Summary
Une description de la façon d'étalonner les capteurs de transfert Förster Resonance Energy intégrés biologiques (mensonges) pour le profilage métabolique in situ est présentée. Les FIBS peuvent être utilisés pour mesurer les niveaux de métabolites intracellulaires aider de manière non invasive dans le développement de modèles métaboliques et criblage à haut débit de conditions de bioprocédés.
Abstract
À l'ère de la biologie computationnelle, de nouveaux systèmes expérimentaux à haut débit sont nécessaires afin de remplir et d'affiner les modèles de sorte qu'ils peuvent être validées à des fins prédictives. Idéalement, de tels systèmes seraient faible volume, ce qui exclut d'échantillonnage et les analyses destructives lorsque des données de cours du temps doivent être obtenus. Ce qui est nécessaire est un outil de surveillance in situ qui peuvent rapporter les informations nécessaires en temps réel et de façon non invasive. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de concentrations intracellulaires à base de protéines. Une classe particulière de biocapteurs in vivo qui ont trouvé des applications dans métabolite quantification est basée sur le transfert d'énergie par résonance Förster (FRET) entre deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET capteurs biologiques intégrés (mensonges) sont constitutivement produites dans la lignée cellulaire, ils ont un temps de réponse rapide et leur cha spectraletiques changer en fonction de la concentration de métabolite dans la cellule. Dans le présent document, le procédé de construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS de glucose et de la glutamine et l'étalonnage des FIBS in vivo dans une culture cellulaire par lots afin de permettre la quantification future de la concentration en métabolite intracellulaire est décrite. Les données de fed-batch cultures de cellules CHO démontre que les FIBS a pu dans chaque cas, de détecter la variation résultante de la concentration intracellulaire. En utilisant le signal fluorescent à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, la concentration intracellulaire a été déterminée avec précision telle que confirmée par un essai enzymatique indépendante.
Introduction
suivi de métabolite a diverses applications dans les procédés biotechnologiques, y compris le processus de développement, les médias et la conception d'alimentation, et de l'ingénierie métabolique. Diverses méthodes sont disponibles pour la mesure de concentration à l'aide d'une enzymatique, chimique 2, ou des dosages de liaison 3. Une solution intéressante est l'utilisation de fluorescence, dans des capteurs biologiques in vivo que les reporters de la concentration intracellulaire des métabolites principaux à base de protéines. Dans les essais de volume ultra-bas, la fluorescence est un outil pratique que la miniaturisation améliore réellement le taux de 4,5 signal-sur-bruit et des capteurs à base de protéines peut être génétiquement codé sens qu'aucun réactifs exogènes sont nécessaires pour l'analyse des métabolites. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biocapteurs sont constitués de deux protéines fluorescentes reliés par un domaine de liaison du ligand. FRET est un transfert non radiatif de l'énergie à partir d'un donneur de photo-excitation à un accepteur fluorescent molécule locat ed à proximité (<100). Le clivage de la liaison du ligand ou provoque un changement conformationnel dans le capteur, ce qui, à son tour, induit un changement dans la proximité des fluorophores, ce qui conduit à un changement de l'efficacité de FRET mesuré par le changement dans le spectre d'émission. Des capteurs biologiques intégrés (FRET) sont constitutivement FIBS produits dans la lignée de cellules et leurs caractéristiques spectrales changent en fonction de la concentration du métabolite dans la cellule. FIBS ont des temps de réponse rapide qui les rend idéales pour prendre des mesures pour les modèles dynamiques 6. Applications précédentes comprennent la surveillance simples 7-9 et plusieurs métabolites 10 et fournir des données sur la répartition spatio-temporelle 11. FIBS peuvent être créés dans deux configurations: Apo-Max, où la liaison du ligand perturbe la proximité des fluorophores abaissement transfert d'énergie et Apo-Min, où la liaison du ligand apporte les deux fluorophores en contact plus étroit (figure 1).
