Summary
如何在原位代谢轮廓校正共振能量转移集成生物传感器（FIBS）用于描述呈现。该FIBS可用于测量非侵入性代谢物辅助的代谢模式和生物过程条件的高通量筛选的发展的细胞内水平。
Abstract
在计算生物学的时代，新的高通量实验系统是必要的，以便填充和完善的模型，使他们能够进行预测进行验证。理想的情况是这样的系统将是低量，这就排除了采样和破坏性的分析时，时间过程的数据将被获取。所需要的是一种在原位监测工具，它可以在实时和非侵入性地报告必要的信息。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为细胞内浓度的记者。已经发现应用中代谢物的定量一个特定类的体内生物传感器是基于共振能量转移（FRET）的配体结合结构域连接的两个荧光蛋白之间。 FRET集成生物传感器（FIBS）细胞系中都产生组成，他们有快速的响应时间和他们的茶谱根据代谢物在细胞内的浓度特性的研究改变。在本文中，该方法用于构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为葡萄糖和谷氨酰胺和校准体内批次细胞培养物中FIBS以使胞内代谢物浓度的将来量化进行说明。从进料 - 分批的CHO细胞培养数据表明，FIBS能够在每种情况下，检测在细胞内的浓度所产生的变化。使用从FIBS和先前构建的校准曲线的荧光信号，细胞内浓度，精确地确定所确认的独立酶法测定。
Introduction
代谢物监测在生物加工各种应用，包括工艺开发，媒体和饲料的设计，以及代谢工程。各种方法可用于浓度测量通过使用酶1，化学2，或结合试验3。一个有趣的选项是使用荧光，蛋白质为基础的体内生物传感器作为关键代谢产物的细胞内浓度的记者。在超低量测定法，荧光是一种方便的工具，如小型化实际上是改善了信号-噪声比4,5和蛋白为基础的传感器可遗传编码的意义，没有外源试剂是必需的代谢物的分析。福斯特共振能量转移（FRET）生物传感器包括一个配体结合域连接的两个荧光蛋白。 FRET是能量从光激发捐助者的一个非辐射转移到受体荧光分子要价较高，编接近（<100）。配体的裂解或结合引起的构象变化的传感器，其中，反过来，诱导的荧光基团的接近而变化，导致通过在发光光谱的变化测定FRET效率的变化。 FRET集成生物传感器（FIBS）的细胞系中是组成型产生的和它们的光谱特性改变的基础上代谢物在细胞内的浓度。 FIBS具有快速响应时间使它们非常适合进行测量的动态模型6。以前的应用包括监测单7-9和10多个代谢物，以及提供有关时空分布11个数据。载脂蛋白最大，其中配体结合打乱降低能量传递和载脂蛋白民，其中配体结合所带来的两个荧光基团成更紧密的接触（ 图1）的荧光团的接近：FIBS可以在两种配置中创建。
_content“>在这项工作中，一个协议，提出构建中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系中是组成型表达一个FIBS为代谢物，葡萄糖或谷氨酰胺，一种方法是建立在传感器体 内的校准，以使将来的定量胞内代谢物浓度的测量，如示于图2。基于此，葡萄糖或谷氨酰胺的细胞内浓度可在补料分批的CHO细胞培养物测定中，向其中两种养分中加入高浓度的过程，其结果证明由FIBS和先前构建的校准曲线使用的荧光信号，准确预测细胞内浓度是可能的，并经一个独立的酶法测定，该方法提供了超过当前的分析技术显着的优点，因为它是无创的，低成本的快，给，可在星期一FIBS的实时信号itored整个文化。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1。细胞系的复兴和维护
- 恢复在补充有8 2mM L-谷氨酰胺和10ml / L的100倍的次黄嘌呤/胸苷补充物（完全培养基）9毫升的CD-CHO培养基中的CHO细胞。
- 离心机在100×g离心5分钟。
- 重悬在10毫升新鲜的完全生长培养基中的细胞。
- 取出1ml样品，用光学显微镜测定的活菌浓度使用台盼蓝染料排除法用血细胞计数。
- 启动培养以3×10 5细胞/在125毫升毫升的接种密度摇瓶。
