Summary
सीटू चयापचय रूपरेखा में के लिए फोरस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण एकीकृत जैविक सेंसर (fibs) जांचना करने का एक विवरण प्रस्तुत किया है. Fibs noninvasively चयापचय मॉडल और बायोप्रोसैस शर्तों के उच्च throughput स्क्रीनिंग के विकास में सहायता मेटाबोलाइट्स के intracellular स्तर को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
कम्प्यूटेशनल बायोलॉजी के युग में, नए उच्च throughput प्रायोगिक प्रणाली वे भविष्य कहनेवाला प्रयोजनों के लिए मान्य किया जा सकता है, ताकि मॉडल आबाद और परिष्कृत करने के क्रम में आवश्यक हैं. आदर्श रूप में इस तरह की व्यवस्था समय बेशक डेटा प्राप्त हो रहे हैं जब नमूना और विनाशकारी विश्लेषण precludes जो कम मात्रा होगा. क्या जरूरत है वास्तविक समय में और noninvasively आवश्यक जानकारी रिपोर्ट कर सकते हैं जो एक में सीटू निगरानी उपकरण है. एक दिलचस्प विकल्प फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल होता है, प्रोटीन आधारित intracellular सांद्रता के संवाददाताओं के रूप में विवो जैविक सेंसर में. Metabolite मात्रा का ठहराव में आवेदन मिल गया है कि vivo में biosensors के एक विशेष वर्ग के एक ligand बाध्यकारी डोमेन से जुड़े दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन के बीच फोरस्टर प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) पर आधारित है. एकीकृत जैविक सेंसर (fibs) झल्लाहट अनिवार्यता से सेल लाइन के भीतर उत्पादन कर रहे हैं, वे तेजी से प्रतिक्रिया समय और उनके वर्णक्रमीय चा हैकक्ष के भीतर metabolite की एकाग्रता पर आधारित बदल racteristics. इस पत्र में, intracellular metabolite एकाग्रता का भविष्य मात्रा का ठहराव सक्षम करने के क्रम में रचनात्मक रूप में ग्लूकोज और glutamine के लिए एक fibs कि एक्सप्रेस (चो) सेल लाइनों चीनी हम्सटर अंडाशय के निर्माण और बैच सेल संस्कृति में vivo में fibs औजार के लिए विधि वर्णित है. खिलाया बैच चो सेल संस्कृतियों से डाटा fibs intracellular एकाग्रता में जिसके परिणामस्वरूप परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रत्येक मामले में सक्षम था कि यह दर्शाता है. एक स्वतंत्र एंजाइमी परख द्वारा पुष्टि के रूप में fibs और पहले से निर्माण किया अंशांकन वक्र से फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग करना, intracellular एकाग्रता सही निर्धारित किया गया था.
Introduction
Metabolite निगरानी प्रक्रिया विकास, मीडिया और चारा डिजाइन, और चयापचय इंजीनियरिंग सहित Bioprocessing में विभिन्न अनुप्रयोगों, है. विभिन्न तरीकों एंजाइमी 1, रासायनिक 2, या बाध्यकारी assays 3 के प्रयोग के माध्यम से एकाग्रता माप के लिए उपलब्ध हैं. एक दिलचस्प विकल्प फ्लोरोसेंट का इस्तेमाल होता है, प्रोटीन आधारित कुंजी मेटाबोलाइट्स के intracellular एकाग्रता के संवाददाताओं के रूप में विवो जैविक सेंसर में. Miniaturization वास्तव में संकेत करने वाली शोर अनुपात 4,5 सुधार और प्रोटीन आधारित सेंसर आनुवंशिक रूप से कोई एक्सोजेनस अभिकर्मकों metabolite विश्लेषण के लिए आवश्यक हैं कि अर्थ इनकोडिंग जा सकता है के रूप में अल्ट्रा