_content "> Dans ce travail, un protocole est présenté pour la construction d'ovaire de hamster chinois (CHO), des lignées cellulaires qui expriment de manière constitutive un FIBS pour un métabolite, le glucose ou la glutamine. Une méthodologie est établie pour l'étalonnage du capteur in vivo pour permettre à l'avenir quantitative des mesures de concentration de métabolite intracellulaire, tel que présenté dans la figure 2. Sur cette base, la concentration intracellulaire de glucose ou de la glutamine peuvent être déterminées en fed-batch CHO cultures de cellules, dans laquelle les deux éléments nutritifs ont été ajoutés à des concentrations élevées en cours de fabrication. Les résultats démontrent que l'utilisation du signal de fluorescence à partir des FIBS et la courbe d'étalonnage construite précédemment, avec précision la prédiction de la concentration intracellulaire est possible, comme l'a confirmé par un test enzymatique indépendante. Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux technologies d'analyse de courant, car il est peu coûteux non invasive et rapide, donnant un signal en temps réel des FIBS qui peuvent être monitored tout au long de la culture.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Une. Cell Line Revival et entretien
- Ressusciter des cellules CHO dans 9 ml de milieu CD-CHO supplémenté avec 8 mM de L-glutamine et de 10 ml / L supplément 100x hypoxanthine / thymidine (milieu de croissance complet).
- Centrifuger à 100 g pendant 5 min.
- Remettre en suspension les cellules dans 10 ml de milieu de croissance frais complet.
- Retirer un échantillon de 1 ml et déterminer la concentration de cellules viables par microscopie optique en utilisant le procédé d'exclusion de colorant bleu trypan dans un hémocytomètre.
- Initier une culture à une densité de semis de 3 x 10 5 cellules / ml dans 125 ml secouer les flacons.
- Maintenir la culture dans un incubateur à 37 ° C, une atmosphère humidifiée de 5% de CO 2, sur une table d'agitation orbital tournant à 120 tours par minute.
- Repiquer tous les 3-4 jours dans le milieu de croissance complet à une densité de semis de 2 x 10 5 cellules / ml.
2. La transfection de la lignée cellulaire avec le plasmide Contenant le biocapteur Gene
- Préparer l'ADN de plasmide en utilisant un kit de purification de plasmide à grande échelle.
- Maintenir les cellules dans des conditions appropriées (37 ° C, 5% CO 2) de 12 à 24 h avant la transfection afin d'assurer les cellules se divisent activement au moment de la transfection.
- Compter les cellules à l'aide de la méthode d'exclusion du colorant bleu trypan, puis préparer un volume de travail de 20 ml de culture cellulaire dans un flacon à secousses de 125 ml à une concentration de 1 x 10 6 cellules / ml.
- Utilisation d'un kit de transfection approprié pour la lignée cellulaire utilisée. L'ADN plasmidique à ratio des réactifs de transfection sera fonction de la lignée cellulaire et le vecteur. Il est recommandé que cette est optimisée en testant une gamme de rapports au sein de la gamme spécifiées par le fabricant avant de procéder à des transfections finales. Maintenir en outre au moins une culture témoin négatif contenant les cellules, mais pas d'ADN.
- Incuber pendant 4 jours en mode statique, puis les transférer à un Shakiplate-forme ng tournant à 125 rpm.
- Ajouter l'antibiotique approprié pour la sélection de plasmide à une concentration appropriée telle que déterminée par une courbe de destruction. Dans cette étude, la zéocine a été ajouté à une concentration finale de 400 pg / ml pour la sélection des cellules transfectées.
- Changer de support à un intervalle de temps approprié pour la lignée cellulaire, ajoutant antibiotique à chaque fois, jusqu'à ce que les cellules de contrôle et sont morts.
- Utilisez les puits les plus confluentes de progresser vers les cultures agitées.