- 维持培养在培养箱中在37℃，5％CO 2的潮湿气氛中，在轨道摇动平台旋转在120rpm上。
- 继代培养，每3-4天在完全生长培养基中以2×10 5细胞/ ml的接种密度。
2。该细胞株与质粒的C转染ontaining的基因生物传感器
- 使用大规模的质粒纯化试剂盒制备的质粒DNA。
- 维持细胞在适当的条件下（37℃，5％CO 2）的12-24小时转染前，以确保细胞活跃分裂在转染时。
- 使用台盼蓝染料排除方法计数细胞，然后制备20 ml的细胞培养物中加入125ml工作体积摇瓶中以1×10 6个细胞/ ml的浓度。
- 使用合适的转染试剂盒中使用的细胞系。质粒DNA转染试剂的比例将依赖于细胞系和载体。值得推荐，这是通过测试的范围由制造商进行的最终转染前规定的范围内的比率的最优化。还维持含有细胞，但没有DNA的至少一个阴性对照的文化。
- 孵育在静态模式下4天，然后转移到一个夏奇纳克平台转速为125转每分钟。
- 添加适当的抗生素进行质粒选择到合适的浓度为通过杀灭曲线来确定。在这项研究中，硫酸博来霉素加至400微克/毫升供选择转染的细胞的终浓度。
- 在该细胞系的适当时间间隔改变介质，抗生素每次添加，直到细胞中控制以及已经死亡。
- 用最汇合井进步到颤抖的文化。
- 冻结的细胞中含有10 7活菌1毫升冷冻混合冻存管建立细胞库。在这项工作中，这是由92.5％的生长培养基和7.5％二甲亚砜。
3。批次和补料分批细胞生长曲线
- 遵循用于细胞维持上述说明，建立转染的CHO细胞在250毫升的一式三份细胞培养摇瓶中的50毫升的工作容积。
- 保持丘尔清晰度，在湿润的细胞培养箱中，在37℃，5％的CO 2，在轨道摇动平台旋转125转，并从每个生长培养除去4.1毫升样品在24小时的时间间隔。
- 用100微升的样品，以确定与台盼蓝染料排斥法的活细胞浓度和细胞活力。
- 重复，直到活细胞的浓度降低至零。
- 重复分批补料细胞培养与补充葡萄糖或谷氨酰胺在第6天的适量恢复其浓度为36毫米和4毫米它们的初始值，分别为。建议额外的控制培养物也保持，这是与纯水的相同体积（12毫升这种情况下）被输送。
4。 FRET比率测量
- 取2毫升每日样品除去在上面的步骤3.2和离心机在100×g离心5分钟，在4℃下
- Resusp在2ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中的止细胞沉淀。转移到这一个6孔板和不含细胞的空白样品加至一个阱。
- 紧接在四百三十五分之四百三十nm，发射四百三十五分之四百六十五纳米（蓝色）和五百十分之五百二十零纳米（黄色）的波长的激发波长测量的蓝色和黄色的荧光水平。
- 计算FRET比率（检测过检测蓝色荧光黄色荧光的比值）。
5。代谢产物的测定
- 取2毫升每日样品除去在上面的步骤3.2和离心机在100×g离心5分钟，在4℃下除去上清液。
- 再次重悬细胞沉淀在3毫升冰冷的PBS和离心机在100×g离心5分钟。
- 去除上清，重悬细胞沉淀在3毫升冰冷的PBS如上。超声处理的样品5倍的每个3分钟，在15秒的脉冲和15秒关闭。在这一点上，所述细胞额外如果需要的话仙可能会被冻结。
- 使用适当的葡萄糖测定试剂盒按照制造商的关于细胞提取物的样品的指示，以确定细胞内的葡萄糖的浓度（见表材料）。
注意：使用适当的标准来建立标准曲线。在这项工作中，标准的浓度0-100毫米之间不等。 - 使用读数为标准，构建标准曲线，并找到最佳拟合的线性方程（在这种情况为：y = 1310.51x - 723.43其中y为吸光度读数和x是葡萄糖浓度）。
- 利用标准曲线，并采取稀释考虑在内计算的葡萄糖浓度。细胞内的葡萄糖浓度然后可以使用这个公式计算：
对于CHO细胞，单细胞的体积，用12μM12上的泡孔直径计算 - 使用适当的谷氨酰胺测定试剂盒按照制造商的关于细胞提取物的样品的指示，以确定细胞内的谷氨酰胺浓度（见表材料）。
注意：使用适当的标准来建立标准曲线。在这项工作中，标准的浓度为0-2毫米之间。 - 如在5.5以上，构建校准曲线（在这种情况下，y = 203.1x + 17.1其中y是吸光度读数和x是葡萄糖浓度）
