Summary
תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.
Abstract
בעידן של ביולוגיה חישובית, מערכות ניסיוניות תפוקה גבוהה חדשות הן הכרחיות על מנת לאכלס ולשפר דגמים, כך שהם יכולים להיות תוקף למטרות חזויה. באופן אידיאלי מערכות כאלה יהיו בנפח נמוך, שאינו מאפשר ניתוח דגימה והרסני כאשר הנתונים כמובן זמן הם כדי להתקבל. מה שדרוש הוא בכלי ניטור אתר שיכול לדווח את המידע הדרוש בזמן אמת וnoninvasively. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של ריכוזים תאיים המבוסס על חלבונים. סוג מסוים אחד in vivo biosensors כי יש למצוא יישומים בכימות המטבוליט מבוסס על העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) בין שני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג חיישנים משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצר constitutively בתוך הקו הסלולרי, יש להם זמני תגובה מהירה וצ'ה הרפאים שלהםracteristics לשנות מבוסס על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. במאמר זה, השיטה לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS לגלוקוז וגלוטמין וכיול FIBS in vivo בתרבית תאים אצווה על מנת לאפשר כימות עתיד של ריכוז המטבוליט תאיים מתוארת. נתונים מתרביות תאים האכילו אצווה CHO מוכיחים כי FIBS הצליח בכל מקרה כדי לזהות את השינוי וכתוצאה מכך הריכוז תאיים. השימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, הריכוז תאיים היה מדויק ייקבע כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי.
Introduction
יש ניטור המטבוליט יישומים שונים בbioprocessing, כוללים פיתוח תהליך, תקשורת ועיצוב מזון, והנדסה מטבולית. שיטות שונות זמינות עבור מדידות ריכוז באמצעות האנזימטית 1, 2 כימי, או מבחני מחייבים 3. אופציה מעניינת היא השימוש בניאון, בחיישנים ביולוגיים vivo ככתבים של הריכוז תאיים של מטבוליטים מפתח המבוסס על חלבונים. במבחני נפח נמוכים במיוחד, הקרינה היא כלי נוח כמו מזעור ממש משפר את 4,5 יחס אות לרעש וחיישנים המבוססים על חלבונים יכולים להיות מקודד גנטי משמעות שאין חומרים כימיים אקסוגניים נחוצים לניתוח המטבוליט. biosensors העברת פורסטר התהודה אנרגיה (סריג) מורכב משני חלבוני ניאון מחוברים על ידי תחום מחייב ליגנד. סריג הוא העברת nonradiative של אנרגיה מתורם צילום נרגש locat מולקולת ניאון acceptor אד בסמיכות (<100). מחשוף יגנד או מחייבים גורם לשינוי קונפורמציה בחיישן, אשר, בתורו, גורם לשינוי בקרבתו של fluorophores, מה שמוביל לשינוי בסריג יעילות שנמדד על ידי השינוי בספקטרום הפליטה. חיישני סריג משולבים ביולוגיים (FIBS) מיוצרים constitutively בתוך קו התא והמאפיינים ספקטרליים שלהם לשנות מבוססים על הריכוז של המטבוליט בתוך התא. יש לי FIBS זמני תגובה מהירה שהופך אותם אידיאליים עבור מדידות לדגמים דינמיים 6. יישומים קודמים כוללים ניטור אחת 7-9 ומרובים 10 מטבוליטים ומספקים נתונים על חלוקת spatiotemporal 11. ניתן ליצור FIBS בשתי תצורות: Apo-מקס, שבו ליגנד מחייב משבש את הקרבה של fluorophores הפחתת העברת אנרגיה וApo-מינ ', שבו ליגנד מחייב מביא שני fluorophores במגע קרוב יותר (איור 1).
