Summary
Een beschrijving van hoe je Förster Resonance Energy Transfer geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) kalibreren voor in situ metabool profiel wordt gepresenteerd. De FIBS kan worden gebruikt om de intracellulaire niveaus van metabolieten invasief leveren aan de ontwikkeling van metabole modellen en hoge doorvoer screening van bioproces omstandigheden te meten.
Abstract
In het tijdperk van de computationele biologie, nieuwe high throughput experimentele systemen die nodig zijn om aan te vullen en te verfijnen modellen, zodat ze kunnen worden gevalideerd voor voorspellende doeleinden. Idealiter dergelijke systemen zou een laag volume, dat de bemonstering en destructieve analyses in de weg staat wanneer de tijd cursus data zijn te verkrijgen zijn. Wat nodig is, is een in situ monitoring tool die de nodige informatie in real-time en niet-invasief te kunnen melden. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters intracellulaire concentraties. Een specifieke klasse van in vivo biosensoren die toepassingen heeft in metaboliet kwantificering is gebaseerd op Förster Resonance Energy Transfer (FRET) tussen twee fluorescente eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) worden constitutief geproduceerd binnen de cellijn, ze hebben snelle responstijden en hun spectrale chagenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. In dit artikel wordt de werkwijze voor het construeren van de Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS glucose en glutamine en kalibreren van de FIBS in vivo in batch celkweek om toekomstige kwantificering van intracellulaire metaboliet concentratie inschakelen beschreven. Gegevens van fed-batch CHO celkweken aantoont dat de FIBS kon telkens de resulterende verandering in de intracellulaire concentratie detecteren. De fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve werd de intracellulaire concentratie nauwkeurig bepaald bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test.
Introduction
Metaboliet controle heeft diverse toepassingen in bioprocessing, inclusief procesontwikkeling, media en diervoeders ontwerp en metabolic engineering. Verschillende werkwijzen zijn beschikbaar voor concentratiemetingen door middel van enzymatische 1, 2 chemisch of bindingstesten 3. Een interessante optie is het gebruik van fluorescente, basis van eiwitten in vivo biologische sensoren als reporters van de intracellulaire concentratie van belangrijke metabolieten. In ultra-low volume assays, fluorescentie is een handig hulpmiddel als miniaturisatie feite verbetert de signaal-ruisverhouding 4,5 en eiwit gebaseerde sensoren kunnen genetisch gecodeerd zin dat geen exogene reagens nodig metabolietanalyse zijn. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensoren uit twee fluorescerende eiwitten verbonden door een ligand bindend domein. FRET is een nonradiative overdracht van energie van een foto-enthousiast donor naar een acceptor fluorescerend molecuul locat ed in de nabijheid (<100). Ligand splitsing of binding veroorzaakt een conformationele verandering in de sensor, die op zijn beurt veroorzaakt een verandering in de nabijheid van de fluoroforen, wat leidt tot een verandering in FRET efficiëntie gemeten door de verandering in het emissiespectrum. FRET geïntegreerde biologische sensoren (FIBS) wordt constitutief geproduceerd in de cellijn en de spectrale eigenschappen veranderen gebaseerd op de concentratie van metaboliet in de cel. FIBS hebben snelle responstijden waardoor ze ideaal zijn voor het nemen van metingen van dynamische modellen 6. Vorige toepassingen zijn onder meer het toezicht op enkele 7-9 en meerdere 10 metabolieten en het verstrekken van gegevens over de tijdruimtelijke verdeling 11. FIBS kunnen worden gemaakt in twee configuraties: Apo-Max, wanneer ligandbinding verstoort de nabijheid van de fluoroforen verlagen energieoverdracht en Apo-Min, wanneer ligandbinding brengt de twee fluoroforen in nauwer contact (figuur 1).
_content "> In dit werk wordt een protocol gepresenteerd voor de bouw van Chinese hamster ovarium (CHO) cellijnen die constitutief een FIBS voor een metaboliet, glucose of glutamine. Een methodologie vastgesteld voor de kalibratie van de sensor in vivo om toekomstige kwantitatieve staat metingen van intracellulaire metaboliet concentratie zoals aangegeven in figuur 2. Op basis daarvan de intracellulaire concentratie van glucose of glutamine kan worden bepaald fed-batch CHO celkweken, waarbij de twee nutriënten werden toegevoegd in hoge concentraties in het proces. de resultaten blijkt dat met het fluorescerende signaal van de FIBS en de eerder geconstrueerde ijkcurve nauwkeurig voorspellen van de intracellulaire concentratie mogelijk, zoals bevestigd door een onafhankelijke enzymatische test. Deze methode biedt aanzienlijke voordelen boven de huidige analytische technieken omdat het invasieve, goedkope en snel, het geven van een real-time signaal van de FIBS die maan kan zijnitored de hele cultuur.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellijn Revival en onderhoud
- Revive CHO-cellen in 9 ml CD-CHO medium aangevuld met 8 mM L-glutamine en 10 ml / L 100x hypoxanthine / thymidine supplement (compleet groeimedium).
- Centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten.
- Resuspendeer de cellen in 10 ml vers compleet groeimedium.
- Verwijderen van een 1 ml monster en bepaal de levensvatbare cel concentratie met lichtmicroscopie met de trypanblauw kleurstof uitsluiting methode in een hemocytometer.
- Start een cultuur op een seeding dichtheid van 3 x 10 5 cellen / ml in 125 ml schudflessen.
- Handhaaf de cultuur in een incubator bij 37 ° C, een bevochtigde atmosfeer van 5% CO2, op een orbitale schudden platform roteert met 120 rpm.
- Subcultuur elke 3-4 dagen in hele groeimedium in een zaaidichtheid van 2 x 10 5 cellen / ml.
2. Transfectie van de cellijn met het plasmide Containing de biosensor Gene
- Bereid plasmide-DNA met een grootschalige plasmide zuiveringskit.
- Handhaaf cellen bij de geschikte omstandigheden (37 ° C, 5% CO2) 12-24 uur voor transfectie te zorgen voor de cellen actief delende op het moment van transfectie.
- Tel de cellen met de kleurstof trypan blauw uitsluiting werkwijze vervolgens een werkvolume van 20 ml celkweek in een 125 ml schudkolf bij een concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml.
- Gebruik een geschikte transfectie kit voor de cellijn in gebruik. Het plasmide DNA transfectie reagentia ratio zal afhankelijk van de cellijn en vector zijn. Aanbevolen wordt het geoptimaliseerd door het testen van verschillende verhoudingen binnen het bereik van de fabrikant gespecificeerde alvorens zij de uiteindelijke transfecties. Ook houden tenminste een negatieve controle kweek die de cellen maar geen DNA.
- Incubeer gedurende 4 dagen in de statische modus en vervolgens overbrengen naar een shaking platform draaien op 125 rpm.
- Voeg de juiste antibioticum voor plasmide selectie naar een geschikte concentratie, zoals bepaald door een kill-curve. In deze studie werd zeocine toegevoegd tot een eindconcentratie van 400 ug / ml voor de selectie van getransfecteerde cellen.
- Verander media op een geschikt moment interval voor de cellijn, antibiotica telkens voegen, totdat de cellen in de controle goed zijn gestorven.
- Gebruik de meest samenvloeiing putten om de voortgang te schudden culturen.
- Stel een cel bank bevroren cellen in cryogene flesjes die 10 7 levensvatbare cellen in 1 ml bevriezen mengsel. In dit werk, die bestaat uit 92,5% groeimedium en 7,5% dimethylsulfoxide.
3. Batch en Fed-batch celgroei Curve
- Volg de instructies voor celonderhoud hierboven om drievoud celculturen van de getransfecteerde CHO-cellen in 250 ml vestigen schud kolven met een werkvolume van 50 ml.
- Handhaving van de cultures in een bevochtigde cel incubator bij 37 ° C met 5% CO2, op een orbitale schudden platform roteert met 125 rpm en verwijder 4,1 ml monsters van elke groeiende kweek van 24 uur intervallen.
- Gebruik 100 ul van het monster op de levensvatbare celconcentratie en levensvatbaarheid van de cellen met de kleurstof trypan blauw uitsluiting methode bepalen.
- Herhaal dit totdat de levensvatbare cel concentratie tot nul wordt gereduceerd.
- Herhaal de fed-batch celculturen te vullen met de geschikte hoeveelheid glucose of glutamine op dag 6 met de concentratie respectievelijk herstellen naar hun initiële waarden van 36 mM en 4 mM. Aanbevolen wordt extra controle kweken ook worden gehandhaafd, die worden gevoed met hetzelfde volume (12 ml in dit geval) zuiver water.
4. FRET Ratio Metingen
- Neem 2 ml van de dagelijkse monsters verwijderd in stap 3.2 en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C.
