Summary
Una descrizione di come calibrare trasferimento Förster Resonance Energy sensori biologici integrati (FIBS) per in situ profilo metabolico è presentato. Le FIBS possono essere utilizzati per misurare i livelli intracellulari di metaboliti non invasivo aiutando nello sviluppo di modelli metabolici e high throughput screening delle condizioni bioprocesso.
Abstract
Nell'era della biologia computazionale, i nuovi sistemi sperimentali ad alto rendimento sono necessarie per compilare e perfezionare i modelli in modo che possano essere convalidati a fini predittivi. Idealmente tali sistemi sarebbero basso volume, che preclude campionamento e analisi distruttive quando i dati del corso tempo si vogliono ottenere. Ciò che occorre è un strumento di monitoraggio in situ che possono comunicare le informazioni necessarie in tempo reale e in maniera non invasiva. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo segnalanti concentrazioni intracellulari base di proteine. Una classe particolare di biosensori in vivo che ha trovato applicazioni in metabolita quantificazione si riferiscono al trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) tra due proteine fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET sensori biologici integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare, hanno tempi di risposta veloci e il loro cha spettralestiche variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. In questo documento, il metodo per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per il glucosio e glutammina e calibrare le FIBS in vivo in coltura cellulare in batch per consentire futuro quantificazione della concentrazione di metabolita intracellulare è descritto. I dati di fed-batch colture di cellule CHO dimostra che i FIBS è stato in grado in ogni caso a rilevare il conseguente cambiamento della concentrazione intracellulare. Utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, la concentrazione intracellulare è stata determinata con precisione come confermato mediante saggio enzimatico indipendente.
Introduction
Monitoraggio metabolita ha varie applicazioni in bioprocessi, compreso lo sviluppo di processo, media e il design dei mangimi, e l'ingegneria metabolica. Vari metodi sono disponibili per le misure di concentrazione attraverso l'uso di 1 enzimatica, chimico 2, o saggi di legame 3. Un'opzione interessante è l'uso di fluorescente, sensori biologici in vivo come reporter della concentrazione intracellulare di metaboliti principali a base di proteine. In saggi ultra-basso volume, fluorescenza è uno strumento utile come miniaturizzazione migliora anche il rapporto 4,5 segnale-rumore e sensori a base di proteine può essere geneticamente codificato senso che non reagenti esogeni sono necessari per l'analisi metabolita. Trasferimento Förster Resonance Energy (FRET) biosensori costituiti da due proteine fluorescenti collegati da un dominio di legame al ligando. FRET è un trasferimento nonradiative di energia da un donatore foto-eccitati per un accettore fluorescente molecola Locat Ed in prossimità (<100). Ligando clivaggio o vincolante provoca un cambiamento conformazionale nel sensore, che, a sua volta, induce un cambiamento in prossimità dei fluorofori, portando ad un cambiamento di efficienza FRET misurata dalla variazione dello spettro di emissione. Sensori biologici FRET integrati (FIBS) sono costitutivamente prodotte all'interno della linea cellulare e le loro caratteristiche spettrali variare in funzione della concentrazione del metabolita all'interno della cellula. FIBS hanno tempi di risposta veloci che li rende ideali per prendere le misure per i modelli dinamici 6. Applicazioni precedenti includono il monitoraggio singole 7-9 e più di 10 metaboliti e fornendo dati sulla distribuzione spazio-temporale 11. FIBS possono essere creati in due configurazioni: Apo-Max, dove legame del ligando interrompe la vicinanza dei fluorofori abbassamento trasferimento di energia e Apo-Min, dove legame ligando porta i due fluorofori in più stretto contatto (Figura 1).
_content "> In questo lavoro, un protocollo è presentato per la costruzione di ovaio di criceto cinese (CHO) linee cellulari che esprimono costitutivamente un FIBS per un metabolita, glucosio o glutammina. Una metodologia è stabilito per la calibrazione del sensore in vivo per abilitare futuro quantitativa misure di concentrazione metabolita intracellulare, come illustrato nella figura 2. Sulla base di questo, la concentrazione intracellulare di glucosio o glutammina può essere determinato in fed-batch colture di cellule CHO, a cui i due nutrienti sono stati aggiunti in alte concentrazioni in-process. I risultati dimostrano che utilizzando il segnale fluorescente dalle FIBS e la curva di taratura precedentemente costruita, accuratamente previsione della concentrazione intracellulare è possibile, come confermato mediante saggio enzimatico indipendente. Questo metodo offre notevoli vantaggi rispetto alle attuali tecnologie analitiche perché è invasiva, a basso costo e veloce, dando un segnale in tempo reale dei FIBS che possono essere monitored tutta la cultura.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cella linea Revival e manutenzione
- Revive cellule CHO in 9 ml CD-CHO medio integrato con 8 mM L-glutammina e 10 ml / L integratore 100x ipoxantina / timidina (terreno di coltura completo).
