Summary
En beskrivelse af, hvordan du kalibrerer Förster Resonance Energy Transfer integrerede biologiske sensorer (FIBS) til in situ metabolisk profilering præsenteres. FIBS kan anvendes til at måle intracellulære niveauer af metabolitter noninvasively medvirken i udviklingen af metaboliske modeller og high throughput screening af biologisk proces betingelser.
Abstract
I en tid med bioinformatik, er nødvendigt med nye high throughput eksperimentelle systemer for at befolke og forfine modeller, så de kan valideres for prognoser. Ideelt set ville sådanne systemer være lav volumen, hvilket udelukker prøvetagning og destruktive analyser, når tiden kursus data skal opnås. Der er behov for en in situ overvågning værktøj, der kan indberette de nødvendige oplysninger i realtid og non-invasivt. En interessant mulighed er brugen af fluorescerende protein-baserede in vivo biologiske sensorer som indberettere af intracellulære koncentrationer. En særlig klasse af in vivo-biosensorer, der har fundet anvendelser metabolit kvantificering er baseret på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellem to fluorescerende proteiner forbundet med et ligandbindingsdomæne. FRET integrerede biologiske sensorer (FIBS) er konstitutivt produceres i cellen linje, de har hurtige svartider og deres spektrale characteristics ændre baseret på koncentrationen af metabolitten i cellen. I dette papir, er fremgangsmåden til konstruktion af kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellelinier, som konstitutivt udtrykker en FIBS for glucose og glutamin og kalibrere FIBS in vivo i batch cellekultur for at muliggøre fremtidig kvantificering af intracellulært metabolitkoncentrationen beskrevet. Data fra fed-batch-CHO cellekulturer viser, at de FIBS var i stand til i hvert enkelt tilfælde registrerer den deraf følgende ændring i den intracellulære koncentration. Ved hjælp af fluorescerende signal fra FIBS og den tidligere konstrueret kalibreringskurve blev den intracellulære koncentration bestemmes nøjagtigt som bekræftet af en uafhængig enzymatisk assay.
Introduction
Metabolite overvågning har forskellige formål i bioforarbejdning, herunder udvikling af processen, medier og design foder og metabolic engineering. Forskellige fremgangsmåder er tilgængelige for koncentrationsmålinger ved brug af enzymatiske 1, kemiske 2 eller bindingsassays 3. En interessant mulighed er brugen af fluorescerende protein-baserede in vivo biologiske sensorer som indberettere af den intracellulære koncentration af vigtige metabolitter. I ultralav volumen assays, fluorescens er et praktisk værktøj som miniaturisering faktisk forbedrer signal-til-støj-forhold 4,5 og protein-baserede sensorer kan være genetisk kodet således, at ingen exogene reagenser er nødvendige for metabolit-analyse. Forster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensorer består af to fluorescerende proteiner forbundet med et ligandbindingsdomæne. FRET er en nonradiative overførsel af energi fra et foto-exciterede donor til en acceptor fluorescerende molekyle Statusmeddelelse ed i umiddelbar nærhed (<100). Ligand spaltning eller binding forårsager en konformationsændring i sensoren, hvilket igen inducerer en ændring i nærheden af de fluoroforer, fører til en ændring i FRET effektivitet målt ved ændringen i emissionsspektret. FRET integrerede biologiske sensorer (FIBS) er konstitutivt produceres i cellen linje og deres spektrale egenskaber ændres baseret på koncentrationen af metabolitten i cellen. FIBS har hurtige svartider gør dem ideelle til at tage målinger for dynamiske modeller 6. Tidligere ansøgninger omfatte overvågning single 7-9 og flere 10 metabolitter og leverer data om Spatiotemporal fordeling 11. Kan oprettes FIBS i to konfigurationer: Apo-Max, hvor ligandbinding forstyrrer nærhed fluorophorerne sænke energioverførsel og Apo-Min, hvor ligandbinding bringer de to fluoroforer i tættere kontakt (Figur 1).
