Summary
Eine Beschreibung, wie Förster Resonance Energy Transfer integriert biologischen Sensoren (FIBS) zur in-situ-Kalibrierung Metabolic Profiling vorgestellt. Die FIBS kann verwendet werden, um die intrazellulären Spiegel von Metaboliten nicht-invasiv Unterstützung bei der Entwicklung von Stoffwechselmodelle und Hochdurchsatz-Screening von Bioprozess-Bedingungen zu messen.
Abstract
Im Zeitalter der Computerbiologie, neue Hochdurchsatz-Versuchssysteme, um zu füllen und zu verfeinern Modelle, so dass sie für Prognosezwecke validiert werden erforderlich. Idealerweise würden solche Systeme mit geringem Volumen, die Probenahme und destruktiven Analysen ausschließt, wenn die Zeit natürlich Daten erhalten werden sollen sein. Was benötigt wird, ist eine in-situ-Monitoring-Tool, das in Echtzeit und nichtinvasiv die notwendigen Informationen mitteilen können. Eine interessante Möglichkeit ist die Verwendung von Fluoreszenz-, Protein-basierte biologische in vivo-Sensoren als Reporter der intrazellulären Konzentrationen. Eine besondere Klasse von Biosensoren, die in vivo-Anwendungen in Metaboliten Quantifizierung gefunden ist, wird auf Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) zwischen zwei fluoreszierenden Proteinen, die von einem Ligandenbindungsdomäne basierend verbunden. FRET integrierten biologischen Sensoren (FIBS) konstitutiv in der Zelllinie hergestellt, sie haben schnelle Reaktionszeiten und ihre spektralen chaschaften bezogen auf die Konzentration des Metaboliten in der Zelle ändern. In dieser Arbeit wird das Verfahren zur Konstruktion des chinesischen Hamsters (CHO)-Zelllinien, die konstitutiv ein FIBS für Glukose und Glutamin und die Kalibrierung der FIBS in vivo im Batch Zellkultur, um zukünftige Quantifizierung von intrazellulären Metaboliten-Konzentration zu ermöglichen beschrieben. Daten von Fed-Batch-Kulturen von CHO-Zellen zeigt, daß die FIBS konnte in jedem Fall, um die sich ergebende Änderung der intrazellulären Konzentration zu detektieren. Verwendung des Fluoreszenzsignals von den FIBS und der zuvor konstruierten Eichkurve wurde die intrazelluläre Konzentration genau bestimmt, wie durch einen unabhängigen enzymatischen Assay bestätigt.
Introduction
Metabolite Überwachung hat verschiedene Anwendungen in der Bioverfahrenstechnik, einschließlich Prozessentwicklung, Medien-und Futtermittel-Design und Metabolic Engineering. Verschiedene Verfahren sind durch die Verwendung von enzymatischen 1, Chemie 2, 3 oder Bindungsassays für Konzentrationsmessungen zur Verfügung. Eine interessante Möglichkeit ist die Verwendung von Fluoreszenz-, Protein-basierte biologische in vivo-Sensoren, die Daten über die intrazelluläre Konzentration von Schlüsselmetaboliten. Im Ultra-Low-Volume-Assays, Fluoreszenz ist ein geeignetes Mittel, wie Miniaturisierung tatsächlich verbessert das Signal-zu-Rausch-Verhältnis von 4,5 und einer proteinbasierte Sensoren können genetisch codierten Sinne, dass keine exogenen Reagenzien zur Metabolitenanalyse notwendig sind. Förster Resonanz Energie Transfer (FRET) Biosensoren bestehen aus zwei fluoreszierenden Proteinen, die von einem Liganden-bindenden Domäne verbunden ist. FRET ist eine strahlungslose Energieübertragung von einem photoangeregten Donor zu einem Akzeptor-Fluoreszenzmolekül locat in unmittelbarer Nähe (<100) ed. Liganden oder Bindungsspaltung bewirkt eine Konformationsänderung in den Sensor, der wiederum induziert eine Änderung in der Nähe der Fluorophore, die zu einer Änderung im FRET-Effizienz durch die Änderung im Emissionsspektrum gemessen. FRET integrierten biologischen Sensoren (FIBS) konstitutiv in der Zelllinie hergestellt und ihre spektralen Eigenschaften ändern sich die Konzentration des Metaboliten in der Zelle. FIBS haben schnelle Reaktionszeiten machen sie ideal für Messungen für dynamische Modelle 6. Zurück Anwendungen umfassen die Überwachung und mehrfache Einzel 7-9 10 Metaboliten und Bereitstellung von Daten über raumzeitliche Verteilung 11. Apo-Max, wobei die Ligandenbindung stört die Nähe der Fluorophore Senkung der Energieübertragung und Apo-Min, wobei die Ligandenbindung bringt die beiden Fluorophore in engeren Kontakt (Fig. 1): FIBS kann in zwei Konfigurationen erzeugt werden.