- Établir une banque de cellules par congélation des cellules dans des flacons cryogéniques contenant 10 7 cellules viables dans 1 ml de mélange gel. Dans ce travail, il s'agit d'un milieu de croissance de 92,5% et 7,5% de diméthylsulfoxyde.
3. Batch et Fed-batch croissance cellulaire Curve
- Suivez les instructions pour l'entretien des cellules ci-dessus pour établir des cultures de cellules triple des cellules CHO transfectées dans des flacons de 250 ml secouer avec un volume de travail de 50 ml.
- Maintenir la cultures dans un incubateur humidifié de cellule à 37 ° C, avec 5% de CO 2, sur une plate-forme orbitale secouant tournant à 125 tours par minute, et retirer 4,1 ml des échantillons de chaque culture de plus en plus à intervalles de 24 heures.
- Utiliser 100 pl de l'échantillon pour déterminer la concentration cellulaire et la viabilité des cellules viables avec la méthode d'exclusion au bleu de trypan colorant.
- Répéter jusqu'à ce que la concentration de cellules viables est réduit à zéro.
- Répéter pour les cultures de cellules fed-batch en complétant avec la quantité appropriée de glucose ou de la glutamine au jour 6 de restaurer leurs concentrations à leurs valeurs initiales de 36 mm et 4 mm, respectivement. Il est recommandé que les cultures de contrôle supplémentaires sont également maintenues, qui doivent être alimentés avec le même volume (12 ml dans le cas présent) de l'eau pure.
4. FRET Ratio mesures
- Prendre 2 ml des échantillons quotidiens retirées à l'étape 3.2 ci-dessus et centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C.
- Resuspterminé le culot de cellules dans 2 ml de glace froide saline tamponnée au phosphate (PBS). Transférer cette dans une plaque à 6 puits et ajouter un échantillon témoin ne contenant pas de cellules pour un bien.
- Mesurer les niveaux de fluorescence bleue et jaune immédiatement à une longueur d'onde d'excitation de 430/435 nm et d'émission des longueurs d'onde de 465/435 nm (bleu) et 520/510 nm (jaune).
- Calculer les rapports de FRET (ratio de fluorescence jaune détecté sur fluorescence bleue détecté).
5. Métabolite dosages
- Prendre 2 ml des échantillons quotidiens retirées à l'étape 3.2 ci-dessus et centrifuger à 100 g pendant 5 min à 4 ° C. Retirer le surnageant.
- Remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de PBS glacé et centrifuger à nouveau à 100 x g pendant 5 min.
- Eliminer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire dans 3 ml de PBS refroidi à la glace comme ci-dessus. Soniquer l'échantillon 5x pendant 3 min chacune à une impulsion de 15 secondes sur 15 secondes et éteint. À ce stade, la cellule supplémentairects peuvent être congelées si vous le souhaitez.
- Utilisez un kit de dosage du glucose approprié selon les instructions du fabricant sur des échantillons d'extraits cellulaires pour déterminer la concentration intracellulaire de glucose (voir tableau des matériaux).
Remarque: Utilisez des normes appropriées pour construire une courbe standard. Dans ce travail, la concentration de normes variait entre 0 à 100 mM. - À partir des valeurs pour les normes, construire la courbe d'étalonnage et de trouver l'équation linéaire de meilleur ajustement (dans ce cas: y = 1310.51x - 723,43 où y est la lecture de l'absorbance et x est la concentration de glucose).
- Calculer les concentrations de glucose en utilisant la courbe d'étalonnage et en tenant compte de la dilution. La concentration intracellulaire de glucose peut alors être calculée en utilisant l'équation suivante:
Pour les cellules CHO, le volume de la cellule unique a été calculée en utilisant un diamètre de cellule de 12 uM 12 - Utilisez un kit de dosage de la glutamine appropriée selon les instructions du fabricant sur des échantillons d'extraits cellulaires pour déterminer la concentration de glutamine intracellulaire (voir tableau des matériaux).