_content "> I dette arbejde, er en protokol fremlægges til konstruktion kinesisk hamster ovarie (CHO) cellelinier, der konstitutivt udtrykker en FIBS for en metabolit, glucose eller glutamin. En metode etableres til kalibrering af sensoren in vivo for at muliggøre fremtidig kvantitativ målinger af intracellulære metabolit koncentration, som beskrevet i figur 2.. Baseret på dette, den intracellulære koncentration af glukose eller glutamin kan bestemmes i fed-batch-CHO cellekulturer, som de to næringsstoffer blev tilføjet i høje koncentrationer i-proces. Resultaterne vise, at du bruger det fluorescerende signal fra FIBS og den tidligere konstrueret kalibreringskurven præcist forudsigelse af den intracellulære koncentration er mulig, som bekræftet af en uafhængig enzymatisk assay. Denne metode giver betydelige fordele i forhold til de nuværende analytiske teknologier, fordi det er non-invasiv, lave omkostninger og hurtig, hvilket giver en real-time signal for FIBS der kan være monitored hele kulturen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Cellelinje Revival og vedligeholdelse
- Genoplive CHO celler i 9 ml CD-CHO medium suppleret med 8 mM L-glutamin og 10 ml / L 100x hypoxanthin / thymidin supplement (komplet vækstmedium).
- Centrifuger ved 100 xg i 5 min.
- Resuspender cellerne i 10 ml frisk komplet vækstmedium.
- Fjern en 1 ml prøve og bestemme den levedygtige cellekoncentration ved lysmikroskopi under anvendelse af trypanblåt-farveeksklusion metode i et hæmocytometer.
- Indled en kultur på en podningstæthed på 3 x 10 5 celler / ml i 125 ml rystekolber.
- Opretholde kulturen i en inkubator ved 37 ° C, en befugtet atmosfære af 5% CO2 på en orbital rystebord, der roterer med 120 omdrejninger pr.
- Subkultur hver 3-4 dage i komplet vækstmedium ved en podningstæthed på 2 x 10 5 celler / ml.
2. Transfektion af cellelinjen med Plasmid Containing biosensor Gene
- Forbered plasmid-DNA ved hjælp af et stort plasmid oprensningskit.
- Oprethold celler ved passende betingelser (37 ° C, 5% CO 2) 12-24 timer før transfektion at sikre cellerne deler sig aktivt på tidspunktet for transfektion.
- Tæl celler under anvendelse af trypanblåt-farveeksklusion metode, så forberede et arbejdsvolumen på 20 ml cellekultur i en 125 ml rystekolbe i en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml.
- Anvend en egnet transfektion kit til cellelinie i brug. Plasmid-DNA'et transfektionsreagenser ratio vil være afhængig af cellelinien og vektor. Det anbefales, at dette er optimeret ved at teste en række af nøgletal inden for det område, som fabrikanten før udførelse af de endelige transfektionerne. Også opretholde mindst én negativ kontrol-kultur indeholdende de celler, men intet DNA.
- Inkuberes i 4 dage i statisk tilstand, og derefter overføre til en Shaking platformen roterer ved 125 rpm.
- Tilsæt passende antibiotika plasmid markering til en passende koncentration som bestemt ved en drabskurve. I denne undersøgelse blev zeocin tilsat til en slutkoncentration på 400 ug / ml til selektion af transficerede celler.
- Skift medier på et passende tidsinterval for cellen og tilføje antibiotika hver gang, indtil celler i kontrol vel være døde.
- Brug de mest sammenflydende brønde at gå videre til at ryste kulturer.
- Etablere en celle bank ved at fryse cellerne i kryogene hætteglas indeholdende 10 7 levedygtige celler i 1 ml fryse mix. I dette arbejde, dette består af 92,5% vækstmedium og 7,5% dimethylsulfoxid.
3. Batch og Fed-batch Cell Growth Curve
- Følg instruktionerne for celleopretholdelse ovenfor for at etablere tredobbelte cellekulturer af de transficerede CHO-celler i 250 ml rystekolber med en fungerende volumen på 50 ml.
- Fastholde kultures i en befugtet celle inkubator ved 37 ° C med 5% CO 2, på en orbital rystebord, som roterer ved 125 rpm og fjerne 4,1 ml prøver fra hvert voksende kultur ved 24 timers intervaller.
- Brug 100 pi af prøven for at bestemme det levedygtige cellekoncentration og cellelevedygtighed med trypan blåt farveeksklusion metode.
- Gentag, indtil levedygtige cellekoncentration er reduceret til nul.
- Gentag for fed-batch cellekulturer supplere med den passende mængde af glucose eller glutamin på dag 6 til at genoprette deres koncentrationer til deres oprindelige værdier af 36 mM, og 4 mM. Det anbefales, at yderligere kontrolkulturer ligeledes opretholdes, som skal tilføres med det samme volumen (12 ml i dette tilfælde) af rent vand.