कम मात्रा assays में प्रतिदीप्ति एक सुविधाजनक उपकरण है. Forster प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) biosensors एक ligand बाध्यकारी डोमेन से जुड़े दो फ्लोरोसेंट प्रोटीन से मिलकर. झल्लाहट एक स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट अणु locat के लिए एक फोटो उत्साहित दाता से ऊर्जा का एक nonradiative हस्तांतरण है करीब निकटता (<100) में एड. Ligand दरार या बंधन बारी में, उत्सर्जन स्पेक्ट्रम में बदलाव से मापा झल्लाहट दक्षता में एक परिवर्तन के लिए अग्रणी fluorophores की निकटता में एक परिवर्तन लाती है, जो सेंसर में एक गठनात्मक परिवर्तन का कारण बनता है. झल्लाहट एकीकृत जैविक सेंसर (fibs) अनिवार्यता से सेल लाइन के भीतर उत्पादन कर रहे हैं और उनके वर्णक्रमीय विशेषताओं सेल के भीतर metabolite की एकाग्रता के आधार पर बदल. Fibs गतिशील मॉडल 6 माप लेने के लिए उन्हें आदर्श के तेजी से प्रतिक्रिया समय है. पिछला अनुप्रयोगों 7-9 एकल और एकाधिक 10 मेटाबोलाइट्स निगरानी और spatiotemporal वितरण 11 पर डाटा उपलब्ध कराने में शामिल हैं. Ligand बाध्यकारी ऊर्जा हस्तांतरण और ligand बाध्यकारी करीब संपर्क (चित्रा 1) में दो fluorophores लाता है जहां ए पी ओ मिन, कम करने fluorophores की निकटता बाधित जहां APO-मैक्स,: fibs दो विन्यास में बनाया जा सकता है.
इस काम में _content ">, एक प्रोटोकॉल अनिवार्यता से एक metabolite, ग्लूकोज या glutamine के लिए एक fibs कि एक्सप्रेस (चो) सेल लाइनों चीनी हम्सटर अंडाशय के निर्माण के लिए प्रस्तुत किया है. एक पद्धति विवो में सेंसर की जांच के लिए स्थापित किया है, भविष्य मात्रात्मक सक्षम करने के लिए चित्रा 2 में प्रस्तुत किया. इस आधार पर intracellular metabolite एकाग्रता की माप, ग्लूकोज या glutamine के intracellular एकाग्रता जो दो पोषक तत्वों में प्रक्रिया उच्च सांद्रता में जोड़ा गया था करने के लिए, फेड बैच चो सेल संस्कृतियों में निर्धारित किया जा सकता है. परिणाम यह noninvasive, कम लागत वाली है क्योंकि एक स्वतंत्र एंजाइमी परख द्वारा पुष्टि के रूप में fibs और पहले से निर्माण किया अंशांकन वक्र से फ्लोरोसेंट संकेत का उपयोग कर, intracellular एकाग्रता की सही भविष्यवाणी, संभव है कि प्रदर्शित करता है. इस विधि वर्तमान विश्लेषणात्मक तकनीकों में काफी लाभ प्रदान करता है और, तेजी से सोम हो सकता है कि fibs के एक वास्तविक समय संकेत दे रही हैसंस्कृति भर itored.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. सेल लाइन पुनरुद्धार और रखरखाव
- 8 मिमी एल glutamine और 10 मिलीग्राम / एल 100x hypoxanthine / thymidine पूरक (पूर्ण मध्यम विकास) के साथ पूरक 9 मिलीलीटर CD-चो माध्यम में चो कोशिकाओं को पुनर्जीवित.
- 5 मिनट के लिए 100 XG पर अपकेंद्रित्र.
- ताजा पूरा मध्यम विकास के 10 एमएल में कोशिकाओं Resuspend.
- एक 1 एमएल नमूना निकालें और एक hemocytometer में trypan नीले डाई अपवर्जन विधि का उपयोग कर प्रकाश माइक्रोस्कोपी से व्यवहार्य सेल एकाग्रता का निर्धारण.
- 125 मिलीलीटर में 3 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक बोने घनत्व में एक संस्कृति का आरंभ बोतल हिला.