- Centrifugare a 100 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in 10 ml di fresco mezzo di crescita integrale.
- Rimuovere un campione di 1 ml e determinare la concentrazione di cellule vitali mediante microscopio ottico utilizzando il metodo esclusione del colorante blu tripano in un emocitometro.
- Avviare una coltura ad una densità di semina di 3 x 10 5 cellule / ml in 125 ml agitare palloni.
- Mantenere la cultura in un incubatore a 37 ° C, atmosfera umidificata al 5% CO 2, su un agitatore orbitale rotante a 120 rpm.
- Subcuture ogni 3-4 giorni nel mezzo di crescita completo ad una densità di semina di 2 x 10 5 cellule / ml.
2. La trasfezione della linea cellulare con il plasmide Containing il biosensore Gene
- Preparare DNA plasmidico utilizzando un kit di purificazione plasmide larga scala.
- Mantenere celle in condizioni appropriate (37 ° C, 5% CO 2) 12-24 ore prima della trasfezione per garantire le cellule sono attivamente dividono al momento della transfezione.
- Contare le cellule utilizzando il metodo di esclusione del colorante blu tripano, quindi preparare un volume utile di 20 ml di coltura cellulare in un matraccio da 125 ml agitare ad una concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml.
- Utilizzare un kit di transfezione adatto per la linea cellulare in uso. Il DNA plasmidico rapporto reagenti di transfezione sarà dipendente dalla linea cellulare e il vettore. Si raccomanda che questa è ottimizzato testando una serie di rapporti entro l'intervallo specificato dal fabbricante prima di effettuare le trasfezioni finali. Anche mantenere almeno una coltura di controllo negativo contenente le cellule ma non DNA.
- Incubare per 4 giorni in modalità statica e quindi il trasferimento a un Shakipiattaforma ng rotante a 125 rpm.
- Aggiungere l'antibiotico appropriato per la selezione plasmide ad una concentrazione adatta come determinato da una curva uccisione. In questo studio, Zeocin stato aggiunto ad una concentrazione finale di 400 mg / ml per la selezione delle cellule trasfettate.
- Cambiare media a un intervallo di tempo adeguato per la linea cellulare, aggiungendo antibiotici ogni volta, fino a quando le cellule in pozzetto di controllo sono morti.
- Utilizzare i pozzi più confluenti a progredire a scuotere le culture.
- Istituire una banca di cellule congelando le cellule in fiale criogeniche contenenti 10 7 cellule vitali in 1 ml di mix di congelamento. In questo lavoro, questo è costituito da 92,5% mezzo di crescita e 7,5% dimetilsolfossido.
3. Batch e fed-batch curva di crescita cellulare
- Seguire le istruzioni per la manutenzione cella sopra stabilire colture cellulari triplicato di cellule CHO trasfettate in 250 ml agitare beute con un volume utile di 50 ml.
- Mantenere la culres in un incubatore umidificato cella a 37 ° C, con 5% di CO 2, su un agitatore orbitale rotante a 125 rpm, e rimuovere 4,1 ml campioni di ciascuna coltura in crescita ad intervalli di 24 hr.
- Utilizzare 100 ml di campione per determinare la fattibilità di concentrazione cellula e cellula vitale con l'azzurro metodo di esclusione Tripan.
- Ripetere finché la concentrazione di cellule vitali è ridotto a zero.
- Ripetere l'operazione per le colture cellulari fed-batch che completa con la giusta quantità di glucosio o di glutammina il giorno 6 a ripristinare le concentrazioni ai valori iniziali di 36 e 4 mm, rispettivamente. Si raccomanda che colture di controllo aggiuntive sono anche mantenuti, che devono essere alimentati con lo stesso volume (12 ml in questo caso) di acqua pura.
4. FRET Rapporto Misure
- Prendere 2 ml dei campioni giornalieri rimosse al punto 3.2 sopra e centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C.
- Resuspterminato il pellet di cellule in 2 ml di ghiaccio freddo fosfato salino (PBS). Trasferire questa in una piastra da 6 pozzetti e aggiungere il campione in bianco che non contiene cellule ad un pozzetto.
