Användningen av kemiska hämmare som stör eller stabiliserar mikrotubuli visar att mikrotubuli-nätverk krävs för SG dynamik inbegripet montering, sammansmältning och demonteringsprocesser.

Den dynamiska sammansättning av SGS är också främjas genom aggregering av specifika RNA-bindande proteiner (RNA-BP) som TIA-1 (T-cell inre antigen-1) och TIAR (TIA-1-besläktat protein), som har möjlighet att dimerisera och främja polysom ​​demontering och dirigering av mRNA i SGs ^4. G3BP (RasGAP SH3 domän bindande protein) är en sådan RNA-BP som lokaliserar till SGS när cellerna är stressade med arsenit eller hög temperatur, och överuttryck av defosforylerat G3BP kan framkalla SGs församling ^5.

G3BP är ett evolutionärt bevarat RNA-BP som ursprungligen karakteriserades genom dess interaktion med en Ras-GTPas aktiverande protein (RasGAP p120 ^6); men denna interaktion har nyligen revisited ^7. I G3BP familjen ingår två medlemmar i däggdjur, G3BP1 (kallas G3BP) och G3BP2 ^8. Båda proteinerna colocalize i SGS, när cellerna utsätts för stress ^9. G3BPs omfattar en N-terminal NTF2 domän föreslog att påverka sin lokalisering och oligomerisering, följt av prolin rika (PxxP) motiv, då C-terminal motiv i samband med RNA-bindande: den kanoniska RNA-Erkännande Motif (RRM) med bevarade RNP1 och RNP2 motiv , följt av en arginin-glycin rika (RGG) rutan. Intressant, analys av olika delar av proteinet genom att konstruera olika domäner fuserade till EGFP visade att NTF2 liknande domänen och den RNA-bindande domänen var mest effektivt rekryteras till SGS, vilket tyder på betydelsen av egenskaperna hos dimerisering och RNA-bindande montering av SGS. Olika modeller har avslöjat olika funktioner G3BP proteiner in vitro ^10-13.Rubbning av G3BP i möss har visat betydelsen av detta protein i utvecklande tillväxt och överlevnad ^14, såväl som en viktig roll för G3BP i det centrala nervsystemet (CNS), som kännetecknas av ataxi och defekter i spatiala arbetsminnet ^15. G3BP brist leder till förändrad neuronal plasticitet och kalciumhomeostas, att en direkt koppling mellan SG bildning och neurodegenerativa sjukdomar ^15. Det är därför viktigt att kunna studera dynamiken SGS i primära celler som nervceller.

Detta protokoll är ett enkelt sätt att följa monteringen av G3BP1 innehållande SGs i primära celler under arsenit behandling. Den kan användas för att studera SGs aggregatet under olika förhållanden, exempelvis olika typer av påfrestningar. Den kan även anpassas till andra korn eller andra beståndsdelar i SGS. I själva verket, fokuserar detta protokoll på G3BP1, men det finns andra stress granulat markörer som TIA-1 / R, TTP (tristetraprolin) ^2,FMRP (Fragil X utvecklingsstörning syndrom protein) ^16, TDP-43 (TRANSsvars DNA-bindande protein 43) ¹⁷ eller Staufen ^18. Särskilt proteiner som TIA-1 / R är, liksom G3BP, kärn RNA-bindande proteiner som kan inducera SGs församling när överuttryckt, även om de olika formade SGs kan skilja sig åt i funktion, reglering och tillhörande avskrifter. Transfektion av fluorofor-märkta versionen av någon av dessa nyckelkomponenter eller nukleatorer SGS kan utföras för att bilden särskilt SGs montering och dynamik.

Protocol

Alla djurförsök i detta protokoll är i strikt följsamhet med riktlinjerna från Europeiska gemenskapen Rådets direktiv av den 24 november 1986 (86-609/EEC). Hus mössen i grupp, så att mat och vatten efter behag. Behåll dem i en kontrollerad miljö (22 ± 1 ° C, 55 ± 5% fuktighet) med en 12 h: 12 h ljus: mörker-cykel (ljus på kl 07:00).

