Summary
Описание того, как для калибровки Ферстер резонансный перенос энергии интегрированных биологических сенсоров (FIBS) для на месте метаболического профилирования представлена. В FIBS может быть использован для измерения внутриклеточные уровни метаболитов неинвазивно, помогающих в развитии метаболических моделей и высокопроизводительного скрининга условий биотехнологических.
Abstract
В эпоху вычислительной биологии, новых высокой пропускной экспериментальные системы необходимы для того, чтобы заполнить и уточнения модели, чтобы они могли быть подтверждено для целей прогнозирования. В идеале такие системы будет низкий объем, что исключает отбора проб и разрушительные анализы, когда данные время курс должны быть получены. Что необходимо, так это в мониторинг Ситу инструмент, который может сообщить необходимую информацию в режиме реального времени и неинвазивного. Интересный вариант является использование люминесцентные, на основе белков в естественных биологических датчиков, как репортеры внутриклеточной концентрации. Один конкретный класс естественных условиях биосенсоров в том, что нашла свое применение в метаболита количественного основана на Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) между двумя флуоресцентных белков, соединенных связывающего домена лиганда. FRET интегрированных биологических сенсоров (FIBS) конститутивно производимые в клеточной линии, они имеют быстрое время отклика и их спектральную чаracteristics меняться в зависимости от концентрации метаболита в клетке. В данной работе метод построения яичника китайского хомячка (СНО) клеточные линии, которые конститутивно выражают ФИБС для глюкозы и глутамина и калибровки ФИБС в естественных условиях в культуре пакетном клеток, с тем чтобы в будущем количественную оценку внутриклеточной концентрации метаболита описывается. Данные из подпиткой СНО клеточных культур показывает, что FIBS смог в каждом случае, чтобы обнаружить изменения в результате внутриклеточной концентрации. Использование флуоресцентного сигнала от FIBS и ранее построенной градуировочной кривой, внутриклеточная концентрация была точно определена как подтверждена независимым ферментативного анализа.
Introduction
Мониторинг метаболитов имеет различные применения в биотехнологической, в том числе развития процесса, СМИ и дизайна корма, и метаболической инженерии. Имеются различные методы для измерения концентрации с использованием ферментативных 1, химического 2 или 3 анализах связывания. Интересный вариант является использование люминесцентные, на основе белков в естественных биологических датчиков, как репортеры внутриклеточной концентрации ключевых метаболитов. В ультра-низких анализов объема, флуоресценция является удобным инструментом как миниатюризация действительно улучшает отношение 4,5 сигнал-шум и датчики на основе белков могут быть генетически закодированы смысл, что никакие внешние реагенты не являются необходимыми для анализа метаболитов. Ферстер резонансный перенос энергии (FRET) биосенсоры состоят из двух флуоресцентных белков, соединенных связывающего домена лиганда. FRET является безызлучательный передача энергии от фотовозбужденной донора к нахо молекулы флуоресцентного акцепторной ред в непосредственной близости (<100). Лиганд расщепление или связывание вызывает конформационное изменение в датчике, который, в свою очередь, вызывает изменение в непосредственной близости от флуорофоров, что приводит к изменению эффективности FRET, измеренной по изменению спектра излучения. FRET интегрированные биологические датчики (ФИБС) конститутивно производимые в клеточной линии и их спектральные характеристики меняться в зависимости от концентрации метаболита в клетке. ФИБС имеют быстрое время отклика делает их идеальными для проведения измерений для динамических моделей 6. Предыдущие применения включают мониторинг одиночные 7-9 и несколько 10 метаболитов и предоставление данных о пространственно-временного распределения 11. ФИБС могут быть созданы в двух конфигурациях: Апо-Max, где обязательным лиганд нарушает близость флуорофорами понижающей передачи энергии и APO-Мин, где обязательным лиганд приносит два флуорофоры в более тесный контакт (рис. 1).
_content "> В этой работе, протокол представлен для построения яичника китайского хомячка (СНО) клеточные линии, которые конститутивно выражают ФИБС для метаболита, глюкоза или глутамина. Методология устанавливается для калибровки датчика в естественных условиях, с тем чтобы в будущем количественные измерения внутриклеточной концентрации метаболитов, как представлено на рисунке 2. Исходя из этого, внутриклеточная концентрация глюкозы или глутамина может быть определена в подпиткой СНО клеточных культурах, к которым были добавлены два питательных веществ в высоких концентрациях в процессе. Результаты демонстрируют, что с помощью флуоресцентного сигнала от FIBS и ранее построенной градуировочной кривой, точно предсказание внутриклеточной концентрации можно, как это было подтверждено независимым ферментативного анализа. Этот метод дает значительные преимущества по сравнению с текущим аналитических технологий, поскольку он является неинвазивным и недорогой и быстро, давая в реальном времени сигнал FIBS, которые могут быть ПНотслеживаться по всей культуре.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Сотовый Возрождение линия и обслуживание
- Оживление клеток СНО в 9 мл CD-СНО среде с добавлением 8 мм L-глутамина и 10 мл / л 100x гипоксантин / тимидина дополнения (полной среды роста).