_content "> בעבודה זו, פרוטוקול שהוצג לבניית השחלה אוגר סינית (CHO) שורות תאים שconstitutively להביע FIBS למטבוליט, גלוקוז או גלוטמין. המתודולוגיה הוא הוקם עבור הכיול של החיישן in vivo כדי לאפשר כמותיים עתיד מדידות של ריכוז המטבוליט תאיים, כפי שהוצגו באיור 2. על בסיס זה, הריכוז תאיים של גלוקוז או גלוטמין ניתן לקבוע בתרביות תאים שייזונו אצווה CHO, שלשני חומרים מזינים נוספו בריכוזים גבוהים בתהליך. התוצאות להוכיח כי שימוש באות הניאון מהשקרים ואת עקומת הכיול שנבנה בעבר, בצורה מדויקת חיזוי של הריכוז תאיים הוא אפשרי, כפי שאושר על ידי assay אנזימטי עצמאי. שיטה זו מציעה יתרונות משמעותיים על פני טכנולוגיות אנליטיות הנוכחיות משום שהיא עלות נמוכה לא פולשנית, ומהיר, נותן אות של FIBS שיכול להיות יום שני בזמן אמתitored לאורך כל התרבות.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. תחיית שורת תאים ותחזוקה
- להחיות תאי CHO ב9 מיליליטר בינוני CD-CHO בתוספת 8 מ"מ L-גלוטמין ו10 תוסף מיליליטר / L hypoxanthine 100x / תימידין (מדיום גידול שלם).
- צנטריפוגה ב 5 דקות 100 XG.
- Resuspend התאים 10 מיליליטר של מדיום גידול שלם טרי.
- הסר מדגם 1 מ"ל ולקבוע את ריכוז תאי קיימא על ידי מיקרוסקופ אור בשיטת הרחקת צבע הכחולה trypan בhemocytometer.
- ליזום תרבות בצפיפות זריעה של 3 x 10 5 תאים / מיליליטר ב125 מיליליטר לנער צלוחיות.
- לשמור על התרבות בחממה על 37 מעלות צלזיוס, אווירת humidified של 5% CO 2, על פלטפורמה רועדת מסלולית מסתובבת ב120 סל"ד.
- תת כל 3-4 ימים במדיום גידול המלא בצפיפות זריעה של 2 x 10 5 תאים / מיליליטר.
2. Transfection של הקו הסלולרי עם פלסמיד Containing ג'ין Biosensor
- הכן את ה-DNA פלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד בקנה מידה גדולה.
- שמור על תאים בתנאים המתאימים (37 ° C CO, 5% 2) 12-24 שעה לפני transfection כדי להבטיח את התאים באופן פעיל בחלוקה בזמן של transfection.
- ספירת התאים באמצעות שיטת הדרת צבע הכחולה trypan, ואז להכין עבודה נפח 20 מיליליטר של תרבית תאים ב125 מיליליטר ללחוץ את הבקבוק בריכוז של 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
- השתמש בערכת transfection מתאימה לשורת התאים בשימוש. פלסמיד דנ"א יחס ריאגנטים transfection יהיה תלוי בקו הסלולרי וקטורית. מומלץ כי זה מותאם על ידי בדיקת טווח של יחסים בטווח שצוינו על ידי היצרן לפני ביצוע transfections הסופי. כמו כן לשמור על תרבות ביקורת שלילית לפחות אחד המכילה את התאים, אך לא ה-DNA.
- דגירה של 4 ימים במצב סטטי ולאחר מכן להעביר לשאקיפלטפורמת ng מסתובבת ב125 סל"ד.
- הוסף את האנטיביוטיקה המתאימה לבחירת פלסמיד לריכוז מתאים כפי שנקבע על ידי עקומה להרוג. במחקר זה, Zeocin התווסף לריכוז סופי של 400 מיקרוגרם / מיליליטר לבחירה של תאי transfected.
- שינוי בתקשורת במרווח זמן מתאים לשורת התאים, והוסיף אנטיביוטיקה בכל פעם, עד שתאים ובשליטתם מתו.
- השתמש בבארות המחוברות ביותר כדי להתקדם לטלטול תרבויות.
- להקים בנק תא על ידי הקפאת התאים בבקבוקונים המכילים קריוגני 10 7 תאי קיימא ב 1 מיליליטר של תערובת הקפאה. בעבודה זו, זה מורכב מ92.5% מדיום גידול ו7.5% sulfoxide דימתיל.
3. אצווה ועקומת גדילה תאי הפד אצווה
- עקוב אחר הוראות לתחזוקת תא שמעל להקים תרביות תאים שלושה עותקים של תאי CHO transfected ב250 מיליליטר לנער צלוחיות עם נפח עבודה של 50 מיליליטר.