1 Kultur av murina primära celler:. Mouse Embryonala fibroblaster (MEF)

1. Autoklav tunna pincett samt böjda pincett och dissekera sax. Förvara i en steril behållare. Använd steril D-PBS (Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning). Förbered komplett MEFs medium: Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) / F12 kompletterat med 10% fetalt kalvserum (FBS), 1 mM L-glutamin, 1 mM natriumpyruvat, 1% icke-essentiella aminosyror, och 0,5 mM 2-merkaptoetanol och varm vid 37 ° C.
2. Euthanize en gravid mus (vid 13,5 dagar efter coïtum (DPC)) Genom cervikal dislokation. Ta bort livmoderhornen från musen desinficeras med 90% EtOH. Enligt en steril och ren huva, placera hornen med embryona i 37 ° C förvärmd D-PBS. Öppna horn, plats embryona i en 100 mm steril plast petriskål, rensa dem från navelsträngen materialet och tvätta dem med varmt D-PBS för att avlägsna blod överskott. Under en kikare, ta bort embryot lemmar, de inre organen och den övre delen av huvudet som innehåller hjärnan.
3. I en ny petriskål, finhacka embryon i mycket små bitar med en steril kirurgisk bladet eller sax (åtminstone för en minut). I fråga om embryon av olika genotyper, vara noga med att sätta varje embryo i individuella petriskålar och hålla svansen eller överhuvudet för genotypning.
4. Täck embryot med 1x trypsin-EDTA (0,25% trypsin, 1 mM EDTA). Inkubera under 30 min till 1 h i en 37 ° C inkubator. Tillsätt 10 ml komplettMEF medium för att stoppa trypsin reaktion. Pipettera upp och ner för att ta bort alla aggregat. Låt sitta cellsuspensionen in i ett 50 ml rör (fylld med komplett medium) i 10 min, och centrifugera den överstående lösningen i 5 min vid 300 xg vid rumstemperatur. Återsuspendera pelleten i fullständigt medium (6 ml för ett embryo). Livskraftiga kärnförsedda celler kan räknas med hjälp trypan blå (Omkring 5 x 10 ⁶ celler kan förväntas från ett embryo). Tallrik 3 ml per 60 mm petriskål.
5. Ändra mediet nästa dag och tillåta cellerna att växa tills disken är sammanflytande. Många celltyper kan ses, men bara fibroblaster kommer att överleva subkultur.
6. Dela upp cellerna och tillåta dem att växa i 35 mm skålar med glasbotten (viktigt för time lapse experiment), tills 50-70% konfluens för transfektion. Test för Mycoplasma och mus patogener.

2. Kultur Adaptations i mål av nervceller

1. Dagen före kultur, rock 35 mm glas botten petriskålar med poly-L-lysin (200 pl 0,1 mg / ml) under en steril och ren huva, och lämna över natten.
2. På nästa morgon, sköljdes med sterilt rent vatten, två gånger under 5 min och en gång under 45 minuter till en timme. Ersätt med 2 ml DMEM plus 10% FBS medium och hålla i en 37 ° C inkubator.
3. Dissekera embryon vid 18,5 DPC. Under en steril och ren huv, placera hornen med embryona i kall steril HBSS (Hanks balanserade saltlösning) i 100 mm petriskål. Neonatal pups kan också användas istället för embryon för att bevara livslängden för dammen och att den skall kunna producera mer avkomma, speciellt i fallet av transgena djur som kan vara svåra att erhålla. I enskilda petriskålar, ta varje embryo eller nyfödda och skär huvudet med en sax. Håll huvudet genom att sätta böjda pincett i ögonen, skära in i huden och öppna försiktigt mjuka skallen från baksidanav huvudet tills ögonen, på vardera sidan av huvudet. Skär synnerverna och hjärnstammen, ta bort hjärnan, och placera den i en ny petriskål med HBSS. Enligt ett stereoskop, ta bort alla hjärnhinnorna använder två tunna pincett. Separera den hippocampi, cortex eller någon annan del av hjärnan beroende på strukturen för att studera.
4. Doppa dissekerade hjärnans struktur på 4,5 ml kall HBSS förberett tidigare i 15 ml rör och hålla på is tills uppslutning med trypsin. Lägg till 0,5 ml av 2,5% trypsin och inkubera vid 37 ° C under 15 min till 20 min. Skölj trypsin 3x med HBSS, vara extremt noga med att inte kasta de uppdelade hjärndelar.
5. Återsuspendera i 500 | il (hippocampi) och 1 ml (cortex) DMEM plus 10% FBS och pipettera upp och ned flera gånger med en 1 ml mikropipett utrustad med en 1 ml spets, då utrustad med en ml plus 200 ul tips, tills det finns ingen synlig aggregat.
6. Fördela 100-200 l cellsuspension till varje 35 mm glas bottom skål innehållande DMEM plus 10% FBS och låta neuroner vidhäftar vid 37 ° C under minst 3 timmar. Ersätt med förvärmt neuron komplett medium (Neurobasal-medium kompletterat med 250 | iM L-glutamin och NS21, framställd såsom beskrivits i Chen et al. ¹⁹⁾ och låt stå vid 37 ° C för att tillåta neuronal tillväxt. Transfektera nervceller vid 5 till 14 dagar in vitro (div) (effektivitet transfektion är högre efter ett par div men synapsförbindelser är bättre etablerad 7-10 div).