- Misurare i livelli di fluorescenza blu e giallo subito a una lunghezza d'onda di eccitazione di 430/435 nm e di emissione lunghezze d'onda di 465/435 nm (blu) e 520/510 nm (giallo).
- Calcolare i rapporti FRET (rapporto di fluorescenza gialla rilevato sopra fluorescenza blu rilevato).
5. Metabolita Saggi
- Prendere 2 ml dei campioni giornalieri rimosse al punto 3.2 sopra e centrifugare a 100 xg per 5 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet di cellule in 3 ml di PBS freddo ghiaccio e centrifugare di nuovo a 100 xg per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 3 ml di PBS freddo ghiaccio come sopra. Sonicare il 5x campione per 3 minuti ciascuno in un impulso di 15 secondi su e 15 sec off. A questo punto, la cella supplementarects possono essere congelati se lo si desidera.
- Utilizzare un kit di analisi glucosio appropriato secondo le istruzioni del fabbricante su campioni di estratti cellulari per determinare la concentrazione di glucosio intracellulare (vedi tabella dei materiali).
Nota: utilizzare norme adeguate per costruire una curva standard. In questo lavoro, la concentrazione degli standard varia tra 0-100 mm. - Usando le letture per gli standard, costruire la curva standard e trovare l'equazione lineare di best fit (in questo caso: y = 1310.51x - 723,43 dove y è la lettura di assorbanza e x è la concentrazione di glucosio).
- Calcolare le concentrazioni di glucosio utilizzando la curva standard e prendendo la diluizione in considerazione. La concentrazione di glucosio intracellulare può quindi essere calcolato usando questa equazione:
Per le cellule CHO, il volume singola cella è stato calcolato utilizzando una cella diametro di 12 pM 12 - Utilizzare un kit di analisi glutammina appropriato secondo le istruzioni del fabbricante su campioni di estratti cellulari per determinare la concentrazione intracellulare glutammina (vedi tabella dei materiali).
Nota: utilizzare norme adeguate per costruire una curva standard. In questo lavoro, la concentrazione degli standard variava tra 0,2 mm. - Come in 5.5 sopra, la curva di calibrazione (in questo caso y = 203.1x + 17.1 dove y è la lettura dell'assorbanza e x è la concentrazione di glucosio)
- Usando la curva standard, calcolare la concentrazione glutammina dei campioni, tenendo conto della diluizione. La concentrazione intracellulare glutamina può essere calcolato utilizzando l'Equazione 1 di cui sopra.
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Representative Results
Una panoramica della metodologia è presentato in Figura 2. Nel lavoro qui presentato, cellule CHO sono state transfettate con il vettore FIBS e linee cellulari stabili sono stati selezionati con una pressione antibiotico di 400 mcg / ml Zeocin. Due linee separate cellulari stabili esprimenti costitutivamente i sensori di glucosio e glutammina sono stati quindi creati. Figura 1 illustra le configurazioni delle due biosensori utilizzati in questo studio. Il sensore di glucosio si basa sul principio Apo-Max e il plasmide corrispondente è pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Questa è una fusione della proteina fluorescente ciano migliorato (ECFP) e la variante Afrodite della proteina fluorescente gialla migliorato (EYFP) al mutante F16A della E. coli di glucosio / galattosio periplasmatico proteina legante. 11 residui amminoacidici sono stati rimossi dalla regione linker per migliorare l'efficienza FRET 13. Questo vettore è stato clonato nel vettore pCDNA4/TO usando l'unique Eco RI e Pst I siti di restrizione, che utilizza un promotore del citomegalovirus e un esaltatore di SV40.
Il sensore glutammina è basato sul principio Apo-Min (Figura 1) e la corrispondente plasmide è stato derivato da un inserimento della proteina fluorescente giallo citrino in E. periplasmic glutammina coli proteina tra gli amminoacidi 98 e 99 vincolante con un ECFP attaccato al C-terminale. La struttura è stata irrigidita dalla delezione dei residui della regione di collegamento, mentre la D157N sostituzione aminoacidica è stato fatto per la QBP per aumentare l'affinità per la glutammina, seguita da parecchie mutazioni per ottimizzare l'efficienza FRET 8. La glutammina FRET costruire è stato fornito nel pUTKan pianta vettore di espressione ed è stato digerito con Bam HI e Sal I rilasci l'inserto. Quest'ultimo è stato clonato nei corrispondenti siti di restrizione del vettore pET41a in frame con il N-terminale purificazione tags. Lo stesso inserto è stato ligato nel vettore pCDNA4/TO, dopo che era stato digerito con Bam HI e Xho I usando le estremità appiccicose compatibili prodotte da Sal I e Xho I, per produrre il vettore di espressione di mammifero.