- 120 rpm पर घूर्णन एक कक्षीय मिलाते हुए मंच पर, 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 के एक humidified वातावरण में एक मशीन में संस्कृति को बनाए रखने.
- 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल के एक बोने घनत्व पर पूरा मध्यम विकास में हर 3-4 दिनों उपसंस्कृति.
2. प्लाज्मिड सी के साथ सेल लाइन के अभिकर्मकBiosensor जीन ontaining
- एक बड़े पैमाने पर प्लाज्मिड शुद्धि किट का उपयोग प्लास्मिड डीएनए तैयार करें.
- (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2) पूर्व अभिकर्मक को 12-24 घंटा कोशिकाओं को सक्रिय अभिकर्मक के समय में बांट रहे हैं सुनिश्चित करने के लिए उपयुक्त परिस्थितियों में कोशिकाओं को बनाए रखें.
- Trypan नीले डाई अपवर्जन विधि का उपयोग कोशिकाओं की गणना, तो 1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता में कुप्पी हिला एक 125 मिलीलीटर में सेल संस्कृति की 20 मिलीलीटर की एक काम मात्रा तैयार करते हैं.
- प्रयोग में सेल लाइन के लिए एक उपयुक्त अभिकर्मक किट का प्रयोग करें. अभिकर्मक अभिकर्मकों अनुपात को प्लास्मिड डीएनए कोशिका लाइन और वेक्टर पर निर्भर हो जाएगा. यह इस से पहले अंतिम transfections का आयोजन करने के लिए निर्माता द्वारा निर्दिष्ट सीमा के भीतर अनुपात के एक परीक्षण रेंज से अनुकूलित है कि सिफारिश की है. इसके अलावा कोशिकाओं लेकिन कोई डीएनए युक्त कम से कम एक नकारात्मक नियंत्रण संस्कृति को बनाए रखने.
- स्थैतिक मोड में 4 दिनों के लिए सेते हैं और फिर एक Shaki के लिए स्थानांतरण125 rpm पर घूर्णन एनजी मंच.
- एक को मार वक्र द्वारा निर्धारित रूप में एक उपयुक्त एकाग्रता के लिए प्लाज्मिड चयन के लिए उपयुक्त एंटीबायोटिक जोड़ें. इस अध्ययन में, Zeocin ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के चयन के लिए 400 माइक्रोग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़ा गया है.
- नियंत्रण कुएं में कोशिकाओं मर चुके हैं, जब तक एंटीबायोटिक हर बार उनका कहना है, सेल लाइन के लिए एक उपयुक्त समय अंतराल पर मीडिया बदलें.
- संस्कृतियों मिलाते पर प्रगति के लिए सबसे मिला हुआ कुओं का प्रयोग करें.
- फ्रीज मिश्रण का 1 मिलीलीटर में 10 7 व्यवहार्य कोशिकाओं से युक्त क्रायोजेनिक शीशियों में कोशिकाओं ठंड से एक सेल बैंक स्थापित करना. इस काम में, यह 92.5% की वृद्धि मध्यम और 7.5% डाइमिथाइल sulfoxide के होते हैं.
3. बैच और फेड बैच सेल वृद्धि वक्र
- 50 मिलीलीटर की एक काम की मात्रा के साथ बोतल हिला 250 मिलीलीटर में ट्रांसफ़ेक्ट चो कोशिकाओं की तीन प्रतियों सेल संस्कृतियों की स्थापना के लिए ऊपर सेल रखरखाव के लिए निर्देशों का पालन करें.
- Cultu बनाए रखेंएक humidified सेल 125 rpm पर घूर्णन एक कक्षीय मिलाते हुए मंच पर 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर,,, और 24 घंटे के अंतराल पर प्रत्येक बढ़ती संस्कृति से 4.1 मिलीलीटर नमूने हटाने में छोड़कर.
- Trypan नीले डाई अपवर्जन विधि के साथ व्यवहार्य सेल एकाग्रता और सेल व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए नमूने के 100 μl का प्रयोग करें.