Remarque: Utilisez des normes appropriées pour construire une courbe standard. Dans ce travail, la concentration des normes variait entre 0-2 mM. - Comme dans 5.5 ci-dessus, la construction de la courbe d'étalonnage (dans ce cas y = + 17,1 203.1x où y est la mesure d'absorbance et x est la concentration de glucose)
- En utilisant la courbe d'étalonnage, calculer la concentration de glutamine des échantillons, en tenant compte de la dilution. La concentration de glutamine intracellulaire peut être calculée en utilisant l'équation 1 ci-dessus.
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Representative Results
Un aperçu de la méthodologie est présentée dans la figure 2. Dans le travail présenté ici, les cellules CHO ont été transfectées avec le vecteur d'FIBS et des lignées cellulaires stables ont été sélectionnées à un antibiotique pression de 400 pg / ml de zéocine. Deux lignées cellulaires stables exprimant de manière constitutive séparées de glucose et de glutamine capteurs ont donc été créés. Figure 1 représente les configurations des deux biocapteurs utilisés dans cette étude. Le capteur de glucose est basée sur le principe de Apo-Max et le plasmide correspondant est pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Il s'agit d'une fusion de la protéine fluorescente cyan améliorée (ECFP) et la variante de Vénus de la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) pour le mutant F16A du E. coli glucose / galactose périplasmique protéine de liaison. 11 résidus d'acides aminés ont été supprimés de la région de liaison afin d'améliorer l'efficacité de FRET 13. Ce vecteur a été clone dans le vecteur pcDNA4/TO utilisant le unique Eco RI et Pst I de sites de restriction, qui utilise un promoteur du cytomégalovirus et un activateur de SV40.
Le capteur de la glutamine est basée sur le principe de Apo-Min (figure 1) et le plasmide correspondant a été dérivée à partir d'une insertion du jaune fluorescent citrin de protéine dans le E. périplasmique de glutamine coli protéine entre les acides aminés 98 et 99 de liaison avec un ECFP attaché à l'extrémité C-terminale. La structure a été rigidifiée par délétion des résidus dans la région de liaison, tandis que la D157N de substitution d'acides aminés a été déposée auprès du QBP pour augmenter l'affinité pour la glutamine, suivie de plusieurs mutations afin d'optimiser l'efficacité de FRET 8. La glutamine FRET construire a été fourni dans l'usine vecteur d'expression pUTKan et a été digéré par Bam HI et Sal I pour libérer l'insert. Celui-ci a été clone dans les sites de restriction correspondants dans le vecteur pET41a de trame dans la purification N-terminal tags. Le même insert a été ligaturé dans le vecteur pcDNA4/TO, après qu'il ait été digéré par Bam HI et Xho I à l'aide des extrémités cohésives compatibles produites par Sal I et Xho I, pour produire le vecteur d'expression de mammifère.
Le plasmide d'expression a été confirmée par quantification des taux d'ARNm de biocapteurs utilisant la qRT-PCR. Les deux FIBS ont été trouvés à être transcrit activement à 25-44 copies d'ARNm par cellule en supposant β-actine à 3000 transcriptions par cellule au niveau de la mi-exponentielle 14.
Batch proliférer la culture de chaque lignée de cellules ont été maintenues en prenant des échantillons quotidiens pour l'étalonnage in vivo de chaque FIBS. Le profil de croissance de cellules viables des deux lignées cellulaires est représentée à la figure 3 et les mesures correspondantes de FRET et les concentrations de métabolites intracellulaires déterminés par dosages enzymatiques sont représentés dans le tableau 1. Un lecteur de plaque à fluorescence a été utilisée pour mesurerfluorescence des échantillons à une longueur d'onde d'excitation de 430/35 nm et d'émission des longueurs d'onde de 465/435 nm pour le cyan et 520/510 nm pour le jaune. On a trouvé que de faibles nombres de cellules présentes dans les 4 premiers jours de culture conduit à signal de FRET peu fiable. De même, le niveau élevé de cellules lysées présente après jour 8 de culture produit une grande quantité de diffusion de la lumière. Seules les données pour les jours 4-8 est donc utilisé pour construire les courbes d'étalonnage pour les glucose et glutamine MENSONGES, les équations qui sont présentés dans le tableau 1. Les résultats montrent que le signal de FIBS produit une corrélation fiable avec les concentrations intracellulaires entre 1-5 mM de glucose et de 0,3 à 2 mM de glutamine.