- Resuspeindigde de celpellet in 2 ml ijskoude fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Breng deze in een 6-wells plaat en voeg een blanco monster dat geen cellen aan een putje.
- Meet de niveaus van blauwe en gele fluorescentie onmiddellijk bij een excitatie golflengte van 430/435 nm en emissie golflengten van 465/435 nm (blauw) en 520/510 nm (geel).
- Bereken de FRET ratio (verhouding van gele fluorescentie gedetecteerd over blauwe fluorescentie gedetecteerd).
5. Metaboliet Testen
- Neem 2 ml van de dagelijkse monsters verwijderd in stap 3.2 en centrifugeer bij 100 xg gedurende 5 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant.
- Resuspendeer de celpellet in 3 ml ijskoude PBS en centrifugeer opnieuw bij 100 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 3 ml ijskoude PBS zoals hierboven. Ultrasone trillingen het monster 5x gedurende 3 min elk bij een puls van 15 seconden aan en 15 seconden uit. Op dit punt, de cel extracts kan worden bevroren, indien gewenst.
- Gebruik een geschikte glucose-assay kit volgens de instructies van de fabrikant voor monsters van celextracten de intracellulaire glucoseconcentratie bepalen (zie tabel materialen).
Opmerking: Gebruik de juiste normen om een standaard curve construeren. In dit werk, de concentratie van de normen varieerde van 0-100 mm. - De metingen van de normen, bouwen de standaardcurve en vind de lineaire vergelijking best passende (hier: y = 1310.51x - 723,43 waarbij y de absorptie lezen en x de glucoseconcentratie).
- Bereken de concentraties glucose met de standaardcurve en rekening houdend met de verdunningsfactor. De intracellulaire glucoseconcentratie kan dan berekend door de vergelijking:
Voor CHO-cellen, werd het enkelvoudige celvolume berekend met een celdiameter van 12 pM 12 - De geschikte glutamine assay kit volgens de instructies van de fabrikant voor monsters van celextracten de intracellulaire glutamine concentratie kan worden bepaald (zie tabel materialen).
Opmerking: Gebruik de juiste normen om een standaard curve construeren. In dit werk, de concentratie van de normen varieerde tussen 0-2 mm. - Zoals in 5.5 hierboven, bouwen de kalibratiecurve (in dit geval y = + 17,1 203.1x waarbij y de absorptie lezen en x de glucoseconcentratie)
- De standaardcurve Bereken de glutamine concentratie van de monsters, waarbij de verdunning wordt gehouden. De intracellulaire glutamine concentratie kan worden berekend met vergelijking 1 hierboven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een overzicht van de methode is weergegeven in figuur 2. In het werk die hierin werden CHO-cellen getransfecteerd met de vector FIBS en stabiele cellijnen werden geselecteerd in een antibioticum druk van 400 ug / ml zeocine. Twee afzonderlijke stabiele cellijnen constitutief glucose en glutamine sensoren zijn derhalve gecreëerd. Figuur 1 toont de configuratie van de twee biosensoren in deze studie. De glucosesensor is het Apo-Max principe en de overeenkomstige plasmide pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Dit is een fusie van de versterkte cyaan fluorescerend eiwit (ECFP) en Aphrodite variant van de versterkte geel fluorescerend proteïne (EYFP) de F16A mutant van E. coli glucose / galactose periplasmisch bindend eiwit. 11 aminozuurresten werden uit het linkergebied op FRET efficiency 13 te verbeteren. Deze vector werd gekloneerd in de vector pCDNA4/TO met de unique EcoRI en PstI restrictieplaatsen, die een cytomegalovirus promotor en een SV40 versterker gebruikt.
De glutamine sensor is gebaseerd op Apo-Min beginsel (figuur 1) en het overeenkomstige plasmide was afgeleid van een insertie van een geel-fluorescerende eiwit citroengeel in de E. coli glutamine periplasmatische bindingseiwit tussen aminozuren 98 en 99 met ECFP aan de C-terminus. De structuur is verstevigd door deletie van residuen in het koppelgedeelte, terwijl de aminozuursubstitutie D157N gedaan om de QBP affiniteit voor glutamine, gevolgd door verscheidene mutaties verhogen FRET efficiëntie 8 optimaliseren. De glutamine FRET construct werd geleverd in de pUTKan plantenexpressievector en werd gedigereerd met BamHI en SalI om het te ontgrendelen. Laatstgenoemde werd gekloneerd in de overeenkomstige restrictieplaatsen van de vector pET41a in frame met de N-terminale zuivering tAGS. Dezelfde insertie werd geligeerd in de vector pCDNA4/TO, nadat het was gedigereerd met BamHI en XhoI u de compatibele overhangende uiteinden door SalI en XhoI, de zoogdierexpressievector produceren.
