Summary
En beskrivelse av hvordan man skal kalibrere Förster Resonance Energy Transfer integrerte biologiske sensorer (fibs) for in situ metabolske profilering er presentert. De FIBS kan brukes til å måle intracellulære nivåer av metabolitter invasivt hjelpe til med utviklingen av metabolske modeller og høy gjennomstrømning screening bioteknologi forhold.
Abstract
I den æra av beregningsorientert biologi, nye high throughput eksperimentelle systemer er nødvendig for å fylle og avgrense modeller slik at de kan testes ut for prediktive formål. Ideelt slike systemer ville være lite volum, noe som utelukker sampling og destruktive analyse når tidsforløpet av data som skal innhentes. Det som trengs er en in situ overvåking verktøy som kan rapportere nødvendig informasjon i sanntid og ikke-invasivt. Et interessant alternativ er bruk av fluorescerende, protein-basert in vivo biologiske sensorer som journalister av intracellulære konsentrasjoner. En spesiell klasse av in vivo biosensorer som har funnet programmer i metabolitt kvantifisering er basert på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellom to fluorescerende proteiner forbundet med en ligandbindende domene. FRET integrerte biologiske sensorer (fibs) er konstitutivt produsert innenfor cellelinjen, de har rask responstid og deres spektrale chaegenskaper endres basert på konsentrasjonen av metabolitten i cellen. I dette papir, er metoden for å konstruere kinesisk hamsterovarie (CHO) cellelinjer som konstitutivt uttrykker et FIBS for glukose og glutamin, og kalibrering av FIBS in vivo i batch cellekultur for å muliggjøre fremtidig kvantifisering av intracellulær konsentrasjon metabolitt beskrevet. Data fra fødesats-CHO-cellekulturer viser at FIBS var i stand til i hvert tilfelle for å detektere den resulterende forandring i den intracellulære konsentrasjon. Ved hjelp av det fluorescerende signalet fra FIBS og den tidligere konstruert kalibreringskurve, ble den intracellulære konsentrasjon nøyaktig bestemt som bekreftet ved en uavhengig enzymatisk assay.
Introduction
Metabolitt overvåking har ulike programmer i bioprocessing, inkludert prosessutvikling, media og fôr design, og metabolske engineering. Forskjellige metoder er tilgjengelige for konsentrasjonsmålinger ved bruk av en enzymatisk, kjemisk 2 eller bindingsanalyser 3. Et interessant alternativ er bruk av fluorescerende, protein-basert in vivo biologiske sensorer som journalister av den intracellulære konsentrasjonen av viktige metabolitter. I ultra-lavt volum assays, er fluorescens et passende verktøy som miniatyrisering faktisk forbedrer signal-til-støy-forhold 4,5 og protein-baserte sensorer kan være genetisk kodet betyr at ingen eksogene reagenser som er nødvendige for metabolitt-analyse. Förster Resonance Energy Transfer (FRET) biosensorer består av to selvlysende proteiner forbundet med en ligandbindende domene. FRET er en nonradiative overføring av energi fra en foto-glade giver til et mottaker fluorescerende molekyl belig ed i umiddelbar nærhet (<100). Ligand spalting eller binding fører til en konformasjonsendring i sensoren, som i sin tur induserer en forandring i nærhet av fluoroforer, som fører til en endring i FRET effektivitet målt ved endringen i emisjonsspektrum. FRET integrerte biologiske sensorer (fibs) blir konstitutivt produsert i cellelinjen, og deres spektrale egenskaper endres avhengig av konsentrasjonen av metabolitten i cellen. FIBS har rask responstid som gjør dem ideelle for å ta målinger for dynamiske modeller seks. Tidligere søknader omfatte overvåking enkelt 7-9 og flere 10 metabolitter og gi data om tid og rom fordeling 11. FIBS kan lages i to konfigurasjoner: Apo-Max, hvor ligandbinding forstyrrer nærhet av fluoroforene senke energioverføring og Apo-Min, hvor ligandbinding bringer de to fluoroforene i nærmere kontakt (figur 1).