À la suite de cela et de valider les résultats ci-dessus, fed-batch proliférer cultures des deux lignées cellulaires ont été effectuées. Une alimentation contenant une grande concentration de substrat (glucose, dans le cas des FIBS de glucose et de la glutamine dans le cas des FIBS de glutamine) a été complétéeau jour 6 de la culture cellulaire pour élever les concentrations extracellulaires de substrat. Dans le cas de la culture de la glucose-fed la concentration extracellulaire de glucose a été augmentée de nouveau jusqu'à 36 mM, tandis que pour la culture de la glutamine-alimenté, la concentration en glutamine a été augmentée à 4 mM. Figure 4 montre des résultats représentatifs de cette étude. Figures 4A et 4C représentent les ratios de FRET de chaque jour, qui répondent clairement à l'alimentation en inversant la tendance qu'ils ont suivi jusqu'au jour 6. Plus précisément, sur la figure 4A, le rapport de FRET pour la glucose FIBS lignée cellulaire CHO diminue au jour 7 en réponse au glucose outre, étant donné que les FIBS de glucose suit la configuration APO-On. De même, sur la figure 4C, le rapport de FRET pour la glutamine FIBS CHO augmente de lignées cellulaires en réponse à l'addition de glutamine, en conformité avec le principe de capteurs Apo-Off.
Ces mesures de FRET ont finalement été utilisés pour calculer le correspondant concentrations de glucose et de glutamine intracellulaire sur la base des courbes d'étalonnage ci-dessus et les résultats sont montrés sur la figure 4B pour le glucose et de la glutamine Figure 4D. Elles sont comparées à des concentrations intracellulaires réelles de ces substrats, tel que déterminé par le glucose et la glutamine et dosages enzymatiques montrent accord adéquat.
.. Tableau 1 Résultats pour l'étalonnage in vivo du taux de FRET de glucose et de glutamine FIBS Les courbes d'étalonnage sont décrites par les équations suivantes qui peuvent être utilisés pour faire des prédictions: y =-1.232x + 8,034 pour le glucose (R2 = 0,961), et y = 1.892x + 0.332 pour la glutamine (R 2 = 0,879), où y est le rapport de FRET et x est la concentration en mM.
Figure 1. Principes des FIBS utilisés dans cette étude. Les FIBS de glutamine (à gauche) suit le principe Apo-Min, par lequel la glutamine se lie aux domaines de détection et génère un changement conformationnel qui apporte à la fois des protéines fluorescentes se rapprocher, ce qui augmente le FRET. Les FIBS de glucose (à droite) suit le principe Apo-Max, par lequel le glucose se lie au domaine de détection et génère un changement de conformation qui sépare les protéines fluorescentes, diminuant ainsi FRET.
Figure 2. Vue d'ensemble de la méthodologie pour FIBS étalonnage et la quantification non invasive subséquente de glucose intracellulaire et les concentrations de glutamine.
Figure 3. Profil de concentration cellulaire viable pour le lot proliférer cultures de glucose et de glutamine-FIBS FIBS-exprimant des lignées de cellules CHO (n = 2 répétitions biologiques avec les trois mesures par lignée cellulaire).