- לשמור cultuמיל בחממה humidified תא על 37 מעלות צלזיוס, עם 5% CO 2, על פלטפורמה רועדת מסלולית מסתובבת ב125 סל"ד, ולהסיר 4.1 מיליליטר דגימות מכל תרבות גדלה ב24 מרווחי שעה.
- שימוש במדגם 100 μl כדי לקבוע את כדאיות ריכוז תא ותא קיימא עם שיטת הדרת צבע הכחולה trypan.
- חזור על פעולה עד ריכוז תאי קיימא מצטמצם לאפס.
- חזור על פעולה עבור תרביות תאי הפד אצווה להשלים עם הכמות המתאימה של גלוקוז או גלוטמין ביום 6 לשחזר ריכוזיהם לערכיהם הראשוניים של 36 מ"מ ו 4 מ"מ, בהתאמה. מומלץ תרבויות שליטה נוספת גם נשמרות, שהם שיאכילו עם אותו הנפח (12 מיליליטר במקרה זה) של מים טהורים.
4. סריג מדידות יחס
- קח 2 מיליליטר של הדגימות יומיות הוסר בשלב 3.2 לעיל וצנטריפוגות ב 5 דקות 100 XG ב 4 ° C.
- Resuspסיימתי את התא גלולה ב 2 מיליליטר של תמיסת מלח קרח קר פוספט (PBS). העבר את זה לצלחת 6 היטב ולהוסיף מדגם ריק המכיל לא תאים לאחד טוב.
- מדוד את רמות הקרינה כחולה וצהובה באופן מיידי בגל עירור של 430/435 אורכי גל nm ופליטה של 465/435 ננומטר (כחול) ו520/510 ננומטר (צהוב).
- לחשב את יחסי סריג (יחס של הקרינה צהובה זוהתה על הקרינה כחולה המזוהה).
5. המטבוליט מבחני
- קח 2 מיליליטר של הדגימות יומיות הוסר בשלב 3.2 לעיל וצנטריפוגות ב 5 דקות 100 XG ב 4 ° C. הסר את supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 3 קרח מיליליטר PBS הקר ו צנטריפוגות שוב בדקות 5 100 XG.
- הסר את supernatant ו resuspend התא גלולה ב 3 מיליליטר PBS הקר הקרח כאמור לעיל. Sonicate 5x המדגם עבור 3 דקות כל אחד בדופק של 15 שניות וב15 שניות משם. בשלב זה, התא נוסףCTS עשוי להיות מוקפא אם תרצה בכך.
- השתמש בערכת assay גלוקוז מתאימה לפי הוראות היצרן על דגימות של תמציות תא כדי לקבוע את ריכוז הגלוקוז התוך התאי (ראה טבלה של חומרים).
הערה: השתמש בסטנדרטים מתאימים לבניית עקומת סטנדרט. בעבודה זו, הריכוז של סטנדרטים נע בין 0-100 מ"מ. - שימוש בקריאה לסטנדרטים, לבנות את עקומת הסטנדרט ולמצוא את המשוואה ליניארית בכושר הטוב ביותר (במקרה זה: y = 1310.51x - 723.43 בי y הוא קריאת הספיגה וx הוא ריכוז גלוקוז).
- חשב את ריכוזי הגלוקוז באמצעות עקומת הסטנדרט ולוקח את הדילול בחשבון. ריכוז הגלוקוז התוך התאי ואז יכול להיות מחושב באמצעות המשוואה הזאת:
לתאי CHO, אחד נפח התא חושב באמצעות קוטר תא של 12 מיקרומטר 12 - השתמש בערכת assay גלוטמין מתאימה לפי הוראות היצרן על דגימות של תמציות תא כדי לקבוע את ריכוז גלוטמין תאיים (ראה טבלה של חומרים).