Plasmide di espressione è stata confermata da quantificare i livelli di mRNA di biosensori utilizzando qRT-PCR. Entrambi FIBS sono stati trovati per essere trascritto attivamente al 25-44 mRNA copie per cellula assumendo β-actina a 3.000 trascrizioni per cella a livello medio-esponenziale 14.
Overgrow Batch culture di ciascuna linea cellulare sono stati mantenuti tenendo campioni giornalieri per la calibrazione in vivo e ripartiti FIBS. Il profilo di crescita di cellule vitali delle due linee cellulari è mostrata in Figura 3 e le corrispondenti misure FRET e concentrazioni dei metaboliti intracellulari determinata mediante saggi enzimatici sono rappresentati nella Tabella 1. Un lettore di piastre a fluorescenza è stato utilizzato per misurarefluorescenza di campioni a una lunghezza d'onda di eccitazione di 430/35 nm e di emissione lunghezze d'onda di 465/435 nm per ciano e 520/510 nm per il giallo. Si è constatato che il numero di cellule presenti bassi nei primi 4 giorni di coltura hanno determinato segnale FRET inaffidabile. Allo stesso modo, l'alto livello di cellule lisate presente dopo 8 giorni di coltura prodotta una quantità elevata di dispersione della luce. Solo i dati per i giorni 4-8 è quindi utilizzato per costruire le curve di calibrazione per la FIBS glucosio e glutammina, le equazioni per le quali sono riportati nella tabella 1. I risultati mostrano che il segnale FIBS produce una correlazione affidabile con le concentrazioni intracellulari tra 1-5 mm per il glucosio e 0,3-2 mM di glutammina.
A seguito di questo e per validare le conclusioni di cui sopra, fed-batch overgrow sono state eseguite le culture delle due linee cellulari. Un mangimi contenenti concentrazione del substrato alta (glucosio nel caso delle FIBS glucosio e glutammina nel caso dei FIBS glutammina) è stata integratail giorno 6 della coltura cellulare per elevare le concentrazioni extracellulari del substrato. Nel caso della cultura glucosio-fed la concentrazione di glucosio extracellulare è stato incrementato sino a 36 mm, mentre per la cultura glutammina-fed, la concentrazione di glutammina è stata aumentata a 4 mM. Figura 4 illustra risultati rappresentativi di questo studio. Figure 4A e 4C raffigurano i rapporti tasto sulla ogni giorno, che rispondono chiaramente alimentazione invertendo la tendenza hanno seguito fino al giorno 6. In particolare, nella Figura 4A, il rapporto FRET per il glucosio FIBs linea cellulare CHO diminuisce il giorno 7 in risposta al glucosio Inoltre, poiché i FIBS glucosio segue la configurazione APO-On. Analogamente, nella Figura 4C, il rapporto FRET per la glutammina FIBs linea cellulare CHO aumenta in risposta a glutammina Inoltre, in linea con il principio di sensori Apo-Off.
Queste misurazioni FRET stati infine usati per calcUlate corrispondente concentrazione di glucosio e glutammina intracellulari base delle curve di taratura suddetti ei risultati sono mostrati in Figura 4B per il glucosio e Figura 4D per la glutammina. Essi sono confrontati con le concentrazioni intracellulari reali di questi substrati, come stabilito con il glucosio e dosaggi enzimatici glutammina e mostra un adeguato accordo.
.. Tabella 1 Risultati per in vivo calibrazione del rapporto FRET per il glucosio e glutammina FIBS Le curve di taratura sono descritti dalle seguenti equazioni che possono essere utilizzati per fare previsioni: y =-1.232x + 8,034 per il glucosio (R 2 = 0,961), ey = 1.892x + 0.332 per la glutammina (R 2 = 0,879), dove y è il rapporto FRET e x è la concentrazione in mm.
Figura 1. Principi delle FIBS utilizzati in questo studio. FIBS glutammina (sinistra) segue il principio Apo-Min, da cui glutammina lega ai domini di rilevamento e genera un cambiamento conformazionale che porta entrambe le proteine fluorescenti più vicini, aumentando così FRET. I FIBS glucosio (destra) segue il principio Apo-Max, da cui il glucosio si lega al dominio di rilevamento e genera un cambiamento conformazionale che separa le proteine fluorescenti, diminuendo così FRET.