- 利用标准曲线，计算出样品的谷氨酰胺浓度，取稀释考虑在内。细胞内谷氨酰胺浓度可以使用公式1以上计算。
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Representative Results
该方法的概述示于图2。在这里提出的工作，CHO细胞用的FIBS载体和稳定细胞系，在400微克/毫升硫酸博来霉素的抗生素压力被选定。两个独立的稳定细胞系组成性表达的葡萄糖和谷氨酰胺的传感器因此被创建。 图1描述了在本研究中使用的生物传感器2的配置。葡萄糖传感器是基于载脂蛋白 - 最大原理和相应的质粒是PRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite。这是一种融合增强型青色荧光蛋白（ECFP）和增强型黄色荧光蛋白（EYFP）的阿芙罗狄蒂变到E的F16A突变大肠杆菌葡萄糖/半乳糖周质结合蛋白。从接头区域中除去11个氨基酸残基，以提高荧光共振能量转移效率13。使用uniq这个载体被克隆到载体pCDNA4/TOUE 的EcoRⅠ和Pst I限制性位点，其中用到了巨细胞病毒启动子和SV40增强子。
谷氨酰胺传感器是基于载脂蛋白敏原理（ 图1）和相应的质粒来自黄色荧光蛋白柠檬色的插入到大肠杆菌大肠杆菌谷氨酰胺周质结合氨基酸98和99之间的蛋白质与连接到C-末端的ECFP。该结构已硬化的缺失残基的连接区，而氨基酸取代D157N已向该QBP增加谷氨酰胺亲 和力，随后几个突变来优化FRET效率8。谷氨酰胺FRET构造在pUTKan植物表达载体的供给，并用Bam HI消化和SalⅠ释放插入件。后者克隆到载体pET41a的相应限制性位点在帧与N-末端纯化吨AGS。相同的插入片段连接到载体pCDNA4/TO，之后它使用由SalⅠ和XhoⅠ位产生的相容的粘性末端，产生了哺乳动物表达载体已用Bam HI消化和Xho I。
质粒表达，用定量实时荧光定量PCR检测的生物传感器的mRNA水平证实。发现这两个FIBS能够积极转录在每个细胞25-44 mRNA拷贝数假设β-肌动蛋白在每个小区3000转录物在指数中期的水平14。
批次长满每个细胞系的培养物保持每日服用样品用于体内校准每个FIBS的。两种细胞系中的活细胞的生长曲线示于图3和相应的FRET测定和胞内代谢物的浓度通过酶测定法测定列于表1中 。的荧光读板仪来测量样品在荧光的四百三十五分之四百六十五纳米的青色和五百十分之五百二十○纳米的黄色35分之430nm，发射波长的激发波长。结果发现，目前在第4天的文化低细胞数导致不可靠的FRET信号。同样，电池的高层次培养8天之后lysated本生成量高的光散射。为4-8天仅数据，因此用来构造校准曲线的葡萄糖和谷氨酰胺FIBS，方程的量示于表1中 。该结果表明，该FIBS信号产生具有1-5毫米之间的胞内浓度为葡萄糖和0.3-2mm的谷氨酰胺一个可靠的相关性。
以下这一点，以验证上述发现，补料分批长满了两种细胞系的培养物进行的。含有高浓度的底物（葡萄糖在葡萄糖FIBS和谷氨酰胺在谷氨酰胺FIBS的情况的情况下），饲料中补充在细胞培养物，以提高胞外浓度基板的第6天。在葡萄糖补料培养的情况下，细胞外葡萄糖浓度增加回升到36毫米，而对于谷氨酰胺馈培养，谷氨酰胺浓度增加至4毫米， 图4示出了从本研究的代表性结果。 图4A和4C描绘的FRET比率上的每一天，这清楚地扭转他们随访至6日的走势来饲养回应。具体地，在图4A中 ，FRET比率为葡萄糖的FIB响应于7天的CHO细胞系降低葡萄糖此外，由于葡萄糖FIBS如下的APO-开配置。同样，在图4C中，FRET比率为谷氨酰胺的FIB的CHO细胞系的增加响应于谷氨酰胺此外，在与载脂蛋白-关传感器的原理一致。
这些FRET测量终于用为钙乌拉特对应基于上述校正曲线，结果细胞内葡萄糖和谷氨酰胺的浓度示于图4B为葡萄糖和图4D为谷氨酰胺。他们相比，这些基片，其确定为与葡萄糖和谷氨酰胺酶测定，并显示适当的协议的实际细胞内浓度。