_content "> In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die Konstruktion von Chinese Hamster Ovary (CHO)-Zelllinien, die konstitutiv ein FIBS ein Metabolit Glucose oder Glutamin dargestellt. eine Methodik für die Kalibrierung des Sensors in vivo eingerichtet, um künftige quantitative Freigabe Messungen der intrazellulären Metaboliten-Konzentration, wie in Fig. 2 dargestellt. Auf dieser Grundlage wird die intrazelluläre Konzentration von Glucose oder Glutamin in Fed-Batch-Kulturen von CHO-Zellen bestimmt werden, an denen die beiden Nährstoffe in hohen Konzentrationen in-Verfahren zugegeben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Verwendung des Fluoreszenzsignals von den FIBS und dem zuvor konstruierten Eichkurve ist genau Vorhersage der intrazellulären Konzentration möglich, von einem unabhängigen enzymatischen Test bestätigt. Dieses Verfahren bietet wesentliche Vorteile gegenüber gegenwärtigen analytischen Techniken, da sie nicht invasiv ist, kostengünstige und schnell, was eine Echtzeit-Signal der FIBS, die mon seinwährend der Kultivierungs itored.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Zelllinie Revival und Wartung
- Revive CHO-Zellen in 9 ml CD-CHO-Medium mit 8 mM L-Glutamin und 10 ml / L 100x Hypoxanthin / Thymidin-Supplement (komplette Wachstumsmedium) ergänzt.
- Zentrifuge bei 100 × g für 5 min.
- Resuspendieren der Zellen in 10 ml frisches vollständiges Wachstumsmedium.
- Entfernen einer 1 ml Probe und bestimmen die Lebendzellkonzentration mittels Lichtmikroskopie mit der Trypanblau-Ausschluss-Verfahren in einer Zählkammer.
- Initiieren einer Kultur bei einer Aussaatdichte von 3 x 10 5 Zellen / ml in 125 ml-Schüttelkolben.
- Erhaltung der Kultur im Brutschrank bei 37 ° C, einer befeuchteten Atmosphäre von 5% CO 2, auf einem Orbitalschüttler bei 120 Umdrehungen pro Minute dreht.
- Subkultivierung alle 3-4 Tage in komplettem Wachstumsmedium bei einer Aussaatdichte von 2 x 10 5 Zellen / ml.
2. Transfektion der Zelllinie mit dem Plasmid Containing den Biosensor Gene
- Bereiten Plasmid-DNA mit einem großen Plasmid-Reinigungs-Kits.
- Aufrechterhaltung Zellen an den entsprechenden Bedingungen (37 ° C, 5% CO 2) 12-24 Stunden vor der Transfektion, um sicherzustellen, dass die Zellen sich aktiv teil Zeitpunkt der Transfektion.
- Zählen der Zellen unter Verwendung des Trypanblau-Ausschlussverfahrens, bereiten dann ein Arbeitsvolumen von 20 ml der Zellkultur in einem 125 ml Schüttelkolben in einer Konzentration von 1 x 10 6 Zellen / ml.
- Verwenden Sie eine geeignete Transfektion Kit für die Zelllinie verwendet wird. Die Plasmid-DNA zu Transfektionsreagenzien Verhältnis wird abhängig von der Zelllinie und Vektor sein. Es wird empfohlen, dass diese durch Testen eines Bereichs von Verhältnissen innerhalb des durch den Hersteller vor der Durchführung der abschließenden Transfektionen angegeben optimiert. Auch halten mindestens eine negative Kontrollkultur, die Zellen aber keine DNA enthalten.
- Inkubation für 4 Tage im statischen Modus und dann zu einem shaki übertragenng-Plattform bei 125 Umdrehungen pro Minute rotiert.
- Fügen Sie den entsprechenden Antibiotikum für Plasmid-Selektion auf eine geeignete Konzentration, wie durch einen Kill-Kurve bestimmt. In dieser Studie wurde Zeocin bis zu einer Endkonzentration von 400 ug / ml für die Selektion von transfizierten Zellen zugegeben.