- व्यवहार्य सेल एकाग्रता शून्य करने के लिए कम हो जाता है जब तक दोहराएँ.
- फेड बैच सेल संस्कृतियों क्रमश: 36 मिमी और 4 मिमी की उनकी प्रारंभिक मान उनके सांद्रता को बहाल करने के लिए सुबह 6 पर ग्लूकोज या glutamine की उचित राशि के साथ सप्लीमेंट के लिए दोहराएँ. यह शुद्ध पानी की एक ही मात्रा (इस मामले में 12 एमएल) के साथ खिलाया जा रहे हैं, जो अतिरिक्त नियंत्रण संस्कृतियों को भी रखा जाता है की सिफारिश की है.
4. अनुपात माप झल्लाहट
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 XG पर ऊपर 3.2 कदम और अपकेंद्रित्र में हटा दैनिक नमूने के 2 मिलीलीटर ले लो
- Resuspबर्फ ठंड फॉस्फेट buffered खारा (पीबीएस) के 2 मिलीलीटर में सेल गोली समाप्त हो गया. 6 अच्छी तरह से थाली में इस हस्तांतरण और अच्छी तरह से एक के लिए कोई कोशिकाओं से युक्त एक खाली नमूना जोड़ें.
- तुरंत 465/435 एनएम (नीला) और 520/510 एनएम (पीला) के 430/435 एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में नीले और पीले प्रतिदीप्ति के स्तर को मापने.
- झल्लाहट अनुपात (जो पता नीली प्रतिदीप्ति से अधिक का पता चला पीला प्रतिदीप्ति का अनुपात) की गणना.
5. Metabolite Assays
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 100 XG पर ऊपर 3.2 कदम और अपकेंद्रित्र में हटा दैनिक नमूने के 2 मिलीलीटर ले लो सतह पर तैरनेवाला निकालें.
- 5 मिनट के लिए 100 XG पर फिर से 3 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस और अपकेंद्रित्र में सेल गोली Resuspend.
- सतह पर तैरनेवाला निकालें और ऊपर के रूप में 3 मिलीलीटर बर्फ ठंड पीबीएस में सेल गोली resuspend. पर 15 सेकंड की एक नाड़ी पर 3 मिनट के प्रत्येक और 15 सेकंड के लिए बंद नमूना 5x Sonicate. इस बिंदु पर, सेल अतिरिक्तअगर वांछित सीटीएस जमे हुए किया जा सकता है.
- (सामग्री की तालिका देखें) intracellular ग्लूकोज एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए सेल के अर्क के नमूने पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त ग्लूकोज परख किट का प्रयोग करें.
नोट: एक मानक वक्र के निर्माण के लिए उपयुक्त मानकों का प्रयोग करें. इस काम में, मानकों की एकाग्रता 0-100 मिमी के बीच रहा. - मानकों के लिए रीडिंग का प्रयोग, मानक वक्र का निर्माण और (इस मामले में: Y = 1310.51x - Y absorbance के पढ़ने और एक्स ग्लूकोज एकाग्रता है जहां 723.43) सबसे अच्छा फिट के रेखीय समीकरण पाते हैं.
- मानक वक्र का उपयोग और खाते में कमजोर पड़ने लेने ग्लूकोज सांद्रता की गणना. intracellular ग्लूकोज एकाग्रता तो इस समीकरण का उपयोग कर की गणना की जा सकती है:
चो कोशिकाओं के लिए, एकल कोशिका मात्रा 12 माइक्रोन 12 के एक सेल व्यास गणना कर रहा था - (सामग्री की तालिका देखें) intracellular glutamine एकाग्रता का निर्धारण करने के लिए सेल के अर्क के नमूने पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक उपयुक्त glutamine परख किट का प्रयोग करें.