3. Transfektion av EGFP-G3BP1 Construct

Transfektera celler med en vektor innehållande cDNA: t av en protein av intresse (någon komponent i SGS) sammansmält med en fluorescerande markör (GFP, YFP, etc), med användning av 3 | ag av renad plasmid per 35 mm skål.

1. Transfektera MEF med hjälp av en kommersiell metod, enligt tillverkarens protokoll (se tabell för material / reagenser).
2. Transfektera neuroner med en kalciumfosfat metod anpassad från Xia et al ²⁰ korthet.:
   1. Förbered lösningarna: DMEM-tvätt: DMEM innehållande 25 mM KCl; transfektion lösning: DMEM-wash innehåller 1x DMKY (HEPES 5 mM, _MgCl2 10 mM, fenolrött); och chock lösning: HeBS 1x, DMKY 1x, och DMSO 2% (vol / vol); och hålla dem vid 37 ° C.
   2. Ta bort materialet från nervceller, filtrat, och hålla den vid 37 ° C. Tvätta med DMEM-tvätta sedan ersätta med transfektion medium och hålla vid 37 ° C under förberedelserna av kalciumfosfat-plasmid-DNA fällningar.
   3. I ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt (i denna ordning) Braun vatten (slutlig volym 50 | il), 5 ^ il av CaCl ₂ 2,5 M, och 3 ^ g av plasmid-DNA. Släpp ut blandningen på 50 | il av HeBS 2x redan införts i en rundbottnad polypropylenrör. Blanda röret genom rotation tillsammans med avskaffandet. Låt fällningen form vid rumstemperatur under 30 min.
   4. Till precipitate droppvis på nervceller och lämna vid 37 ° C under 30 till 50 minuter.
   5. Ersätt med chock lösning under 1 min, skölj sedan med DMEM-tvättar och slutligen återinföra den förbehandlade mediet. Håll cellerna vid 37 ° C.

4. Visualisering av G3BP innehållande SGs Montering och dynamik

1. Ersätt mediet av cellerna, som innehåller fenolrött av fenolrött-fritt medium.
2. Använd en konfokalmikroskop utrustad med fluorescens för förvärven. Slå på mikroskopsystem: kvicksilverlampa, dator, och lasrar. Värm upp kammaren till 37 ° C i minst 20 minuter före början av förvärven.
3. Den över expressionen av G3BP inducerar det spontana bildandet av en typ av SGS. Cellerna kan således observeras för montering SGS 24 timmar direkt efter transfektion utan stress induktion. Alternativt kan spänningen induceras att ytterligare inducera monteringen av SGS. Lägg till 0,5 mM natriumarsenit och stjärnat förvärvet direkt efter tillsatsen av föreningen (granuler kommer att vara väl bildas inom en timme).
4. Lägg olja till immersionsobjektiv (använd 40X eller 63X mål) och installera petriskål över målet i den anpassade 35 mm mikroskophållare, stabiliserats på scenen hållaren. Kontrollera att skålen är platt annars förvärven kommer att ändras. Slå på fluorescens ljus enligt de relevanta fluoroforen och visualisera transfekterade celler. Stäng av fluorescens när en cell av intresse är inom området för att minimera blekning och cytotoxicitet.
5. I "förvärva fliken" Välj de lasrar beroende på excitationsvåglängden av taggen fluoroforen (488 nm i våra protokoll som använder EGFP-taggade G3BP) och välj anpassad emissionslängden för PMT (fotomultiplikatorröret). Justera lasereffekt (vanligen inte mer än 10%) för att minimera brus och övermättnad samt toxicitet, och ställa in förstärkning och offset för att ändra signal-till-brusförhållandet.Scanna snabb (1000 Hz) för att minimera varaktigheten av laser exposition (line genomsnitt 2, ram genomsnitt 1). Om du vill ställa in parametrarna för Z stacken för att kunna rekonstruera bilden i 3D (en Z-steg på 1 mikrometer är oftast bra med celler). Bestäm intervalltiden mellan varje förvärv: mindre intervall medger att få en mer sammanhållen film, men detta kan inducera fotoblekning och toxicitet (ett intervall på 20 sekunder användes i de beskrivna experimenten). Varaktighet för total förvärv kan variera beroende på typ stress. Många G3BP innehåller SGs bildas mycket snabbt under arsenit behandling och är väl synliga efter 1 timme av behandling: i så fall väljer snabbt cellerna att filma och starta förvärven direkt efter stress, med en total varaktighet på förvärv av 15 - 20 min i stort sett tillräckligt att konstatera montering av flera SGS.
6. Spara bilderna och rekonstruera stackar och film med ImageJ programvara.