- Ändern Sie Medien zu einem geeigneten Zeitintervall für die Zelllinie, das Hinzufügen Antibiotikum jedes Mal, bis die Zellen in Steuer gut sind gestorben.
- Mit den meisten Brunnen konfluenten Kulturen Schütteln Fortschritt.
- Schaffung eines Zellbank durch Einfrieren der Zellen in Kryoröhrchen mit 10 7 lebensfähigen Zellen in 1 ml Gefriermischung. In dieser Arbeit besteht diese aus 92,5% Wachstumsmedium und 7,5% Dimethylsulfoxid.
3. Batch-und Fed-Batch-Zellwachstumskurve
- Folgen Sie den Anweisungen für die Zellwartungs oben, um dreifach-Zellkulturen der transfizierten CHO-Zellen in 250 ml etablieren Schüttelkolben mit einem Arbeitsvolumen von 50 ml.
- Pflegen Sie die kulAuflösung in einem befeuchteten Zell Inkubator bei 37 ° C mit 5% CO 2, auf einem Orbitalschüttler bei 125 Umdrehungen pro Minute dreht, und entfernen 4,1 ml Proben von jeder wachsenden Kultur bei 24 Stunden Intervallen.
- Verwenden von 100 &mgr; l der Probe, um die Konzentration lebensfähiger Zellen und die Lebensfähigkeit der Zellen mit Trypan-Blau-Ausschlussverfahren zu bestimmen.
- Wiederholen, bis die Konzentration lebensfähiger Zellen auf Null reduziert wird.
- Wiederholen für die Fed-Batch-Zellkulturen die Ergänzung mit der entsprechenden Menge an Glucose oder Glutamin am Tag 6 nach deren Konzentrationen auf ihre Anfangswerte von 36 mm und 4 mm wiederherzustellen sind. Es wird empfohlen, dass zusätzliche Kontrollkulturen werden auch erhalten, was mit dem gleichen Volumen (12 ml in diesem Fall) von reinem Wasser zugeführt werden.
4. FRET-Messungen Verhältnis
- Nehmen 2 ml der Proben täglich in Schritt 3.2 Zentrifuge entfernt und bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C.
- Resuspendete das Zellpellet in 2 ml eiskalter phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS). Bringen Sie diese in eine 6-Well-Platte und fügen Sie eine Leerprobe, die keine Zellen, die man gut.
- Messen Sie die Höhe der blauen und gelben Fluoreszenz sofort bei einer Anregungswellenlänge von 430/435 nm und Emissionswellenlängen von 465/435 nm (blau) und 520/510 nm (gelb).
- Berechnen Sie die FRET-Ratios (Verhältnis von gelben Fluoreszenz über blaue Fluoreszenz erfasst wird).
5. Metabolite Assays
- Nehmen 2 ml der Proben täglich in Schritt 3.2 Zentrifuge entfernt und bei 100 × g für 5 min bei 4 ° C. Entfernen Sie den Überstand.
- Zellpellet in 3 ml eiskaltem PBS gewaschen und erneut zentrifugieren bei 100 × g für 5 min.
- Den Überstand und Zellpellet in 3 ml eiskaltem PBS wie oben. Beschallen der Probe 5x für jeden 3 min bei einem Puls von 15 Sek. auf 15 Sek. und ausgeschaltet. An diesem Punkt ist die Zelle zusätzlichects, falls gewünscht eingefroren werden.
- Verwenden ein geeignetes Glucose-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers an Proben von Zellextrakten, die intrazellulären Glucosekonzentration zu ermitteln (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Verwenden Sie geeignete Standards, um eine Standardkurve zu konstruieren. In dieser Arbeit, die Konzentration der Standards lag zwischen 0-100 mM. - Verwendung der Messwerte für die Standards, die Standardkurve zu konstruieren, und um die lineare Gleichung der besten Anpassung (in diesem Fall y = 1310.51x - 723,43 wobei y die Absorptionsmessung und x der Glucosekonzentration).
- Berechnen Sie die Glucose-Konzentrationen anhand der Standardkurve und unter Berücksichtigung der Verdünnung. Die intrazellulären Glukosekonzentration kann dann berechnet werden unter Verwendung dieser Gleichung:
Für CHO-Zellen, wurde die Einzelzellvolumen berechnet wird unter Verwendung eines Zelldurchmesser von 12 &mgr; M 12 - Verwenden Sie eine geeignete Glutamin-Assay-Kit nach den Anweisungen des Herstellers an Proben von Zellextrakten, um die intrazellulären Glutamin-Konzentration zu bestimmen (siehe Tabelle der Materialien).