Plasmide expressie werd bevestigd door het kwantificeren van de mRNA niveaus van biosensoren met qRT-PCR. Beide FIBS bleken actief te worden getranscribeerd op 25-44 mRNA-kopieën per cel uitgaande van β-actine in 3000 transcripties per cel in het midden-exponentiële level 14.
Batch overgrow culturen van elke cellijn werden gehandhaafd zodat dagelijks monsters voor de in vivo kalibratie van elke FIBS. De levensvatbare celgroei profiel van de twee cellijnen wordt getoond in figuur 3 en de bijbehorende FRET metingen en intracellulaire metaboliet concentraties bepaald met enzymatische assays worden in Tabel 1. Een fluorescentie plaatlezer werd gebruikt voor het metenfluorescentie van de monsters bij een excitatiegolflengte van 430/35 nm en emissie golflengten van 465/435 nm voor cyaan en 520/510 nm voor geel. Het bleek dat vanaf celaantallen in de eerste 4 dagen kweek tot onbetrouwbare FRET signaal. Ook het hoge niveau van de cel aanwezig lysated na dag 8 van de cultuur produceerde een grote hoeveelheid lichtverstrooiing. Alleen gegevens voor dagen 4-8 wordt daarom gebruikt om de calibratie curves voor glucose en glutamine FIBS construeren, worden de vergelijkingen voor die getoond in Tabel 1. De resultaten tonen dat de FIBS signaal produceert een betrouwbare correlatie met de intracellulaire concentratie van 1-5 mM glucose en 0.3-2 mM glutamine.
Na deze en bovenstaande bevindingen te bevestigen, fed-batch overwoekeren culturen van de twee cellijnen uitgevoerd. Een voeding die hoge substraatconcentratie (glucose bij de FIBS glucose en glutamine bij de glutamine FIBS) aangevuldop dag 6 van de celkweek aan de extracellulaire concentraties van het substraat verhogen. Bij de glucose gevoede kweek werd het extracellulaire glucoseconcentratie verhoogd terug tot 36 mM, terwijl de glutamine-gevoede kweek, werd het glutamine concentratie verhoogd tot 4 mM. Figuur 4 toont representatieve resultaten van deze studie. Figuren 4A en 4C tonen de FRET-ratio's op elke dag, die duidelijk reageren op voeding door het omkeren van de trend volgden ze tot op dag 6. Met name in figuur 4A, de FRET verhouding voor glucose liegt CHO cellijn af op dag 7 in reactie op glucose bovendien, aangezien de glucose FIBS volgt de APO-configuratie. Ook in figuur 4C, de FRET verhouding voor de glutamine liegt CHO cellijn toe bij glutamine Bovendien, overeenkomstig het beginsel van Apo-Off sensoren.
Deze FRET metingen werden uiteindelijk gebruikt om calcUlate de overeenkomstige intracellulaire glucose en glutamine concentraties basis van bovengenoemde kalibratiecurves en de resultaten worden getoond in Figuur 4B glucose en figuur 4D voor glutamine. Ze worden vergeleken met de werkelijke intracellulaire concentratie van deze substraten zoals bepaald met glucose en glutamine enzymatische assays en vertonen voldoende overeenkomst.
.. Tabel 1 Resultaten in vivo kalibratie van FRET verhouding voor glucose en glutamine FIBS De kalibratiecurves worden beschreven door de volgende vergelijkingen die kunnen worden gebruikt om voorspellingen: y =-1.232x + 8,034 glucose (R2 = 0.961), en y = 1.892x + 0.332 voor glutamine (R 2 = 0,879), waarbij y de verhouding FRET en x de concentratie in mM.
Figuur 1. Uitgangspunten FIBS gebruikt in deze studie. Het glutamine FIBS (links) volgt de Apo-Min principe, waarbij glutamine bindt aan het registrerende domeinen genereert en een conformationele verandering die zowel fluorescerende eiwitten dichter bij elkaar brengt, waardoor FRET. De glucose FIBS (rechts) volgt de Apo-Max principe, waarbij glucose bindt aan de sensing domein en genereert een conformationele verandering die de fluorescerende eiwitten scheidt, dus het verminderen van FRET.