_content "> I dette arbeidet er en protokoll presenteres for bygging av kinesisk hamster eggstokk (CHO) cellelinjer som konstitutivt uttrykker en FIBS for en metabolitt, glukose eller glutamin. En metode er etablert for kalibrering av sensoren in vivo for å muliggjøre fremtidige kvantitative målinger av intracellulært metabolitt konsentrasjon, som vist i figur 2.. Basert på dette, den intracellulære konsentrasjon av glukose eller glutamin kan bestemmes i fed-batch-CHO-cellekulturer, i hvilken de to næringsstoffer ble tilsatt i høye konsentrasjoner i-prosess. Resultatene viser at ved bruk av det fluorescerende signalet fra FIBS og den tidligere konstruert kalibreringskurve, er det mulig nøyaktig forutsigelse av den intracellulære konsentrasjon, som bekreftet ved en uavhengig enzymatisk assay. Denne fremgangsmåte gir betydelige fordeler i forhold til nåværende analytiske teknologi, fordi den er ikke-invasiv og lave kostnader og raskt, noe som gir et sanntidssignal av FIBS som kan være maskall overvåkes gjennom hele kulturen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Cell Linje Revival og vedlikehold
- Gjenopplive CHO-celler i 9 ml CD-CHO-medium supplert med 8 mM L-glutamin og 10 ml / l hypoxantin 100x / tymidin-supplement (fullstendige dyrkningsmedium).
- Sentrifuger ved 100 x g i 5 min.
- Resuspender cellene i 10 ml friskt komplett vekstmedium.
- Fjern en 1 ml prøve og bestemme levedyktig cellekonsentrasjon ved lysmikroskopi ved hjelp av trypanblått-fargestoffeksklusjonsmetoden i et hemocytometer.
- Initiere en kultur ved en seeding tetthet på 3 x 10 5 celler / ml i 125 ml rysteflasker.
- Oppretthold kulturen i en inkubator ved 37 ° C, en fuktet atmosfære av 5% CO2, på en orbital risteplattform som roterer med 120 rpm.
- Subkultur hver 3-4 dager i fullstendig vekstmedium ved en tetthet på seeding 2 x 10 5 celler / ml.
2. Transfeksjon av cellelinjen med den Plasmid Containing den Biosensor Gene
- Forbered plasmid DNA ved hjelp av en storstilt plasmid rensing kit.
- Oppretthold-celler ved de passende betingelser (37 ° C, 5% CO2) 12-24 timer før transfeksjon for å sikre at cellene er aktivt delende ved transfeksjon.
- Tell cellene ved hjelp av trypanblått-fargestoffeksklusjonsmetoden, da forberede en arbeidsvolum på 20 ml av cellekulturen i en 125 ml rystekolbe i en konsentrasjon på 1 x 10 til 6 celler / ml.
- Bruk en egnet transfeksjon kit for cellelinjen er i bruk. Plasmid DNA til transfeksjon reagenser forholdet vil være avhengig av den cellelinjen og vektor. Det anbefales at dette er optimalisert ved å teste en rekke forhold innenfor området som er angitt av produsenten, før de føres de endelige transfections. Også opprettholde minst en negativ kontrollkultur som inneholder celler, men ingen DNA.
- Inkuber i fire dager i statisk modus, og deretter overføre til en Shaking plattformen roterer med 125 rpm.
- Tilsett passende antibiotikum for plasmid valg til en egnet konsentrasjon som bestemmes av en kill kurve. I denne studien ble zeocin tilsatt til en endelig konsentrasjon på 400 pg / ml for seleksjon av transfekterte celler.
- Endring media ved et passende tidsintervall for at cellelinjen, og legger antibiotikum hver gang, helt til cellene i kontroll godt ha dødd.
- Bruk mest konfluente brønner for å gå videre til risting kulturer.
- Etablere en celle bank ved å fryse cellene i kryogene hetteglass som inneholder 10 7 levedyktige celler i en ml fryse mix. I dette arbeidet, består dette av 92,5% vekst medium og 7,5% dimethylsulfoxyd.
Tre. Batch og Fed-batch Cell Vekst Curve
- Følg instruksjoner for celle vedlikehold ovenfor for å etablere triplikat cellekulturer av transfekterte CHO-celler i 250 ml rysteflasker med et arbeidsvolum på 50 ml.
- Opprettholde Cultures i en fuktet inkubator celle ved 37 ° C med 5% CO2, på en orbital risteplattform som roterer med 125 rpm, og ta ut 4,1 ml prøver av hvert voksende kulturen ved 24 timers intervaller.
- Bruk 100 pl av prøven for å bestemme levedyktige cellekonsentrasjon og cellelevedyktighet med trypan blått fargestoff utelukkelse metode.
- Gjenta dette inntil det levedyktige cellekonsentrasjonen er redusert til null.
- Gjenta for fødesats-cellekulturer supplere med den passende mengde glukose eller glutamin på dag 6 for å gjenopprette deres konsentrasjoner til sine opprinnelige verdier på 36 mM og 4 mM, respektivt. Det anbefales at ytterligere kontrollkulturer blir også opprettholdt, noe som er til å bli matet med det samme volumet (12 ml i dette tilfellet) av rent vann.