4.. FRET Ratio Målinger
- 2 ml af de daglige prøver, der blev fjernet i trin 3.2 ovenfor og centrifuger ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspsluttede cellepelleten i 2 ml iskold phosphatpufret saltvand (PBS). Overfør dette i en 6-brønds plade og tilføje en blindprøve indeholdende ingen celler til en brønd.
- Måle indholdet af blå og gul fluorescens umiddelbart ved en excitationsbølgelængde på 430/435 nm og emission bølgelængder på 465/435 nm (blå) og 520/510 nm (gul).
- Beregn FRET nøgletal (forholdet mellem gul fluorescens detekteret over blå fluorescens registreret).
5.. Metabolite Analyser
- 2 ml af de daglige prøver, der blev fjernet i trin 3.2 ovenfor og centrifuger ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C. Supernatanten fjernes.
- Resuspender cellepelleten i 3 ml iskold PBS og centrifugeres igen ved 100 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspender cellepelleten i 3 ml iskold PBS som ovenfor. Sonikeres prøven 5x i 3 minutter hver ved en impuls af 15 sek, og 15 sek slukket. På dette tidspunkt cellen ekstracts kan fryses, hvis det ønskes.
- Anvend et egnet glucose assaykit i henhold til fabrikantens anvisninger på prøver af celleekstrakter at bestemme den intracellulære glucosekoncentration (se tabel af materialer).
Bemærk: Brug passende standarder til at konstruere en standardkurve. I dette arbejde, koncentrationen af standarder lå mellem 0-100 mM. - Ved hjælp af målingerne for de standarder, konstruere standardkurven og finde den lineære ligning af bedste pasform (i dette tilfælde: y = 1310.51x - 723,43 hvor y er absorbansen læsning og x er glukose koncentration).
- Beregn glucosekoncentrationer ved hjælp af standardkurven og under fortynding i betragtning. Den intracellulære glucosekoncentrationen kan derefter beregnes ved hjælp af denne ligning:
For CHO-celler blev cellevolumen enkelt beregnes ved hjælp af en celle diameter på 12 uM 12 - Anvend et egnet glutamin assay kit ifølge producentens anvisninger på prøver af celleekstrakter at bestemme den intracellulære glutaminkoncentration (se tabel af materialer).
Bemærk: Brug passende standarder til at konstruere en standardkurve. I dette arbejde, at koncentrationen af standarder varierede mellem 0-2 mM. - Som i 5.5 ovenfor, fremstilling af kalibreringskurven (i dette tilfælde y = 203.1x + 17,1 hvor y er absorbansen læsning og x er glukose koncentration)
- Ved hjælp af standardkurven beregnes glutaminkoncentration af prøverne, idet fortyndingen i betragtning. Den intracellulære glutaminkoncentration kan beregnes ved brug af ligning 1 ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversigt over den metode er vist i figur 2.. I arbejdet præsenteret heri, blev CHO-celler transficeret med FIBS vektor og stabile cellelinjer blev selekteret på et antibiotikum tryk på 400 ug / ml zeocin. To separate stabile cellelinier konstitutivt udtrykker glucose og glutamin sensorer blev derfor oprettet. Figur 1 viser forskellige konfigurationer af de to biosensorer anvendt i denne undersøgelse. Glukosesensoren er baseret på Apo-Max princip og det tilsvarende plasmid pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Dette er en fusion af den forbedrede cyan fluorescerende protein (ECFP) og Afrodite variant af forstærket gult fluorescerende protein (EYFP) til F16A mutant af E. coli glucose / galactose periplasmiske bindende protein. 11 aminosyrerester blev fjernet fra linker-regionen til at forbedre FRET effektivitet 13. Denne vektor blev klonet ind i vektoren under anvendelse pCDNA4/TO unique EcoRI og PstI restriktionssteder, som bruger en cytomegalovirus-promotor og en SV40-enhanceren.