Hinweis: Verwenden Sie geeignete Standards, um eine Standardkurve zu konstruieren. In dieser Arbeit, die Konzentration der Standards lag zwischen 0-2 mM. - Wie in 5.5 oben, Die Eichkurve (in diesem Fall y = + 17,1 203.1x wobei y die Absorptionswert ist und x die Glucosekonzentration)
- Mit der Standardkurve, die Berechnung der Glutamin-Konzentration der Proben, wobei die Verdünnung berücksichtigt. Die intrazelluläre Konzentration Glutamin können unter Verwendung der obigen Gleichung 1 berechnet werden.
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Representative Results
Ein Überblick der Methoden ist in Fig. 2 dargestellt. In der hier vorgestellten Arbeit wurden CHO-Zellen mit dem Vektor FIBS und stabile Zelllinien transfiziert wurden bei einem Antibiotikum Druck von 400 ug / ml Zeocin selektiert. Daher wurden zwei verschiedene stabile Zelllinien, die konstitutiv die Glucose und Glutamin Sensoren geschaffen. Fig. 1 zeigt die Konfiguration der beiden Biosensoren in dieser Studie verwendet. Der Glukosesensor ist auf der Apo-Max-Prinzip und die entsprechende Plasmid pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Dies ist eine Mischung des verstärkten cyan fluoreszierende Protein (ECFP) und der Aphrodite Variante des Enhanced Yellow Fluorescent Protein (EYFP) mit der Mutante F16A des E. coli Glucose / Galactose periplasmatische Bindeprotein. 11 Aminosäurereste wurden aus der Linker-Region entfernt, um FRET-Effizienz 13 zu verbessern. Dieser Vektor wurde mit der uniq in die pCDNA4/TO kloniertue Eco RI und Pst I-Restriktionsstellen, die einen Cytomegalovirus-Promotor und ein SV40-Enhancer verwendet.
Die Glutamin-Sensor ist an der Apo-Min-Prinzip (Fig. 1) und die entsprechende Plasmid wurde aus einer Insertion des gelb fluoreszierenden Proteins Citrine in den E. abgeleitet coli Glutamin periplasmatische Bindeprotein zwischen den Aminosäuren 98 und 99 mit einem ECFP an den C-Terminus gebunden. Die Struktur wurde durch Deletion von Resten in der Bindungsbereich versteift worden ist, während die Aminosäuresubstitution D157N hat zur QBP gemacht worden, um die Affinität für Glutamin, gefolgt von mehreren Mutationen zu erhöhen, um FRET-Effizienz 8 zu optimieren. Die Glutamin-FRET-Konstrukt wurde in den Pflanzenexpressionsvektor pUTkan zugeführt und wurde mit Bam HALLO und Sal I verdaut, um das Insert freizusetzen. Das letztere wurde in die entsprechenden Restriktionsstellen in den Vektor pET41a im Rahmen mit der N-terminalen Reinigungs t kloniertags. Das gleiche Insert wurde in den Vektor ligiert pCDNA4/TO, nachdem es mit Bam HALLO und XhoI kompatibel mit den klebrigen Enden von SalI und XhoI hergestellt, um den Säugetier-Expressionsvektor zu erzeugen verdaut wurde.
Plasmid-Expression wurde durch die Quantifizierung der mRNA-Spiegel der Biosensoren mit qRT-PCR bestätigt. Beide FIBS wurden gefunden, um sich aktiv an 25-44 mRNA-Kopien pro Zelle transkribiert werden unter der Annahme, β-Aktin bei 3.000 Transkripte pro Zelle an der mittleren exponentiellen Level 14.
Batch Wuchskulturen von jeder Zelllinie wurden erhalten unter Tagesproben für die in-vivo-Kalibrierung jedes FIBS. Die lebensfähige Zellwachstumsprofil der beiden Zelllinien ist in Fig. 3 und die entsprechenden FRET-Messungen und intrazellulären Metaboliten-Konzentrationen durch enzymatische Tests bestimmt, gezeigt in Tabelle 1 dargestellt. Ein Fluoreszenzplattenlesegerät wurde verwendet, um zu messenFluoreszenz der Proben bei einer Anregungswellenlänge von 430/35 nm und Emissionswellenlängen von 465/435 nm für Cyan und 520/510 nm für Gelb. Es wurde festgestellt, dass geringe Zellzahlen in den ersten 4 Tagen der Kultur vorhanden führte zu unzuverlässig FRET-Signals. Auch die hohe Zell lysiert Tag 8 der Kultur vorhanden produziert eine große Menge der Lichtstreuung. Nur Daten für 4-8 Tage wird daher verwendet, um die Kalibrierungskurven für die Glucose und Glutamin FIBS zu konstruieren, werden die Gleichungen für die in Tabelle 1 gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die FIBS-Signal erzeugt eine zuverlässige Korrelation mit den intrazellulären Konzentrationen von 1-5 mM für Glukose und 0,3-2 mM Glutamin.