4. FRET Ratio Målinger
- Ta 2 ml av den daglige prøver tatt ut i trinn 3.2 over og sentrifuger ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C.
- Resuspsluttet cellepelleten i 2 ml iskald fosfatbufret saltløsning (PBS). Overføring av dette inn i en 6-brønns plate og legge til en blindprøve som ikke inneholder noen celler til en brønn.
- Måler nivået av blå og gul fluorescens umiddelbart ved en eksitasjonsbølgelengde på 430/435 nm og emisjonsbølgelengder på 465/435 nm (blått) og 520/510 nm (gult).
- Beregn gnage forholdstall (forholdet mellom gul fluorescens oppdaget i løpet blå fluorescens oppdaget).
5. Metabolitt Analyser
- Ta 2 ml av den daglige prøver tatt ut i trinn 3.2 over og sentrifuger ved 100 xg i 5 min ved 4 ° C. Fjern supernatanten.
- Resuspender cellepelleten i 3 ml iskald PBS og sentrifuger på nytt ved 100 x g i 5 min.
- Fjern supernatanten og cellepelleten suspenderes i 3 ml iskald PBS som ovenfor. Sonicate prøven 5x i 3 min hver på en puls på 15 sek på og 15 sekunder av. På dette punktet, cellen ekstraCTS kan fryses hvis ønskelig.
- Bruk en passende glukose assay kit i henhold til produsentens instruksjoner på prøver av celle ekstrakter å bestemme den intracellulære glukosekonsentrasjon (se tabell av materialer).
Merk: Bruk hensiktsmessige standarder for å konstruere en standard kurve. I dette arbeidet, konsentrasjonen av standarder varierte mellom 0-100 mM. - Ved hjelp av avlesningene for standarder, konstruere standardkurven, og en lineær ligning for beste tilpasning (i dette tilfellet: y = 1310.51x - 723,43, hvor y er absorbansen lesing og x er den glukosekonsentrasjon).
- Beregn glukosekonsentrasjonen ved hjelp av standardkurven, og å ta hensyn til fortynningen. Den intracellulære glukose-konsentrasjon kan da beregnes ved bruk av ligningen:
For CHO-celler, ble enkeltcellevolum beregnes ved å bruke en cellediameter på 12 pM 12 - Bruk en passende glutamin assay kit i henhold til produsentens instruksjoner på prøver av celle ekstrakter å bestemme den intracellulære konsentrasjonen av glutamin (se tabell av materialer).
Merk: Bruk hensiktsmessige standarder for å konstruere en standard kurve. I dette arbeidet, konsentrasjonen av standarder varierte mellom 0-2 mM. - Som i 5.5 ovenfor, konstruere kalibreringskurven (i dette tilfelle y = 203.1x + 17,1 hvor y er absorbansen lesing og x er den glukosekonsentrasjon)
- Ved hjelp av standardkurven, beregne glutaminkonsentrasjonen av prøvene, idet fortynningen i betraktning. Den intracellulære glutamin-konsentrasjon kan beregnes ved å bruke ligning 1 ovenfor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En oversikt over metodikken er presentert i Figur 2. I det arbeidet som presenteres heri, ble CHO-celler transfektert med vektor FIBS og stabile cellelinjer ble valgt i et antibiotikum trykk på 400 pg / ml zeocin. To separate stabile cellelinjer som konstitutivt uttrykker glukose og glutamin sensorer Det ble derfor laget. Figur 1 viser konfigurasjoner av de to biosensorer brukt i denne studien. Glukosesensoren er basert på Apo-Max-prinsippet og den tilsvarende plasmid er pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Dette er en fusjon av den forbedrede cyan fluorescerende protein (ECFP) og Aphrodite variant av den forbedrede yellow fluorescerende protein (EYFP) til F16A mutant av E. coli glukose / galaktose periplasmic bindende protein. 11 amino-syrerester ble fjernet fra linkeren region for å forbedre effektiviteten FRET 13.. Denne vektor ble klonet inn i vektoren ved hjelp av pCDNA4/TO unue Eco RI og Pst I restriksjonsseter, som bruker et Cytomegalovirus-promoteren og en SV40-enhancer.