Glutamin Føleren er baseret på Apo-Min princip (figur 1), og det tilsvarende plasmid blev afledt fra en indføring af gult fluorescerende protein citrin i E. coli glutamin periplasmiske protein mellem aminosyrerne 98 og 99 med en ECFP bundet til C-terminalen. Strukturen er blevet afstivet ved deletion af rester i forbinder området, mens aminosyresubstitution D157N er blevet gjort til QBP at øge affinitet for glutamin, efterfulgt af flere mutationer for at optimere FRET effektivitet 8. Glutamin FRET konstruere blev leveret i pUTKan planteekspressionsvektor og blev fordøjet med BamHI og Sall for at frigive insertet. Sidstnævnte blev klonet ind i de tilsvarende restriktionssteder i vektoren pET41a i ramme med den N-terminale oprensning tAGS. Det samme insert blev ligeret ind i pCDNA4/TO vektoren efter at det var blevet fordøjet med BamHI og XhoI hjælp af kompatible klæbrige ender fremstillet af Sall og Xhol til frembringelse af den mammale ekspressionsvektor.
Plasmid-ekspression blev bekræftet ved kvantificering af mRNA-niveauer af biosensorer anvender QRT-PCR. Begge FIBS fandtes at være aktivt transkriberet på 25-44 mRNA kopier per celle antager β-actin på 3.000 udskrifter per celle i midten eksponentiel niveau 14.
Batch gror kulturer af hver cellelinie blev opretholdt under daglige prøver til in vivo kalibrering af hver FIBS. Levedygtige cellevækst profil af de to cellelinjer er vist i figur 3, og de tilsvarende FRET målinger og intracellulære metabolitkoncentrationer bestemmes af enzymatiske assays er vist i tabel 1. En fluorescenspladelæser blev anvendt til målingfluorescens af prøverne ved en excitationsbølgelængde på 430/35 nm og emission bølgelængder på 465/435 nm for cyan og 520/510 nm for gult. Det blev konstateret, at lave celleantal til stede i de første 4 dage kultur førte til upålidelige FRET signal. Tilsvarende høje celle lyseredes stede efter dag 8 kultur produceret en stor mængde af lysspredning. Kun data for dag 4-8 derfor anvendes til at konstruere kalibreringskurverne for glucose og glutamin FIBS er ligningerne for som vist i tabel 1.. Resultaterne viser, at FIBS signal opnås en pålidelig korrelation med de intracellulære koncentrationer mellem 1-5 mM for glukose og 0,3-2 mM for glutamin.
Efter denne og til at validere ovenstående resultater fed-batch overgrow kulturer af de to cellelinjer blev udført. Et foder indeholdende høj koncentration substrat (glucose i tilfælde af glucose FIBS og glutamin i tilfælde af glutamin FIBS) blev suppleretpå dag 6 i cellekulturen til at løfte de ekstracellulære koncentrationer af substratet. I tilfælde af glucose-baseret kultur den ekstracellulære glucosekoncentration blev forøget tilbage op til 36 mM, mens det for glutamin-baseret kultur blev glutaminkoncentration forøget til 4 mM. Figur 4 viser repræsentative resultater fra denne undersøgelse. 4A og 4C viser de FRET nøgletal på hver dag, som klart reagerer på fodring ved at vende den tendens, de fulgt op på dag 6. Specifikt i figur 4A, forhold FRET for glucose fibs CHO-cellelinie falder på dag 7 som reaktion på glucose Eftersom glucose FIBS følger APO-On konfiguration. Tilsvarende i figur 4C, forhold FRET for glutamin fibs CHO cellelinie stigninger i respons på glutamin desuden i overensstemmelse med princippet om Apo-Off sensorer.
Disse FRET målinger blev endelig brugt til at calcUlate tilsvarende intracellulære glucose og glutamin koncentrationer baseret på de førnævnte kalibreringskurver, og resultaterne er vist i figur 4B for glucose og Figur 4D i stedet for glutamin. De er i forhold til de faktiske intracellulære koncentrationer af disse substrater som fastlagt med glukose og glutamin enzymatiske assays og vise passende aftale.
.. Tabel 1. Resultater for in vivo kalibrering af FRET ratio for glukose og glutamin FIBS Kalibreringskurverne beskrives af følgende ligninger, der kan bruges til at gøre forudsigelser: y =-1.232x + 8,034 for glucose (R 2 = 0,961), og y = 1.892x + 0.332 til glutamin (R 2 = 0,879), hvor y er forholdet FRET og x er koncentrationen i mM.
Fig. 1. Principper for FIBS anvendt i denne undersøgelse. Glutamin FIBS (venstre) følger Apo-Min princip, hvorved glutamin binder til sensing domæner og genererer en konformationel skift, der bringer begge fluorescerende proteiner tættere sammen, og dermed øge FRET. Glukose FIBS (til højre) følger Apo-Max princip, hvorved glukose binder sig til sensing domæne og genererer en konformationsændring, der adskiller de fluorescerende proteiner, og dermed faldende FRET.