。表1的结果， 在体内校准的FRET比率为葡萄糖和谷氨酰胺FIBS该校准曲线是由下面的等式可用于进行预测描述为：y =-1.232x + 8.034葡萄糖（R 2 = 0.961），和y = 1.892x + 0.332谷氨酰胺（R 2 = 0.879），其中y是FRET比率x为浓度以mM。
图1本研究中使用的FIBS原理。谷氨酰胺FIBS（左）所示的载脂蛋白敏原理，其中谷氨酰胺结合到感测结构域和生成的构象转变，使两个荧光蛋白更接近在一起，从而增加了荧光共振能量转移。葡萄糖FIBS（右）所示的载脂蛋白-最大值原理，其中葡萄糖结合到传感领域，并产生分离的荧光蛋白，从而降低FRET的构象变化。
对于批次图3。活细胞浓度分布长满葡萄糖FIBS-谷氨酰胺和FIBS表达CHO细胞系（n = 2的生物学重复，每个细胞系的三个测量值）的培养物。
图4。 FIBS的CHO细胞和相应的FRET测量的补料分批培养。（a）每天我的表达葡萄糖FIBS补料分批的CHO细胞培养物的FRET比率asurements。箭头指示增加的葡萄糖向细胞培养。使用抗值的葡萄糖测定试剂盒（二）实际的细胞内葡萄糖浓度分布预测的基础， 在体内葡萄糖校准曲线（ 表1）上。 （三 ）的表达谷氨酰胺FIBS补料分批的CHO细胞培养物的FRET比率每日测量。箭头指示增加谷氨酰胺的细胞培养。使用抗值的谷氨酰胺测定试剂盒（四）实际细胞内谷氨酰胺浓度分布的预测基于在体内谷氨酰胺校准曲线（ 表1）上。在所有情况下，N = 2的生物学重复，每个细胞株三种测量。
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Discussion
该FIBS使在体内和关键分子原位定量，在这种情况下生长限制性营养物质，除去从淬火和提取方法所产生的不确定性。调查结果表明，有在FIBS信号和细胞内浓度在1-5毫米的范围内葡萄糖和0.3-2mm的谷氨酰胺之间的良好关系。在批量的CHO细胞培养中，这些浓度中的指数，固定的，并且早下降阶段遇到的问题。该指数相和固定相是最关键的适宜喂养策略的设计方面，因此使用这些生物传感器来估计细胞的代谢要求，是工业相关。补料分批实验的结果证实了FIBS是否适合提供细胞内的葡萄糖和谷氨酰胺浓度的估计。展出的偏差在较早的时间点可能已经出现，因为较低的活菌数的BER因为通过其他代谢物， 例如 ，通过半乳糖中的葡萄糖FIBS的情况下，并通过在谷氨酰胺FIBS的情况下，其他氨基酸的干扰和/或。具体地，它已经表明，高达20％的FRET比率的降低可能发生在天冬氨酸，谷氨酸，甘氨酸，苏氨酸，缬氨酸和酪氨酸15的存在。总体而言，这些结果表明在FIBS信号误差是相当低的。
虽然这种方法只能监视分子的数目有限的时间，它可以提供有用的信息，供细胞系和工艺开发，或什至数据采集为数学模型的验证。给定的周质结合蛋白的多样性，相似的生物传感器可以用于阵列为小分子，包括其它氨基酸，糖，和离子如硫酸根和磷酸根16进行开发，在活细胞使得这对代谢物的定量一种通用方法，在实时。
使用FIBS中的一个关键好处是能够以连续的方式可能获得的在线测量。因此，该方法随后又于高通量应用，可减少人工搬运，加快发展的努力。用微反应器的环境以用于荧光检测的内置功能的增加的可用性，可以设想，一个FIBS功能的代谢物分析平台，可用于筛选细胞，介质和工艺优化和工艺按比例放大。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢狼Frommer教授（卡内基科学研究所，斯坦福大学）的好心为我们提供的葡萄糖FRET质粒和乌韦Ludewig博士（霍恩海姆大学）的亲切供应谷氨酰胺FRET构建在pUTKan植物表达载体。 AB公司是由BBSRC针对性的优先级奖学金计划提供资金。既CK和KP是由英国研究理事会奖学金的生物制药工艺的支持。 CK还要感谢龙沙生物提供财政支持。该中心为合成生物学与创新是慷慨由EPSRC支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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