नोट: एक मानक वक्र के निर्माण के लिए उपयुक्त मानकों का प्रयोग करें. इस काम में, मानकों की एकाग्रता 0-2 के बीच मिमी बताया गया. - ऊपर 5.5 में के रूप में, (वाई absorbance के पढ़ने और एक्स है जहां Y = 203.1x + 17.1 ग्लूकोज एकाग्रता है इस मामले में) अंशांकन वक्र का निर्माण
- मानक वक्र का उपयोग करना, खाते में कमजोर पड़ने ले रही है, नमूने के glutamine एकाग्रता की गणना. intracellular glutamine एकाग्रता उपरोक्त समीकरण 1 उपयोग कर की गणना की जा सकती है.
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Representative Results
कार्यप्रणाली का अवलोकन चित्रा 2 में प्रस्तुत किया है. इस के साथ साथ प्रस्तुत काम में, चो कोशिकाओं fibs वेक्टर और स्थिर सेल लाइनों के साथ ट्रांसफ़ेक्ट थे 400 माइक्रोग्राम / एमएल Zeocin की एक एंटीबायोटिक दबाव में चयन किया गया था. रचनात्मक रूप में ग्लूकोज और glutamine सेंसर व्यक्त दो अलग स्थिर सेल लाइनों इसलिए बनाया गया था. चित्रा 1 इस अध्ययन में इस्तेमाल दो biosensors के विन्यास को दर्शाया गया है. ग्लूकोज सेंसर ए पी ओ मैक्स सिद्धांत पर आधारित है और इसी प्लाज्मिड pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite है. इस बढ़ाकर सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ECFP) के एक फ्यूजन और ई. के F16A उत्परिवर्ती को बढ़ाया पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (EYFP) के Aphrodite संस्करण है कोली ग्लूकोज / galactose बाध्यकारी प्रोटीन periplasmic. 11 अमीनो एसिड के अवशेष झल्लाहट दक्षता 13 में सुधार करने के लिए linker क्षेत्र से हटा दिया गया. इस वेक्टर uniq का उपयोग pCDNA4/TO वेक्टर में क्लोन किया गया थाUE एक साइटोमेगालोवायरस प्रमोटर और एक SV40 बढ़ाने का उपयोग करता है जो पारिस्थितिकी आरआई और पीएसटी मैं प्रतिबंध साइटों,.
glutamine सेंसर ए पी ओ मिन सिद्धांत (चित्रा 1) और इसी प्लाज्मिड ई. में पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन सिट्रीन की एक प्रविष्टि से निकाला गया था पर आधारित है कोली glutamine periplasmic सी टर्मिनस से जुड़ी एक ECFP साथ अमीनो एसिड 98 और 99 के बीच प्रोटीन बंधन. एमिनो एसिड प्रतिस्थापन D157N झल्लाहट दक्षता 8 अनुकूलन करने के लिए कई परिवर्तन द्वारा पीछा glutamine के लिए आकर्षण बढ़ाने के लिए QBP करने के लिए बनाया गया है, जबकि संरचना, जोड़ने क्षेत्र में अवशेषों का विलोपन द्वारा rigidified किया गया है. glutamine का निर्माण pUTKan संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर में आपूर्ति की गई थी और मैं डालने को रिहा करने बाम हाय और साल के साथ पचा गया था झल्लाहट. उत्तरार्द्ध एन टर्मिनल शुद्धि टी के साथ फ्रेम में वेक्टर pET41a में इसी प्रतिबंध साइटों में क्लोन किया गया थाAGS. यह स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर निर्माण करने के लिए, साल मैं और Xho मैं द्वारा उत्पादित संगत चिपचिपा समाप्त होता है का उपयोग कर बाम हाय और Xho मैं के साथ पचा किया गया था के बाद एक ही डालें, pCDNA4/TO वेक्टर में ligated था.
प्लाज्मिड अभिव्यक्ति QRT-पीसीआर का उपयोग biosensors के mRNA स्तर बढ़ाता द्वारा पुष्टि की गई. दोनों fibs सक्रिय रूप से मध्य घातीय स्तर 14 पर सेल प्रति 3,000 टेप पर β-actin संभालने सेल प्रति 25-44 mRNA प्रतियों में लिखित होना पाया गया.