Figure 4. Culture fed-batch de FIBS produisant des cellules CHO et les mesures de FRET correspondant. (A) Daily moiasurements de rapport FRET de fed-batch CHO cultures de cellules exprimant FIBS de glucose. La flèche indique l'addition de glucose à la culture cellulaire. (B) Actual profil de la concentration intracellulaire de glucose mesurée en utilisant un kit de dosage de glucose par rapport aux valeurs prédites basées sur le glucose in vivo courbe d'étalonnage (Tableau 1). (C) Les mesures quotidiennes de rapport FRET de fed-batch CHO cultures de cellules exprimant FIBS de glutamine. La flèche indique l'addition de glutamine à la culture cellulaire. (D) Actual profil de concentration de glutamine intracellulaire mesurée en utilisant un kit de dosage de la glutamine à l'encontre valeurs prédites sur la base de la glutamine in vivo courbe d'étalonnage (Tableau 1). Dans tous les cas, n = 2 répétitions biologiques avec trois mesures par la lignée cellulaire.
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Discussion
Les FIBS permettent in vivo et la quantification in situ des molécules clés dans, dans ce cas des nutriments limitant la croissance, éliminer les incertitudes découlant de la trempe et de l'extraction des méthodes. Les résultats suggèrent qu'il existe une bonne corrélation entre le signal de FIBS et les concentrations intracellulaires de l'ordre de 1-5 mM pour le glucose et 0,3-2 mM pour la glutamine. Dans le lot CHO culture cellulaire, ces concentrations sont rencontrées dans les phases de déclin exponentiel, fixes, et au début. Les phases exponentielles et fixes sont les plus critiques en termes de conception de stratégies d'alimentation appropriées, l'utilisation de ces biocapteurs pour estimer les besoins métaboliques des cellules est donc pertinente pour l'industrie. Les résultats de l'expérience fed-batch "confirment la pertinence des FIBS pour fournir des estimations de glucose intracellulaire et des concentrations de glutamine. Écarts exposées à des moments antérieurs ont pu surgir en raison de faible nombre de cellules viablesbres et / ou en raison de l'interférence par d'autres metabolites, par exemple en galactose dans le cas des FIBS de glucose, et par d'autres acides aminés dans le cas des FIBS de glutamine. Plus précisément, il a été montré que la réduction maximale de 20% du ratio FRET peut se produire en présence de l'aspartate, le glutamate, la glycine, la thréonine, la valine, la tyrosine et 15. Dans l'ensemble, ces résultats suggèrent que l'erreur dans le signal de FIBS est assez faible.
Bien que cette méthode ne peut contrôler un nombre limité de molécules à la fois, il peut fournir des informations utiles pour la lignée cellulaire et le développement de processus, ou l'acquisition même de données pour la validation des modèles mathématiques. Compte tenu de la diversité de protéines de liaison périplasmiques, les biocapteurs similaires peuvent être développées pour une rangée de petites molécules, y compris d'autres acides aminés, des sucres et des ions tels que le sulfate et le phosphate de 16, ce qui en fait un procédé polyvalent pour le métabolite quantification en temps réel dans des cellules vivantes .
Un des principaux avantages de l'utilisation de FIBS est la capacité à obtenir des mesures en ligne potentiellement d'une manière continue. La méthode se prête donc pour les applications à haut débit qui permettent de réduire la manutention manuelle et accélérer les efforts de développement. Avec la disponibilité accrue des environnements de micro-réacteur avec fonctionnalité intégrée pour la détection de la fluorescence, il est envisagé qu'un métabolite FIBS activé plate-forme de profilage peut être utilisé pour le dépistage de la cellule, les médias et l'optimisation des processus, et le processus à l'échelle.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions M. Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, l'Université de Stanford) d'avoir bien voulu nous fournir le glucose FRET plasmide et le Dr Uwe Ludewig (Université Hohenheim) pour fournir de bien vouloir la glutamine FRET construction dans l'usine vecteur d'expression pUTKan. AB est financé par le programme des Bourses d'études prioritaires BBSRC ciblée. La CK et KP sont pris en charge par des bourses RCUK en traitement Biopharmaceuticals. CK tient également à remercier Lonza Biologics pour leur soutien financier. Le Centre pour la biologie synthétique et d'innovation est généreusement soutenu par l'EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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