Representative Results

Stress granulbildning är viktig i responsen hos celler för stress, vilket medger en cellulär anpassning med avstannat översättning, tills spänningen har läkt, är associerat till förhindrande av apoptos. Denna analys tillstånd att studera SGS i primära celler, genom att följa lokalisering av nyckel sgs proteinkomponenter (figur 1). G3BP, en nyckelfaktor för SGS församling, finns ganska diffust i cytoplasman av odlade MEF eller nervceller (Figur 2A a och c), och är tydligt närvarande i diskreta granuler under arsenit behandling i MEF och nervceller (Figur 2A b och d). Primära celler kan erhållas från transgena musmodeller, vilket till exempel studier av spännings granulat i avsaknad av någon av komponenterna. Intressant, den brist på G3BP1 i mus leder till allvarliga brister i det centrala nervsystemet, särskilt en ataxic phenotype tecknas av oförmåga att fullständigt samordna rörelserna (som ses i en lem spännan test, fig 2B) och en förändring av den fysiska arbetsminnet. G3BP1 finns i spännings granulat i nervceller, och det är desto mer intressant att SGS har visat sig bildas vid uppkomsten av neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom.

Denna analys (figur 1) på så sätt tillåter att studera SGs i primärceller, oumbärliga för att studera deras sammansättning och montering in vivo. Dessutom tillåter studier av levande celler och kan således användas för att följa dynamiken i SGS, genom att visualisera en eller flera av deras överuttryckta komponenter i realtid. Figur 3 visar representativa time-lapse bilder tillåter att följa monteringen och dynamik G3BP1 innehåller SGs i MEF efter arsenit behandling. I figur 4A, är samma experiment utfördes med murina hippocampus neuroner i kulture. EGFP-G3BP1 lokalisering går från stora subcellulära granulära strukturer till mer definierade och mindre granulat, SGS, efter arsenit behandling. SGS mer och mer definierade om förvärven fortsatte (visas ej) men cellen morfologi börjat förändras, troligtvis på grund av värmen och toxicitet inducerad av laserexcitation.

Time lapse tillåter infångandet av en video att direkt observera SGS dynamik. Vidare användning av en konfokalmikroskop möjligt att rekonstruera en bild i Z-stack och på så sätt följa helt dynamiken i de organ i hela cellen i tre dimensioner (enligt bilden för en neuron vid en definierad tidpunkt i figur 4B).

Figur 1. Beskrivande av de viktigaste stegen i protokollet. Primära celler odlasfrån embryon (18,5 DPC (dagar efter coitum) (eller neonatal pups) för neuroner (A), 13,5 DPC för MEF (b)). Efter transfektion av en plasmid innehållande EGFP-G3BP1 cDNA, celler stressade och avbildas med en laserskanning konfokalmikroskop. Dynamik av G3BP1 innehållande SGs iakttas. Nervceller kan göras synliga genom MAP2 (mikrotubuli associerat protein 2) färgning i (a), MEF efter G3BP1 färgning i (b). De ges som illustrativa bilder, samt EGFP-G3BP1 transfekterade mus neuron (c) och fibroblast (d), som är självständiga bilder och motsvarar inte de celler som anges i (a) och (b).