बैच प्रत्येक कोशिका लाइन की संस्कृतियों प्रत्येक fibs के vivo जांच के लिए दैनिक नमूने लेने बनाए रखा गया ऊंचा हो जाना. दो सेल लाइनों का व्यवहार्य सेल के विकास प्रोफाइल चित्रा 3 और enzymatic assays के द्वारा निर्धारित इसी झल्लाहट माप और intracellular metabolite सांद्रता में दिखाया गया है 1 टेबल में प्रस्तुत कर रहे हैं. एक प्रतिदीप्ति प्लेट पाठक को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया थासियान और पीले रंग के लिए 520/510 एनएम के लिए 465/435 एनएम के 430/35 एनएम और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के एक उत्तेजना तरंग दैर्ध्य में नमूनों की प्रतिदीप्ति. यह संस्कृति के पहले 4 दिनों में उपस्थित कम सेल नंबर अविश्वसनीय झल्लाहट संकेत है कि नेतृत्व पाया गया था. इसी तरह, सेल के उच्च स्तर प्रकाश बिखरने का एक उच्च मात्रा का उत्पादन संस्कृति की सुबह 8 के बाद उपस्थित lysated. 4-8 दिनों के लिए केवल डेटा इसलिए ग्लूकोज और glutamine fibs के लिए अंशांकन घटता के निर्माण के लिए प्रयोग किया जाता है, जिसके लिए समीकरण तालिका 1 में दिखाया गया. परिणाम fibs संकेत glutamine के लिए ग्लूकोज और 0.3-2 मिमी के लिए 1-5 मिमी के बीच intracellular सांद्रता के साथ एक विश्वसनीय सहसंबंध है कि उत्पादन दिखा.
यह और ऊपर निष्कर्षों को मान्य करने के बाद, खिलाया बैच के दो सेल लाइनों की संस्कृतियों का प्रदर्शन किया गया ऊंचा हो जाना. उच्च सब्सट्रेट एकाग्रता (ग्लूकोज fibs और glutamine fibs के मामले में glutamine के मामले में ग्लूकोज) युक्त चारा सहारा लिया जाता थासब्सट्रेट के बाह्य सांद्रता तरक्की के लिए सेल संस्कृति की सुबह 6 पर. Glutamine से सिंचित संस्कृति के लिए, glutamine एकाग्रता 4 मिमी की वृद्धि हुई थी, जबकि ग्लूकोज पीकर संस्कृति के मामले में कोशिकी ग्लूकोज एकाग्रता, वापस 36 मिमी तक बढ़ा दिया गया था. आंकड़ा 4 इस अध्ययन से प्रतिनिधि परिणाम से पता चलता है. आंकड़े -4 ए और 4C स्पष्ट रूप से वे ऊपर सुबह 6 से पीछा प्रवृत्ति के पीछे से खिलाने का जवाब है, जो प्रत्येक दिन पर झल्लाहट अनुपात, को दर्शाती है. विशेष रूप से, चित्रा -4 ए में, ग्लूकोज के लिए झल्लाहट अनुपात ग्लूकोज fibs एपीओ पर विन्यास इस प्रकार है के बाद से चो सेल लाइन, के अलावा ग्लूकोज के जवाब में दिन 7 पर कम हो जाती है fibs. इसी तरह, चित्रा 4C में, glutamine के लिए झल्लाहट अनुपात ए पी ओ ऑफ सेंसर के सिद्धांत के साथ लाइन में, glutamine अलावा के जवाब में चो सेल लाइन बढ़ जाती है fibs.
ये झल्लाहट माप अंत में calc करने के लिए इस्तेमाल किया गयाulate aforementioned अंशांकन घटता है और परिणामों के आधार पर intracellular ग्लूकोज और glutamine सांद्रता glutamine के लिए ग्लूकोज और चित्रा 4D के लिए 4B चित्रा में दिखाया जाता है इसी. वे ग्लूकोज और glutamine enzymatic assays के साथ निर्धारित और पर्याप्त समझौते दिखाने के रूप में इन substrates के वास्तविक intracellular सांद्रता की तुलना कर रहे हैं.