Den glutamin sensoren er basert på Apo-Min-metoden (fig. 1) og det tilsvarende plasmid var avledet fra en innsetting av det gule fluorescerende protein citrine inn i E. coli-glutamin periplasmatiske bindingsprotein mellom aminosyrene 98 og 99 med en ECFP festet til C-terminus. Strukturen ble rigidified av sletting av rester i å knytte region, mens aminosyresubstitusjon D157N har blitt gjort til QBP til å øke affiniteten for glutamin, etterfulgt av flere mutasjoner å optimalisere effektiviteten FRET 8.. Den glutamin FRET konstruere ble levert i pUTKan plante ekspresjonsvektor, og ble spaltet med Bam HI og Sal I for å frigjøre innsatsen. Sistnevnte ble klonet inn i de tilsvarende restriksjonsseter i vektoren pET41a i ramme med N-terminal rensing tags. Den samme innskuddet ble ligert inn i vektoren pCDNA4/TO, etter at det var blitt spaltet med BamHI og Xhol I ved hjelp av de klebrige ender som er kompatible produsert av Sal I og XhoI, for å produsere pattedyr-ekspresjonsvektor.
Plasmid ekspresjon ble bekreftet ved å kvantifisere de mRNA-nivåer av biosensorer ved hjelp QRT-PCR. Begge FIBS ble funnet å være aktivt transkribert på 25-44 mRNA kopier per celle antar β-actin på 3000 transkripsjoner per celle ved mid-eksponentiell level 14.
Batch overgrow kulturer av hver cellelinje ble opprettholdt ta daglige prøver for in vivo kalibrering av hver FIBS. Den levedyktige cellevekst profil av de to cellelinjene er vist i Figur 3, og de tilsvarende FRET målinger og intracellulære metabolittkonsentrasjoner bestemt ved enzymatisk assay er presentert i tabell 1. En fluorescens plateleser ble brukt til å målefluorescens av prøver ved en eksitasjonsbølgelengde på 430/35 nm og emisjonsbølgelengder på 465/435 nm for cyan og 520/510 nm for gult. Det ble funnet at lave antall celler som er tilstede i de første 4 dager av kulturen førte til upålitelige FRET signal. Tilsvarende, den høye celle lysated tilstede etter 8 dagers kultur produserte en høy mengde av lysspredning. Kun data for dagene 4-8 blir derfor brukt til å konstruere kalibreringskurvene for glukose og glutamin FIBS, blir ligningene for som vist i tabell 1.. Resultatene viser at FIBS signal frembringer en pålitelig korrelasjon med de intracellulære konsentrasjoner mellom 1-5 mM for glukose og 0,3 til 2 mM for glutamin.
Etter dette, og å validere de ovennevnte funn, porsjonsvis tilførsel overgrow kulturer av de to cellelinjer ble utført. Et for som inneholder høye substratkonsentrasjon (glukose i tilfelle av glukose FIBS og glutamin i tilfelle av glutamin FIBS) ble supplertpå dag 6 av cellekulturen til å heve de ekstracellulære konsentrasjoner av substratet. I tilfelle av glukose-matet kultur det ekstracellulære glukosekonsentrasjonen ble øket opp til 36 mm, mens det for glutamin-matet kultur ble glutaminkonsentrasjonen økte til 4 mM. Figur 4 viser representative resultater fra denne studien. Figurene 4A og 4C skildre gnage forholdstall på hver dag, som tydelig reagerer på fôring ved å reversere trenden de fulgt opp til dag seks. Nærmere bestemt, i figur 4A, er FRET raten for glukose fibs CHO-cellelinje avtar på dag 7 i respons til glukose tillegg, siden glukose FIBS følger APO-On-konfigurasjon. Tilsvarende, i figur 4C, gnage ratio for glutamin fibs CHO cellelinje øker i respons til glutamin tillegg, i tråd med prinsippet om Apo-Off sensorer.
Disse FRET målingene ble endelig brukt til calcUlate den tilsvarende intracellulære glukose og glutamin-konsentrasjoner basert på de forannevnte kalibreringskurver, og resultatene er vist i figur 4B for glukose og figur 4D for glutamin. De blir sammenlignet med de faktiske intracellulære konsentrasjonen av disse substrater som bestemt ved glukose og glutamin-enzymatiske analyser og viser tilstrekkelig avtalen.
.. Tabell 1. Resultater for in vivo kalibrering av FRET-forholdet for glukose og glutamin FIBS kalibreringskurvene er beskrevet ved følgende ligninger som kan brukes til å gjøre forutsigelser: y =-1.232x + 8,034 for glukose (R2 = 0,961), og y = 1.892x + 0,332 for glutamin (R2 = 0.879), der y er FRET-forhold, og x er konsentrasjonen i mM.
Figur 1. Prinsipper for de FIBS brukt i denne studien. Glutamin FIBS (til venstre) følger Apo-Min-prinsippet, der glutamin binder seg til sensor domener og genererer en conformational skift som bringer både fluorescerende proteiner tettere sammen, og dermed øke FRET. Glukose FIBS (til høyre) følger Apo-Max-prinsippet, der glukose binder seg til sensing domene og genererer en konformasjonsendringen som skiller de fluorescerende proteiner, og dermed redusere FRET.