Figur 2. (A). G3BP lokalisering i odlade MEF och hippocampus nervceller, obehandlad eller stressad med natriumarsenit. G3BP är främst cytoplasma, med en diffus färgning i MEF (a) eller i stora granulära strukturer i soma av neuroner (c) när cellerna inte är stressade. Efter 1 h av natriumarsenit behandling, blir G3BP lokaliserad i diskreta cytoplasmiska granuler (MEFs, b och nervceller, d). Här fixerades celler och immunfärgades med anti-G3BP1 antikropp. MAP2 färgning tillåter att identifiera nervceller i c) och d). DNA kontra färgade i blått med Hoechst. Skalstrecken representerar 2 | im (a och b) och 10 ^ m (c och d). (B). Då lyfte i svansen mot golvet (lem-knäppa test), WT möss förlänga sina ben (vänster) medan G3BP1 KO möss visar en onormal tass-knäppa reflex nära en fladdermus-liknande hållning. Klicka här för att se en större version av denna figur.

fig3highres.jpg "width =" 500 "/>
Figur 3. Successiva förvärv inom tidsförlopp experiment som erhållits med MEF transfekterade med EGFP-G3BP1, med hjälp av en Leica SP5 laserskanning konfokalmikroskop (excitation vid en våglängd på 488 nm). Förvärv påbörjades 10 minuter efter tillsatsen av natrium-arsenit, och som erhållits under 10 min med intervall på 20 sek. Sex representativa bilder redovisas, och t är tiden i sekunder efter tillsatsen av natriumarsenit (0,5 mM). Pilarna visar två områden där vi kan se montering av SGS. Scale bar = 2 jim.

Figur 4. (A). Successiva förvärv inom tidsförlopp experiment erhålls med murina hippocampus neuroner transfekterade med EGFP-G3BP1, med hjälp av en Leica SP5 laserskanning konfokalmikroskop (excitationvid en våglängd av 488 nm). Förvärv startades 5 minuter efter tillsatsen av natrium-arsenit, och som erhållits under 40 min med intervall på 20 sek. Sex representativa bilder redovisas, och t är tiden i sekunder efter tillsatsen av natriumarsenit (0,5 mM). Pilarna visar två områden där vi kan se montering av SGS. Skala stapel representerar 5 um d:. Dendrit; a: axon. (B). 3-dimensionell rekonstruktion från Z-stack (5 förvärv i Z-axeln över totalt 10 mikrometer) av en neuron transfekterade med EGFP-G3BP1 och behandlas med natriumarsenit n:. Neurit (dendrit eller axon). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Discussion

De mest kritiska stegen i protokollet avser transfektion och i synnerhet de tids lapse förvärv, som måste övervakas noggrant för att sänka ner cytotoxicitet.

Kultur av primära celler är inte en svår del, så länge som sterila förhållanden upprätthålls och försiktighet vidtas för att undvika skador under dissekering och cell dissociation steg. MEF kan förvaras frysta vid tidiga passager. Neuron transfektion med kalciumfosfat har visat sig fungera bra ²¹ och detta protokoll anpassas från Xia et al. ²⁰ möjliggör god transfektion, men det kan framkalla en viss celldöd. Det är viktigt att transfektera neuroner inom några dagar efter det att kultur, för att kontrollera pH-värdet för lösningarna och övervaka inkubation av nervceller med den kalciumfosfat-plasmid-fällning, som inte bör överskrida en timme. Kontrollera under ett ljusmikroskop och avlägsna transfection medium om aggregat observeras. Antalet tvättar med DMEM kan ökas.

Den över expressionen av vissa SGS proteinkomponenter leder till spontan hopsättning av granuler, som tycks involvera oligomerisering och RNA-bindande egenskaperna hos dessa proteiner, såsom i fallet med TIA-1 / R ⁴ eller G3BP ^5. Därför är det viktigt att definiera den tid då du kan starta tid förfaller förvärv. Några SGs är synliga så snart som 24 timmar efter EGFP-G3BP transfektion, när proteinet uttrycks. Men att framkalla en ytterligare stress leder till bildandet av ytterligare granulat, som kan skilja sig som olika typer av SGs med olika nyckelkomponenter har identifierats under olika påfrestningar ^1,22,23. Montering av SGS är snabb i levande celler (så snabbt som 10-20 min), och många korn är helt bildas inom 1 timme av arsenit behandling, är det därför viktigt att börja förvärven snarast akterer induktion av stress om montaget måste studeras. I senare skeden kan emellertid även studeras dynamiken av SGS, som små granuler kan koalescera till större strukturer, och dessa strukturer är inte fasta: deras komponenter kan utbytas med cytoplasman eller andra typer av granuler som P-organ, platser av RNA förfall ^3. Rapid Eye-detektion av transfekterade celler och snabb övervakning av förvärv parametrar (speciellt X, Y, och Z-koordinaten) tillåter att erhålla en film innefattande montering av granuler, samt att begränsa fotoblekning och laser-inducerad cytotoxicitet, som är den andra kritiskt steg i live-avbildning. Ja, i vissa fall, kan vi konstatera viktiga förändringar i cellernas morfologi och till och med döden av några få celler, om förvärven genomfördes under en längre tid (mer än 1 timme efter induktion av oxydative stressen med arsenit behandling). För att förhindra dessa fenomen, är det möjligt att sätta fast scan och öka intervallenlöptid mellan varje förvärv. Men ett kortare intervall tillstånd att bättre följa dynamiken i SGS innehåller den visualiserade protein, och för att få en mer komplett film. Sålunda bör en anpassa parametrarna för varje experiment för att erhålla den bästa film med begränsad fotoblekning och toxicitet, beroende på den primära celltyp, på granulen komponent som följs, och på den tillhörande fluorofor molekyl.