.., वाई ग्लूकोज के लिए =-1.232x + 8.034 (नि. 2 = .961): 1 टेबल ग्लूकोज और glutamine fibs के लिए झल्लाहट अनुपात के vivo जांच के लिए परिणाम अंशांकन घटता भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जो निम्न समीकरण द्वारा वर्णित हैं और glutamine (2 आर = 0.87 लिए y = 1.892x + 0.3329), जहां Y झल्लाहट अनुपात है और एक्स मिमी में एकाग्रता है.
चित्रा 1. इस अध्ययन में इस्तेमाल fibs के सिद्धांतों. Glutamine fibs (बाएं) glutamine संवेदन डोमेन को बांधता है और इस प्रकार झल्लाहट बढ़ रही है, करीब एक साथ दोनों फ्लोरोसेंट प्रोटीन लाता है कि एक गठनात्मक पारी उत्पन्न करता है जिसके द्वारा ए पी ओ मिन सिद्धांत, इस प्रकार है. ग्लूकोज fibs (दाएं) ग्लूकोज संवेदन डोमेन को बांधता है और इस प्रकार झल्लाहट कम है, फ्लोरोसेंट प्रोटीन को अलग करती है कि एक गठनात्मक परिवर्तन उत्पन्न करता है जिसके द्वारा ए पी ओ मैक्स सिद्धांत, इस प्रकार है.
बैच के लिए चित्रा 3. व्यवहार्य सेल एकाग्रता प्रोफाइल चो सेल लाइनों (एन = सेल लाइन के अनुसार तीन माप के साथ 2 जैविक दोहराता) व्यक्त fibs ग्लूकोज fibs और glutamine की संस्कृतियों ऊंचा हो जाना.
चित्रा 4. Fibs उत्पादक चो कोशिकाओं और झल्लाहट माप इसी के फेड बैच संस्कृति. (एक) रोज़ मुझेग्लूकोज fibs व्यक्त खिलाया बैच चो सेल संस्कृतियों की झल्लाहट अनुपात की asurements. तीर सेल संस्कृति को ग्लूकोज के अलावा इंगित करता है. मूल्यों के खिलाफ एक ग्लूकोज परख किट का उपयोग कर मापा (ख) वास्तविक intracellular ग्लूकोज एकाग्रता प्रोफाइल में विवो ग्लूकोज अंशांकन वक्र (तालिका 1) के आधार पर भविष्यवाणी की. (ग) glutamine fibs व्यक्त खिलाया बैच चो सेल संस्कृतियों की झल्लाहट अनुपात की दैनिक माप. तीर सेल संस्कृति को glutamine के अलावा इंगित करता है. मूल्यों के खिलाफ एक glutamine परख किट का उपयोग कर मापा (घ) वास्तविक intracellular glutamine एकाग्रता प्रोफाइल में विवो glutamine अंशांकन वक्र (तालिका 1) के आधार पर भविष्यवाणी की. सभी मामलों में, एन = सेल लाइन के अनुसार तीन माप के साथ 2 जैविक दोहराता.