הערה: השתמש בסטנדרטים מתאימים לבניית עקומת סטנדרט. בעבודה זו, הריכוז של סטנדרטים נע בין 0-2 מ"מ. - כמו ב5.5 לעיל, לבנות את עקומת הכיול (במקרה זה y = 203.1x + 17.1 בי y הוא קריאת הספיגה וx הוא ריכוז גלוקוז)
- באמצעות עקומת הסטנדרט, לחשב את ריכוז גלוטמין של הדגימות, לוקח את הדילול בחשבון. ריכוז גלוטמין תאיים יכול להיות מחושב באמצעות משוואה 1 לעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סקירה של המתודולוגיה מוצגת באיור 2. בעבודה שהוצגה במסמך זה, תאי CHO היו transfected עם וקטור השקרים ושורות תאי יציבות נבחרו בלחץ אנטיביוטי של 400 מיקרוגרם / מיליליטר Zeocin. שתי שורות תאי יציבות נפרדות constitutively מבטאות את חיישני גלוקוז וגלוטמין נוצרו לכן. איור 1 מתאר את התצורות של שני biosensors שימש במחקר זה. חיישן גלוקוז מבוסס על עיקרון Apo-מקס ופלסמיד המתאים הוא pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. זו היא שילוב של החלבון המשופר ציאן הניאון (ECFP) וגרסת אפרודיטה של החלבון המשופר הצהוב הניאון (EYFP) למוטצית F16A של א ' גלוקוז coli / גלקטוז periplasmic חלבון מחייב. 11 שאריות חומצת אמינו הוצאו מאזור מקשר כדי לשפר את יעילות סריג 13. וקטור זה שובט לתוך וקטור pCDNA4/TO באמצעות uniqUE Eco RI ו PST אני אתרי הגבלה, אשר משתמש אמרגן ציטומגלווירוס ומשפר SV40.
חיישן גלוטמין מבוסס על עיקרון Apo-מינ '(איור 1) ואת הפלסמיד המקביל נבע מהחדרה של סיטרין החלבון פלואורסצנטי הצהוב לE. periplasmic גלוטמין coli חלבון מחייב בין חומצות אמינו 98 ו99 עם ECFP מצורף C-סופית. המבנה כבר מעטה קשיחה על ידי מחיקה של שאריות באזור הקישור, ואילו D157N החלפת חומצת אמינו נעשה כדי QBP להגדיל את הזיקה לגלוטמין, ואחרי כמה מוטציות כדי לייעל את יעילות סריג 8. גלוטמין סריג לבנות סופק בוקטור ביטוי צמח pUTKan והיה מתעכל עם Bam HI וסאל אני לשחרר את התוסף. האחרונים שוכפלו לאתרי הגבלה המקביל pET41a הווקטור במסגרת עם t טיהור N-המסוףAGS. אותו הכנס היה ligated לתוך וקטור pCDNA4/TO, אחרי זה היה מתעכל עם Bam HI וXho אני משתמש בקצוות הדביקים התואמים הופקו על ידי סאל אני וXho, כדי לייצר את וקטור הביטוי של היונקים.
ביטוי פלסמיד אושר על ידי כימות רמות ה-mRNA של biosensors באמצעות qRT-PCR. שני FIBS נמצאו שעבד באופן פעיל ב25-44 עותקי mRNA לכל תא בהנחת β-אקטין ב3,000 תמלילים לכל תא ברמת אמצע מעריכי-14.
אצווה לגדול תרבויות של כל שורת תאים נשמרו לקיחת דגימות יומיות לכיול in vivo של כל FIBS. פרופיל צמיחת תאי קיימא של שתי שורות התאים מוצג באיור 3 ומדידות המקבילה סריג וריכוזי המטבוליט תאיים נקבעו על ידי מבחני האנזימטית מוצגים בטבלה 1. קורא צלחת הקרינה שימש למדידההקרינה של דגימות בגל עירור של 430/35 אורכי גל nm ופליטה של 465/435 ננומטר לציאן ו520/510 ננומטר לצהוב. נמצא כי מספרי תא נמוכים כיום ב 4 הימים הראשונים של התרבות הביאו לאות סריג לא אמינה. כמו כן, הרמה הגבוהה של תא lysated נוכחי לאחר יום 8 של תרבות הפיק כמות גבוהה של פיזור אור. רק נתונים עבור ימים 4-8 ולכן הוא משמש לבניית עקומות כיול עבור FIBS גלוקוז וגלוטמין, המשוואות שלמוצגות בטבלה 1. התוצאות מראות כי אות FIBS מייצרת מתאם אמין עם הריכוזים תאיים בין 1-5 מ"מ לגלוקוז ו.3-2 מ"מ לגלוטמין.