Fluorescerande protein taggar är vanligtvis tillräckligt fotostabila som skall avbildas för varaktigheten av försöket. Olika fluorescerande proteiner kan fungera bra, så länge som de producerar en stark signal, är långsamma med att bleka och icke-toxisk. Viktigare, bör de vara tillräckligt ljust för att ge signal ovanför autofluorescens av cellerna och bli därmed tillförlitligt upptäckas. I själva verket kan primära celler inducerar en bakgrundssignal på grund av autofluorescens av organeller (som mitokondrier och lysosomer). Men i våra händer, var autofluorescensmycket låg jämfört med ljusstyrkan på EGFP-G3BP, och det var lätt att skilja den EGFP signalen av transfekterade celler kontra icke transfekterade celler. Totalt sett kommer valet av optimala filter och laserljusintensitetsnivåer vara kritisk för erhållande av rätt signal-till-brus-förhållande, som hör samman med låg toxicitet. Slutligen, om bilderna måste kvantitativt studeras, är det viktigt att vara säker på att fluorescensintensiteten av proteinet är inte känsligt för miljöfaktorer som komponenter i odlingsmediet.

Sgs dynamik kan faktiskt jämföras (hastighet montering, storlek och antal granulat) mellan olika förhållanden (celler från vildtyp och knock-out djur till exempel). För att få statistiskt signifikanta resultat, bör man odla celler från minst tre olika djur av varje genotyp eller tillstånd (från tre olika kullar) och bild mellan 10 och 50 celler i varje oberoende experiment. Det är möjligt att markera flera positioneri förvärv programvara och därmed bild flera transfekterade celler samtidigt, medger att öka de data som erhållits i en relativt kort tid. Imaging flera celler samtidigt är intressant eftersom det kommer att bli svårt att ytterligare använda samma petriskål när cellerna är stressade och avbildas (i de fall studeras monteringen av SGS, eller om de experimentella förhållandena i långa förvärv inducerar cytotoxicitet). Men när kvantifiera parametrar "nummer" och "storlek" SGS - och för att öka antalet celler som avbildas för att få mer statistisk relevans (mer än 50 celler för varje enskild) - celler kan fixeras efter arsenit behandling, så att fler celler i samma petriskål kan studeras. Videor kommer fortfarande att användas som kvalitativa resultat i det här fallet.

Protokollet som beskrivs här tillåter att studera G3BP innehåller SGs i primära levande celler, och kan anpassas till andra cellulära organ och andra protein components av dessa organ (som TIA-1 / R för SGS, FRMP och Staufen för SGS och neuronala transport granulat). Användningen av primära celler är särskilt intressant i samband med fysiologiska studier, som involverar t ex transgena djur. Faktum G3BP1 KO möss visar till exempel grundläggande funktion en SGs faktor för överlevnad och utveckling av en organism, liksom i CNS fungerande ^14,15.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM/F12	Gibco	21331	Prewarm at 37 °C
Sodium pyruvate	Gibco	11360
Nonessential amino acids	Gibco	11140
L-Glutamine	Gibco	25030
Trypsin	Gibco	15096
Glass bottom B-35	Greiner	627860/627861	Treated or not (treated: increases attachment of adherent cells)
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
DMEM	Gibco	31966	Prewarm at 37 °C
HeBS	Sigma-Aldrich	51558
Neurobasal	Gibco	21103	Prewarm at 37 °C
2-mercaptoethanol	Gibco	31350
Forceps	Biotek	DU-110-A	Very thin, tips 0.1 mm (useful to remove meninges)
Curved forceps	Biotek	P-110-BUF	Very thin, tips 0.1 mm
Small scissors	Biotek	CM-85-BS	Can be useful to remove hippocampi
Polyplus transfection JetPEI reagent	Ozyme	101-10	MEFs transfection, follow the forward protocol
Inverted laser scanning confocal microscope	Leica	SP5