Danach und auf die obigen Feststellungen bestätigen, Fed-Batch-Kultur überwuchern der zwei Zelllinien durchgeführt. Eine Beschickung, die hohe Substratkonzentration (Glukose im Fall der Glucose FIBS und Glutamin im Fall der Glutamin FIBS) ergänzt wurdeam 6. Tag der Zellkultur, um die extrazellulären Konzentrationen des Substrats zu erhöhen. Im Fall des Glukose-fed Kultur wurde die extrazelluläre Glukosekonzentration wieder auf 36 mm erhöht wird, während für die Glutamin-fed-Kultur wurde das Glutamin-Konzentration 4 mM erhöht. Fig. 4 zeigt repräsentative Ergebnisse aus dieser Studie. 4A und 4C zeigen die FRET-Verhältnisse an jedem Tag, die eindeutig auf die Fütterung reagieren, indem sie die Trendwende folgten sie bis zu 6 Tage. Insbesondere in Fig. 4A ist die FRET-Wert für Glucose FIBS CHO-Zelllinie verringert am Tag 7 in Reaktion auf Glucose hinaus, da die Glucose FIBS folgt der APO-On-Konfiguration. Ähnlich wird in Fig. 4C die FRET-Verhältnis für den Glutamin FIBS CHO-Zelllinie erhöht in Reaktion auf Glutamin zusätzlich im Einklang mit dem Prinzip der Apo-Aus-Sensoren.
Diese FRET-Messungen wurden schließlich verwendet, um calculate die entsprechende intrazelluläre Glucose und Glutamin-Konzentrationen auf der Basis der oben erwähnten Kalibrierungskurven und die Ergebnisse sind in Fig. 4B für Glukose und Glutamin Fig. 4D gezeigt. Sie sind auf die tatsächlichen intrazellulären Konzentrationen dieser Substrate wie bei der Glucose und Glutamin enzymatische Assays bestimmt und zeigen, angemessene Vereinbarung verglichen.
.. Tabelle 1 Ergebnisse von in-vivo-Kalibrierung von FRET-Wert für Glucose und Glutamin FIBS Die Eichkurven werden durch die folgenden Gleichungen, die verwendet werden können, um Vorhersagen zu machen beschrieben: y = 1.232x + 8.034 für Glucose (R 2 = 0,961), und y = 1.892x + 0,332 für Glutamin (R 2 = 0,879), wobei y die FRET-Verhältnis ist und x die Konzentration in mM.
1. Grundsätze der in dieser Studie verwendeten FIBS. Glutamin FIBS (links) dem Apo-Min-Prinzip, mit dem Glutamin bindet an den Erfassungsbereichen und erzeugt eine Konformationsänderung, die beide Fluoreszenzproteine näher zusammen bringt, wodurch FRET. Die Glukose FIBS (rechts) folgt der Apo-Max-Prinzip, mit dem Glucose bindet an das Sensor Domain und erzeugt eine Konformationsänderung, die die fluoreszierenden Proteine trennt, dh verringert FRET.
Abbildung 2. Übersicht der Methodik für FIBS Kalibrierung und anschließende nicht-invasive Quantifizierung intrazellulärer Glukose und Glutamin-Konzentrationen.
3. Lebendzellkonzentrationsprofil für die Chargenwuchskulturen von Glukose und Glutamin-FIBS FIBS-exprimierenden CHO-Zelllinien (n = 2 biologischen wiederholt mit drei Messungen pro Zelllinie).