בעקבות זאת וכדי לאמת את הממצאים לעיל, האכילו אצווה לגדול תרבויות של שתי שורות התאים בוצעו. הזנה המכילה ריכוז גבוה מצע (גלוקוז במקרה של FIBS גלוקוז וגלוטמין במקרה של FIBS גלוטמין) נוספהביום 6 של תרבית התאים להעלות את הריכוזים תאיים של המצע. במקרה של תרבות גלוקוז-fed ריכוז הגלוקוז תאי הוגדל בחזרה עד 36 מ"מ, ואילו לתרבות גלוטמין-fed, הריכוז גלוטמין הוגדל ל 4 מ"מ. איור 4 מציג תוצאות נציג ממחקר זה. 4A ומספרים 4C מתאר את יחסי סריג בכל יום, אשר בבירור להגיב להאכלה על ידי היפוך המגמה שהם במעקב עד היום 6. באופן ספציפי, באיור 4 א, יחס סריג לגלוקוז FIBS שורת תאי CHO יורדת ביום 7 בתגובה לגלוקוז בנוסף, מאז FIBS גלוקוז כדלקמן תצורת APO-On. באופן דומה, באיור 4C, יחס סריג לגלוטמין FIBS עליות שורת תאי CHO בתגובה לתוספת גלוטמין, בקנה אחד עם העיקרון של חיישני Apo-Off.
מדידות סריג אלה לבסוף שימשו לCalculate מקביל ריכוזי גלוקוז וגלוטמין תאיים המבוססים על עקומות הכיול האמורות והתוצאות מוצגים באיור 4 ב לגלוקוז ואיור 4D לגלוטמין. הם בהשוואה לריכוזים תאיים בפועל של מצעים אלה כפי שנקבעו עם גלוקוז ומבחנים האנזימטית גלוטמין ולהראות את הסכם הולם.
.. הטבלה 1 תוצאות עבור כיול vivo של יחס סריג לFIBS גלוקוז וגלוטמין עקומות הכיול מתוארות על ידי המשוואות הבאות שניתן להשתמש בם כדי להפוך את התחזיות: y =-1.232x + 8.034 לגלוקוז (R 2 = 0.961), וy = 1.892x 0.332 + לגלוטמין (R 2 = 0.879), שבו y הוא יחס סריג וx הוא הריכוז במ"מ.
איור 1. עקרונות FIBS שימש במחקר זה. FIBS גלוטמין (משמאל) מלווה את העיקרון Apo-מינימלי, על ידי שגלוטמין נקשר לתחומי החישה ויוצר שינוי קונפורמציה שמביא שני חלבוני הניאון ביחד קרוב, ובכך להגדיל סריג. FIBS גלוקוז (מימין) מלווה את עיקרון Apo-מקס, שבו הגלוקוז נקשר לתחום החישה ויוצר שינוי קונפורמציה שמפריד חלבוני הניאון, ובכך להקטין את סריג.
איור 2. סקירה של המתודולוגיה לכיול שקרים וכימות פולשנית הבא של גלוקוז תאיים וריכוזי גלוטמין.
איור 3. פרופיל ריכוז תאי קיימא עבור אצווה לגדול תרבויות של השקרים וגלוקוז FIBS-להביע גלוטמין קווי CHO תא (n = 2 חזרות ביולוגיות עם שלוש מדידות בכל שורת תא).