Figura 2. Panoramica della metodologia per la calibrazione FIBS e la successiva quantificazione non invasiva del glucosio intracellulare e le concentrazioni di glutammina.
Figura 3. Profilo di concentrazione di cellule vitali per la partita invadere culture di FIBS-glucosio e glutammina FIBS-esprimono linee cellulari CHO (n = 2 ripetizioni biologici con tre misurazioni per ogni linea cellulare).
Figura 4. Cultura lotto Fed FIBS-produzione di cellule CHO e le corrispondenti misure di FRET. (A) Giornaliero measurements del rapporto di FRET di fed-batch colture di cellule CHO esprimenti FIBS glucosio. La freccia indica l'aggiunta di glucosio per la coltura cellulare. (B) un profilo di concentrazione di glucosio intracellulare effettiva misurata usando un kit di analisi glucosio contro valori di predizione in base in vivo curva di calibrazione glucosio (Tabella 1). (C) misurazioni giornaliere del rapporto FRET di fed-batch colture di cellule CHO che esprimono FIBS glutammina. La freccia indica l'aggiunta di glutammina per la coltura cellulare. (D) un profilo di concentrazione intracellulare glutammina effettiva misurata usando un kit di analisi glutammina contro valori predetti sulla base in vivo curva di calibrazione glutammina (Tabella 1). In tutti i casi, n = 2 ripetizioni biologici con tre misurazioni per linea cellulare.
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Discussion
Le FIBS permettono in vivo e in situ quantificazione di molecole chiave, in questo caso nutrienti crescita limitativo, eliminando incertezze derivanti da tempra e metodi di estrazione. I risultati suggeriscono che vi è una buona correlazione tra il segnale FIBS e le concentrazioni intracellulari nell'intervallo 1-5 mM di glucosio e 0,3-2 mM di glutammina. Nel lotto coltura cellulare CHO, queste concentrazioni si incontrano nelle fasi di declino esponenziale, stazionarie, e le prime. Le fasi esponenziali e stazionarie sono le più critiche in termini di progettazione di strategie di alimentazione appropriati; l'uso di questi biosensori per stimare le necessità metaboliche delle cellule è quindi di interesse industriale. I risultati dell'esperimento fed-batch confermano l'idoneità dei FIBS 'di fornire stime di glucosio intracellulare e le concentrazioni di glutammina. Deviazioni esposti a precedenti punti di tempo sono sorti a causa del basso numero di cellule vitalibri e / oa causa di interferenze da altri metaboliti, ad esempio da galattosio nel caso delle FIBS glucosio, e da altri aminoacidi nel caso delle FIBS glutammina. In particolare, è stato dimostrato che una riduzione fino al 20% del rapporto FRET può verificare in presenza di aspartato, glutammato, glicina, treonina, valina, tirosina e 15. Nel complesso, questi risultati suggeriscono che errore nel segnale FIBS è piuttosto bassa.
Sebbene questa metodologia può monitorare solo un numero limitato di molecole alla volta, può fornire informazioni utili per la linea cellulare e processo di sviluppo, o anche di acquisizione dati per la validazione di modelli matematici. Data la diversità delle proteine leganti periplasmatiche, biosensori analoghe possono essere sviluppate per una serie di piccole molecole compresi gli altri amminoacidi, zuccheri e ioni come solfato e fosfato 16, rendendo questo un metodo versatile per il metabolita quantificazione in tempo reale in cellule viventi .
Uno dei principali vantaggi dell'uso di FIBS è la capacità di ottenere misurazioni online potenzialmente in modo continuo. Il metodo si presta quindi per applicazioni ad elevato throughput che può ridurre la movimentazione manuale e accelerare gli sforzi di sviluppo. Con la maggiore disponibilità di ambienti microreattore con funzionalità incorporata per il rilevamento della fluorescenza, si prevede che un metabolita FIBS abilitato piattaforma profilatura può essere utilizzato per lo screening delle cellule, media e ottimizzazione dei processi, e processo di scale-up.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il professor Lupo Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) per averci gentilmente fornito con il glucosio FRET plasmide e il Dr. Uwe Ludewig (Hohenheim University) per fornire gentilmente la glutammina FRET costrutto nel pUTKan pianta vettore di espressione. AB è finanziato dal programma di Borse di studio prioritari BBSRC mirata. Sia CK e KP sono supportati da RCUK Borse in Biopharmaceuticals Processing. CK desidera inoltre ringraziare Lonza Biologics per il loro sostegno finanziario. Il Centro per la biologia sintetica e l'innovazione è generosamente supportato dal EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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