Figur 2. Oversikt over metodikk for FIBS kalibrering og påfølgende invasiv kvantifisering av intracellulær glukose og glutamin konsentrasjoner.
Figur 3. Levedyktig celle konsentrasjonsprofil for batch overgrow kulturer av glukose FIBS-og glutamin FIBS-uttrykke CHO cellelinjer (n = 2 biologiske rapporter med tre målinger per cellelinje).
Figur 4. Fed batch kultur FIBS produserende CHO celler og tilhørende berørings målinger. (A) Daglig megasurements av FRET forholdet mellom matet-batch CHO cellekulturer uttrykker glukose FIBS. Pilen angir tilsetning av glukose til cellekulturen. (B) Faktisk intracellulær glukosekonsentrasjonsprofil målt ved anvendelse av et glukoseanalysesett mot verdier spådd basert på in vivo glukosekalibreringskurven (tabell 1). (C) Daglige målinger av FRET forholdet mellom fødesats-CHO-cellekulturer som uttrykker glutamin FIBS. Pilen angir tilsetning av glutamin til cellekulturen. (D) Faktisk intracellulært glutamin konsentrasjonsprofil målt ved hjelp av et glutamin assay kit mot verdier predikert basert på in vivo glutamin kalibreringskurven (tabell 1). I alle tilfeller, n = 2 biologiske gjentas med tre målinger per cellelinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FIBS aktivere in vivo og in situ kvantifisering av viktige molekyler, i dette tilfelle vekstbegrensende næringssalter, fjerne usikkerheter som skyldes quenching og utvinningsmetoder. Resultatene tyder på at det er en god korrelasjon mellom FIBS signal og de intracellulære konsentrasjoner i området fra 1 til 5 mM for glukose og 0,3 til 2 mM for glutamin. I batch CHO cellekultur, er disse konsentrasjonene oppstått i den eksponentielle, stasjonære, og tidlig nedgang faser. Den eksponensielle og stasjonære faser er den mest kritiske når det gjelder utformingen av egnede matestrategier, bruken av disse biosensorer for å estimere de metabolske kravene til cellene er derfor industrielt relevant. Resultatene av fed-batch eksperiment bekrefte FIBS enes egnethet til å gi estimater av intracellulær glukose og glutamin konsentrasjoner. Avvik utstilt på tidligere tidspunkter kan ha oppstått på grunn av lavere levedyktig celle numlemmer og / eller på grunn av interferens av andre metabolitter, for eksempel ved galaktose i tilfelle av glukose FIBS, og av andre aminosyrer i tilfelle av glutamin FIBS. Nærmere bestemt har det vist seg at en reduksjon på opptil 20% i FRET-forhold kan forekomme i nærvær av aspartat, glutamat, glysin, treonin, valin, tyrosin og 15.. Samlet disse resultatene tyder på at feil i FIBS signal er forholdsvis lav.
Selv om denne metoden kan bare overvåke et begrenset antall molekyler i en tid, kan den gi nyttig informasjon for cellelinje og prosessutvikling, eller til og datainnsamling for validering av matematiske modeller. Gitt mangfoldet av periplasmiske bindende proteiner, kan lignende biosensorer bli utviklet for en rekke små molekyler, inkludert andre aminosyrer, sukker og ioner som sulfat og fosfat 16, noe som gjør dette til en allsidig metode for metabolitten kvantifisering i sanntid i levende celler .
En viktig fordel med bruken av FIBS er evnen til å oppnå elektroniske målinger potensielt på en kontinuerlig måte. Metoden egner seg derfor for høy gjennomstrømning som kan redusere manuell håndtering og fremskynde utviklingsarbeidet. Med den økte tilgjengeligheten av microreactor miljøer med innebygd funksjonalitet for fluorescens deteksjon, er det forutsatt at en FIBS-aktivert metabolitt profilering plattformen kan brukes for celle screening, media og prosessoptimalisering, og prosessen oppskalering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi takker professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) for vennlig å gi oss med glukose FRET plasmid og Dr. Uwe Ludewig (Hohenheim University) for vennlig forsyne glutamin FRET konstruere i pUTKan anlegget uttrykk vektor. AB er finansiert av BBSRC Målrettet Prioriterte Studentships program. Både CK og KP støttes av RCUK Fellowships i Biopreparater Processing. CK ønsker også å takke Lonza Biologics for sin økonomiske støtte. Senter for Syntetisk biologi og innovasjon er sjenerøst støttet av EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