4. Fed-Batch-Kultur der FIBS-produzierenden CHO-Zellen und entsprechende FRET-Messungen. (A) Tägliche michasurements von FRET-Verhältnis von Fed-Batch-CHO-Zellkulturen zum Ausdruck Glukose FIBS. Der Pfeil zeigt die Zugabe von Glukose zu der Zellkultur. (B) Die tatsächliche intrazellulären Glukosekonzentrationsprofil gemessen unter Verwendung einer Glucose-Assay-Kit gegen vorhergesagte Werte für in-vivo-Glucoseeichkurve (Tabelle 1) berechnet. (C) tägliche Messungen der FRET-Verhältnis von Fed-Batch-CHO-Zellkulturen zum Ausdruck Glutamin FIBS. Der Pfeil zeigt die Zugabe von Glutamin zu der Zellkultur. (D) Die tatsächlichen intrazellulären Glutamin Konzentrationsprofil unter Verwendung eines Assay-Kit Glutamin gegen vorhergesagte Werte anhand von in vivo Glutamin Eichkurve (Tabelle 1). In allen Fällen ist n = 2 biologischen wiederholt mit drei Messungen pro Zelllinie.
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Discussion
Die FIBS ermöglichen in vivo und in situ Quantifizierung von Schlüsselmoleküle, in diesem Fall das Wachstum einschränkende Nährstoffe, die Unsicherheiten, die aus dem Abschrecken und Extraktionsverfahren. Die Ergebnisse legen nahe, dass es eine gute Korrelation zwischen der FIBS Signal und die intrazellulären Konzentrationen im Bereich von 1-5 mM für Glucose und 0,3-2 mM Glutamin. Im Batch-CHO-Zellkultur, sind diese Konzentrationen in den exponentiellen, stationär, und Anfang der Rückgang Phasen aufgetreten. Die exponentiellen und stationären Phasen sind besonders kritisch hinsichtlich der Gestaltung geeigneter Fütterungsstrategien, die Verwendung dieser Biosensoren zur Abschätzung der Stoffwechselbedürfnisse der Zellen ist daher industriell relevant. Die Ergebnisse der Fed-Batch-Experiment bestätigen FIBS Eignung Schätzungen der intrazelluläre Glucose und Glutamin-Konzentrationen bereitzustellen. Abweichungen zu früheren Zeitpunkten zeigten kann wegen der geringeren Lebendzell num entstandendern und / oder aufgrund von Störungen durch andere Metaboliten, z. B. durch Galactose im Fall der Glucose FIBS und durch andere Aminosäuren in dem Fall der Glutamin FIBS. Insbesondere hat sich gezeigt, dass eine Reduktion von bis zu 20% in der FRET-Verhältnis kann in Gegenwart von Aspartat, Glutamat, Glycin, Threonin, Valin, Tyrosin und 15 auftreten. Insgesamt deuten diese Ergebnisse, dass Fehler in der FIBS-Signal ziemlich niedrig ist.
Obwohl diese Methode kann eine begrenzte Anzahl von Molekülen in einer Zeit nur zu überwachen, können sie nützliche Informationen für die Zelllinie und Prozessentwicklung, oder Erfassungsdaten für die Validierung der mathematischen Modelle zu liefern. Angesichts der Vielfalt von periplasmatischen Bindungsproteine, können ähnliche Biosensoren für ein Array für kleine Moleküle mit anderen Aminosäuren, Zucker und Ionen wie Sulfat und Phosphat 16 entwickelt werden, so dass dies eine vielseitige Methode zur Quantifizierung Metaboliten in Echtzeit in lebenden Zellen .
Ein wichtiger Vorteil der Verwendung von FIBS ist die Möglichkeit, Online-Messungen in einer kontinuierlichen Weise potentiell zu erhalten. Das Verfahren eignet sich daher für Anwendungen mit hohem Durchsatz, die manuelle Handhabung zu reduzieren und Entwicklungsbemühungen beschleunigen können. Mit der zunehmenden Verfügbarkeit von Mikroreaktor-Umgebungen mit integrierten Funktionen für die Fluoreszenzdetektion, ist vorgesehen, dass ein FIBS-fähigen Metabolite Profiling-Plattform kann für Zell-Screening-, Medien-und Prozessoptimierung und Scale-up-Verfahren verwendet werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir danken Professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) für die freundliche Bereitstellung uns mit dem Glukose-FRET-Plasmid und Dr. Uwe Ludewig (Universität Hohenheim) für die freundliche Versorgung der Glutamin-FRET-Konstrukt in der pUTkan Pflanzenexpressionsvektor. AB wird durch die BBSRC Gezielte Priorität Studentprogramm finanziert. Sowohl CK und KP sind durch RCUK Fellowships in Biopharmaceuticals Verarbeitung unterstützt. CK möchte auch Lonza Biologics für die finanzielle Unterstützung bedanken. Das Zentrum für Synthetische Biologie und Innovation wird großzügig von der EPSRC unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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