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Discussion
Fibs तरीकों शमन और निष्कर्षण से उत्पन्न होने वाली अनिश्चितताओं को दूर करने, इस मामले वृद्धि को सीमित पोषक तत्वों में vivo में और कुंजी अणुओं की सीटू quantitation में सक्षम. निष्कर्ष fibs संकेत और glutamine के लिए ग्लूकोज और 0.3-2 मिमी के लिए 1-5 मिमी की रेंज में intracellular सांद्रता के बीच एक अच्छा संबंध है कि सुझाव है. बैच चो सेल संस्कृति में, इन सांद्रता, घातीय स्थिर, और जल्दी गिरावट चरणों में सामना कर रहे हैं. घातीय और स्थिर चरणों उचित खिला रणनीति के डिजाइन के मामले में सबसे महत्वपूर्ण हैं, कोशिकाओं के चयापचय आवश्यकताओं के आकलन के लिए इन biosensors का उपयोग इसलिए औद्योगिक रूप से प्रासंगिक है. फेड बैच के प्रयोग के परिणाम intracellular ग्लूकोज और glutamine सांद्रता का अनुमान प्रदान करने fibs 'उपयुक्तता की पुष्टि करें. पहले के समय बिंदुओं पर प्रदर्शन किया विचलन क्योंकि कम व्यवहार्य सेल संख्या की उत्पन्न हो सकता हैसदस्यों और / या क्योंकि ग्लूकोज fibs के मामले में गैलेक्टोज द्वारा जैसे अन्य मेटाबोलाइट्स, द्वारा और glutamine fibs के मामले में अन्य अमीनो एसिड से हस्तक्षेप की. विशेष रूप से, यह झल्लाहट अनुपात में 20% की कमी एस्पार्टेट, ग्लूटामेट, ग्लाइसिन, threonine, एसीवी और tyrosine 15 की उपस्थिति में हो सकता है कि दिखाया गया है. कुल मिलाकर, इन परिणामों fibs संकेत में है कि त्रुटि काफी कम है सुझाव देते हैं.
इस पद्धति केवल एक समय में अणुओं की एक सीमित संख्या की निगरानी कर सकते हैं, यह सेल लाइन और विकास की प्रक्रिया, या गणितीय मॉडलों के सत्यापन के लिए भी डाटा अधिग्रहण के लिए उपयोगी जानकारी प्रदान कर सकते हैं. Periplasmic बंधनकारी प्रोटीन की विविधता को देखते हुए इसी तरह biosensors जीवित कोशिकाओं में वास्तविक समय में इस metabolite मात्रा का ठहराव के लिए एक बहुमुखी विधि है, जिससे अन्य अमीनो एसिड, शर्करा, और इस तरह सल्फेट और फॉस्फेट के रूप में 16 आयनों सहित छोटे अणुओं के लिए एक सरणी के लिए विकसित किया जा सकता है .
Fibs के उपयोग का एक प्रमुख लाभ एक सतत फैशन में संभावित ऑनलाइन माप प्राप्त करने की क्षमता है. विधि इसलिए पुस्तिका निपटने को कम करने और विकास के प्रयासों को तेज कर सकते हैं, जो उच्च throughput अनुप्रयोगों के लिए उधार देता है. प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अंतर्निहित कार्यक्षमता के साथ microreactor वातावरण की वृद्धि की उपलब्धता के साथ, यह मंच रूपरेखा एक fibs सक्षम metabolite सेल स्क्रीनिंग, मीडिया और अनुकूलन प्रक्रिया, और प्रक्रिया पैमाने अप के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि परिकल्पना की गई है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
हमारा अनुरोध है pUTKan संयंत्र अभिव्यक्ति वेक्टर में निर्माण झल्लाहट glutamine की आपूर्ति के लिए प्लाज्मिड और डा. Uwe Ludewig (Hohenheim विश्वविद्यालय) झल्लाहट कृपया ग्लूकोज के साथ हमें प्रदान करने के लिए प्रोफेसर वुल्फ Frommer (विज्ञान के लिए कार्नेगी संस्थान, स्टैनफोर्ड विश्वविद्यालय) धन्यवाद. अटल बिहारी बीबीएसआरसी लक्षित प्राथमिकता Studentships कार्यक्रम द्वारा वित्त पोषित है. सी और केपी दोनों बायोफार्मास्यूटिकल्स प्रसंस्करण में RCUK फैलोशिप द्वारा समर्थित हैं. सी.के. भी उनके वित्तीय समर्थन के लिए Lonza बायोलॉजिक्स शुक्रिया अदा करना चाहती है. सिंथेटिक जीव विज्ञान और अभिनव के लिए केंद्र उदारता EPSRC द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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