איור 4. התרבות אצווה הפד של תאי CHO ומתאימים מדידות סריג ייצור FIBS. (א) היומיasurements של יחס סריג של תרביות תאי CHO האכיל אצווה להביע FIBS גלוקוז. החץ מצביע על התוספת של גלוקוז לתרבית התאים. (ב) פרופיל ריכוז הגלוקוז תאיים בפועל נמדד באמצעות ערכת assay גלוקוז נגד ערכים חזויים מבוסס על in vivo עקומת גלוקוז כיול (טבלת 1). (ג) מדידות יומית של יחס סריג של תרביות תאי CHO האכיל אצווה להביע FIBS גלוטמין. החץ מצביע על התוספת של גלוטמין לתרבית התאים. פרופיל ריכוז גלוטמין תאיים (ד) בפועל נמדד באמצעות ערכת assay גלוטמין נגד ערכים חזויים מבוסס על in vivo עקום כיול גלוטמין (טבלת 1). בכל המקרים, n = 2 חזרות ביולוגיות עם שלוש מדידות בכל שורת תא.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FIBS לאפשר in vivo ו בquantitation באתרו של מולקולות מרכזיות, במקרה זה חומרים מזינים הגבלת צמיחה, הסרת אי ודאות הנובעת ממרווה ומיצוי שיטות. הממצאים מראים כי קיים מתאם טוב בין אות שקרים ואת הריכוזים תאיים בטווח של 1-5 מ"מ לגלוקוז ו0.3-2 מ"מ לגלוטמין. בתרבית תאים אצווה CHO, ריכוזים אלה נתקלו בשלבי הירידה מעריכית, נייחים, ומוקדם. שלבי מעריכי ונייחים הם הקריטיים ביותר במונחים של העיצוב של אסטרטגיות האכלה מתאימות; שימוש biosensors אלה להערכת דרישות חילוף החומרים של התאים ולכן רלוונטי תעשייתי. תוצאות הניסוי נמאס אצווה לאשר התאמתו 'FIBS לספק הערכות של גלוקוז תאיים וריכוזי גלוטמין. סטיות הוצגו בנקודות זמן קודמות עשויות שהתעוררו בגלל num תא קיימא הנמוךbers ו / או בשל הפרעה במטבוליטים אחרים, למשל על ידי גלקטוז במקרה של FIBS גלוקוז, ועל ידי חומצות אמינו אחרות במקרה של FIBS גלוטמין. באופן ספציפי, זה כבר הראה כי הפחתה של עד 20% ביחס סריג יכולה להתרחש בנוכחות aspartate, גלוטמט, גליצין, תראונין, ולין, וטירוזין 15. בסך הכל, התוצאות הללו מצביעות על השגיאה שבאות FIBS היא נמוכה למדי.
למרות שמתודולוגיה זו יכולה רק לפקח על מספר מצומצם של מולקולות בכל פעם, זה יכול לספק מידע שימושי לשורת תאים ופיתוח בתהליך, או אפילו רכישת נתונים לתיקוף מודלים מתמטיים. בהתחשב במגוון של חלבונים מחייבים periplasmic, ניתן לפתח biosensors הדומה עבור מערך למולקולות קטנות הכוללים חומצות אמינו אחרות, סוכרים, ויונים כמו סולפט ופוספט 16, מה שהופך את זה שיטה תכליתית לכימות המטבוליט בזמן אמת בתאים חיים .
יתרון עיקרי של השימוש של שקרים הוא היכולת להשיג מדידות באינטרנט שעלול להיות באופנה מתמשכת. השיטה לכן משאיל את עצמו לתפוקה גבוהה יישומים אשר יכול להפחית את הטיפול ידני ולזרז את מאמצי פיתוח. עם הזמינות המוגברת של סביבות microreactor עם פונקציונליות מובנית לגילוי הקרינה, זה שחזה כי המטבוליט מאופשר FIBS פרופיל פלטפורמה יכול לשמש להקרנת תא, תקשורת ואופטימיזציה של תהליך, וסולם למעלה תהליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים לפרופ 'וולף פרומר (מכון קרנגי למדע, אוניברסיטת סטנפורד) לחביבות לתת לנו גלוקוז סריג פלסמיד וד"ר Uwe Ludewig (אוניברסיטת הוהנהיים) לחביבות אספקת גלוטמין סריג לבנות בוקטור ביטוי צמח pUTKan. א.ב. ממומן על ידי תכנית studentships עדיפות BBSRC ממוקדת. CK וKP שניהם נתמכים על ידי מלגות RCUK בBiopharmaceuticals עיבוד. CK גם מבקש להודות ביולוגי Lonza לתמיכה הכספית שלהם. המרכז לביולוגיה וחדשנות סינתטיות נתמך בנדיבות על ידי EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