Figuur 2. Overzicht van de methodologie voor FIBS kalibratie en daaropvolgende invasieve kwantificering van intracellulaire glucose en glutamine concentraties.
Figuur 3. Levensvatbare celconcentratie profiel overgrow batch kweken van glucose FIBS-en glutamine FIBS-tot expressie brengende CHO-cellijnen (n = 2 biologische herhalingen van drie metingen per cellijn).
Figuur 4. Fed-batch cultuur van FIBS-producerende CHO-cellen en de bijbehorende FRET metingen. (A) Dagelijkse measurements van FRET verhouding van fed-batch CHO celkweken uiten glucose FIBS. De pijl geeft de toevoeging van glucose aan de celkweek. (B) werkelijke intracellulaire glucoseconcentratie profiel gemeten met een glucose-assay kit tegen waarden voorspeld op basis van in vivo glucose kalibratiekromme (tabel 1). (C) Dagelijkse metingen van FRET verhouding van fed-batch CHO celkweken uiten glutamine FIBS. De pijl geeft de toevoeging van glutamine aan de celkweek. (D) Werkelijke intracellulaire glutamine concentratie profiel gemeten met een glutamine testkit tegen waarden voorspeld op basis van in vivo glutamine ijkgrafiek (tabel 1). In alle gevallen, n = 2 biologische herhalingen van drie metingen per cellijn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FIBS mogelijk in vivo en in situ kwantificering van sleutelmoleculen in casu groei beperkende voedingsstoffen, onzekerheden van gevolg van afschrikken en extractiemethoden. De resultaten suggereren dat er een goede correlatie tussen de FIBS signaal en de intracellulaire concentraties in het traject van 1-5 mM glucose en 0.3-2 mM glutamine. In batch CHO-celkweek, zijn deze concentraties aangetroffen in de exponentiële, stationaire en vroege daling fasen. De exponentiële en stationaire fasen zijn de meest kritische gebied van het ontwerpen van passende voederstrategieën, het gebruik van deze biosensoren voor het schatten van de metabolische vereisten van de cellen is dus industrieel belang. De resultaten van de fed-batch experiment bevestigen FIBS de geschiktheid schattingen van intracellulaire glucose en glutamine-concentraties. Afwijkingen tentoongesteld op eerdere tijdstippen kunnen zijn ontstaan als gevolg van lagere levensvatbare cel nummers en / of door interferentie van andere metabolieten, bijvoorbeeld door galactose bij de glucose FIBS en door andere aminozuren bij het glutamine FIBS. Specifiek is aangetoond dat een vermindering tot 20% in de FRET verhouding kan optreden in aanwezigheid van aspartaat, glutamaat, glycine, threonine, valine en tyrosine 15. Over het algemeen, suggereren deze resultaten dat fout in de FIBS signaal is vrij laag.
Hoewel deze methode slechts een beperkt aantal moleculen kan controleren op een moment, kan het nuttige informatie voor een cellijn en procesontwikkeling, of zelfs data-acquisitie voor de validatie van wiskundige modellen. Gezien de diversiteit van periplasmatische eiwitten, kan dit biosensoren worden ontwikkeld voor een reeks van kleine moleculen zoals andere aminozuren, suikers en ionen zoals sulfaat en fosfaat 16, waardoor dit een veelzijdige werkwijze voor kwantificering metaboliet in real time in levende cellen .
Een belangrijk voordeel van het gebruik van FIBS is de mogelijkheid om online metingen mogelijk op continue wijze te verkrijgen. De methode leent zich dan ook voor high-throughput toepassingen die manueel hanteren kan verminderen en te versnellen ontwikkelingsinspanningen. Met de toegenomen beschikbaarheid van microreactor omgevingen met ingebouwde functionaliteit voor fluorescentiedetectie wordt overwogen dat een FIBS enabled metaboliet profilering platform kan worden gebruikt voor mobiele screening, media en procesoptimalisatie en proces opschaling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) voor vriendelijk ons met de glucose FRET plasmide en Dr Uwe Ludewig (Universität Hohenheim) voor vriendelijk het leveren van de glutamine FRET bouwen in de pUTKan plantenexpressievector. AB wordt gefinancierd door de BBSRC Gerichte Priority Studentships programma. Zowel CK en KP worden ondersteund door RCUK beurzen in Biopharmaceuticals Processing. CK wil ook Lonza Biologics bedanken voor hun financiële steun. Het Centrum voor Synthetische Biologie en Innovatie is royaal ondersteund door de EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