Figur 2. Oversigt over metoden til FIBS kalibrering og efterfølgende invasiv kvantificering af intracellulær glukose og glutamin koncentrationer.
Figur 3.. Levedygtig cellekoncentrationen profil for batch overgrow kulturer af glucose FIBS-og glutamin FIBS-udtrykkende CHO cellelinier (n = 2 biologiske gentagelser med tre målinger per celle linie).
Figur 4.. Fed batch kultur FIBS-producerende CHO celler og tilsvarende FRET målinger. (A) Daglig migasurements af FRET forholdet fed-batch-CHO cellekulturer udtrykker glukose FIBS. Pilen angiver tilsætningen af glucose til cellekulturen. (B) Den faktiske intracellulære glucosekoncentrationen profil målt under anvendelse af en glucose-assaykit mod forventede værdier baseret på in vivo glucose kalibreringskurven (tabel 1). (C) daglige målinger af FRET forholdet fed-batch-CHO cellekulturer udtrykker glutamin FIBS. Pilen angiver tilsætningen af glutamin til cellekulturen. (D) Den faktiske intracellulære glutaminkoncentration profil målt med en glutamin assaykit mod værdier forudsagt baseret på in vivo-glutamin kalibreringskurven (tabel 1). I alle tilfælde, n = 2 biologiske gentagelser med tre målinger pr cellelinie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FIBS muliggøre in vivo og in situ kvantificering af de vigtigste molekyler, i dette tilfælde vækstbegrænsende næringsstoffer, fjerne usikkerhedsmomenter, der skyldes afkølende og udvinding metoder. Resultaterne tyder på, at der er en god sammenhæng mellem FIBS signal og de intracellulære koncentrationer i området 1-5 mM for glukose og 0,3-2 mM for glutamin. I batch CHO cellekultur, er disse koncentrationer stødt på i de eksponentielle, stationære og tidlige tilbagegang faser. Den eksponentielle og stationære faser er de mest kritiske med hensyn til udformningen af hensigtsmæssige fodringsstrategier, brugen af disse biosensorer til estimering af de metaboliske krav i cellerne er derfor industrielt relevant. Resultaterne af fed-batch-forsøg bekræfter FIBS kvalifikationer til at give et skøn over intracellulære glukose og glutamin koncentrationer. Afvigelser udstillet på tidligere tidspunkter kan være opstået på grund af lavere levedygtige celler nummer og / eller på grund af interferens fra andre metabolitter, fx ved galactose i tilfælde af glucose FIBS, og andre aminosyrer i tilfælde af glutamin FIBS. Specifikt har det vist sig, at en reduktion på op til 20% i forhold FRET kan forekomme i nærvær af aspartat, glutamat, glycin, threonin, valin og tyrosin 15. Samlet antyder disse resultater, at fejl i FIBS signalet er forholdsvis lav.
Selv om denne metode kun kan overvåge et begrænset antal molekyler ad gangen, kan det give nyttige oplysninger til cellelinje og procesudvikling, eller endda datafangst for validering af matematiske modeller. I betragtning af den mangfoldighed af periplasmatiske bindingsproteiner kan udvikles lignende biosensorer til et array for små molekyler, herunder andre aminosyrer, sukkerarter og ioner, såsom sulfat og phosphat 16, hvilket gør dette til en alsidig metode til metabolit kvantificering i realtid i levende celler .
En vigtig fordel ved brugen af FIBS er evnen til at opnå online målinger potentielt i en kontinuerlig måde. Metoden egner sig derfor til high-throughput applikationer, der kan reducere manuel håndtering og fremskynde udviklingsindsatsen. Med den øgede tilgængelighed af MicroReactor miljøer med indbygget funktionalitet til fluorescens detektion, er det planen, at en FIBS-aktiveret metabolit profilering platform kan bruges til celle screening, medier og procesoptimering, og proces opskalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Vi takker professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) for venligt giver os glukose FRET plasmid og Dr. Uwe Ludewig (Hohenheim Universitet) for venligt leverer glutamin FRET konstruere i pUTKan planteekspressionsvektor. AB er finansieret af BBSRC Målrettet program Prioriterede stipendier. Både CK og KP understøttes af RCUK stipendier i Biopharmaceuticals Processing. CK ønsker også at takke Lonza Biologics for deres økonomiske støtte. Center for Syntetisk Biologi og innovation er generøst støttet af EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