- Центрифуга при 100 мкг в течение 5 мин.
- Ресуспендируют клеток в 10 мл свежей полной среды роста.
- Снять образец 1 мл и определения концентрации жизнеспособных клеток с помощью световой микроскопии с использованием трипанового метод исключения синий краситель в гемоцитометре.
- Инициирование культуры при плотности посева от 3 х 10 5 клеток / мл в 125 мл колбы трясти.
- Поддерживать культуру в инкубаторе при температуре 37 ° С, влажной атмосфере 5% CO 2, на орбитальном платформы шейкера, вращающейся со скоростью 120 оборотов в минуту.
- Субкультура каждые 3-4 дня в полной среде роста при плотности посева 2 × 10 5 клеток / мл.
2. Трансфекция клеточной линии с плазмиды Containing биосенсора Gene
- Подготовка ДНК плазмиды с помощью масштабную набора для очистки плазмиды.
- Поддержание клеток на соответствующих условиях (37 ° C, 5% CO 2) 12-24 ч до трансфекции, чтобы обеспечить клетки активно делятся на момент трансфекции.
- Граф клеток с использованием трипанового метод эксклюзионной синий краситель, а затем подготовить рабочий объем 20 мл культуры клеток в 125 мл колбу трясти при концентрации 1 × 10 6 клеток / мл.
- С помощью подходящего набора для трансфекции для клеточной линии при использовании. Плазмидную ДНК в соотношении реагентов трансфекции будет зависеть от клеточной линии и вектора. Рекомендуется, чтобы это оптимизирован путем тестирования диапазон отношений в диапазоне указанных изготовителем до проведения окончательных трансфекций. Также сохранить хотя бы одно отрицательное культуру управления, содержащий клетки, но нет ДНК.
- Выдержите в течение 4 дней в статическом режиме, а затем передать в Шекинг платформа вращается на 125 оборотов в минуту.
- Добавить соответствующий антибиотик для выбора плазмиды до подходящей концентрации, как определено кривой убивать. В этом исследовании зеоцину был добавлен в конечной концентрации 400 мкг / мл для отбора трансфицированных клеток.
- Изменение носитель в соответствующем временном интервале для клеточной линии, добавив к антибиотикам каждый раз, пока клетки в контрольной лунке, не умерли.
- Используйте самые сливные колодцы, чтобы прогрессировать до встряхивания культур.
- Создание банка клеток путем замораживания клеток в криогенных флаконах, содержащих 10 7 жизнеспособных клеток в 1 мл смеси вымораживанием. В этой работе, он состоит из 92,5% ростовой среде и 7,5% диметилсульфоксида.
3. Пакетная и подпиткой Кривая роста клеток
- Соблюдайте правила эксплуатации, клеток выше, чтобы установить трех экземплярах культуры клеток трансфицированных клетках СНО в 250 мл встряхнуть колбы с рабочим объемом 50 мл.
- Поддерживать Cultuразрешением в увлажненном инкубаторе клетки при 37 ° С, с 5% CO 2, на орбитальной платформы шейкера, вращающейся со скоростью 125 оборотов в минуту, и удалить 4,1 мл пробы из каждой растущей культуры в 24 час интервалами.
- Используйте 100 мкл образца для определения жизнеспособного концентрации клеток и клеток жизнеспособность с трипановым синим методом исключения красителя.
- Повторяйте, пока концентрация жизнеспособных клеток не уменьшается до нуля.
- Повторите эти действия для культуры с подпиткой клеток дополняя с соответствующим количеством глюкозы или глутамина на 6-й день, чтобы восстановить их концентрации в своих начальных значений 36 мм и 4 мм соответственно. Рекомендуется, чтобы дополнительный контроль культуры также поддерживается, которые должны быть поданы с таким же объемом 12 мл (в данном случае) чистой воды.
4. FRET побед Измерения
- Принимать по 2 мл суточных проб, демонтированных в действии 3.2 выше и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
- Resuspсостава осадок клеток в 2 мл охлажденного льдом фосфатно-буферным раствором (PBS). Перевести это в 6-луночный планшет и добавить пустую выборку, не содержащие клеток одной яме.
- Измерьте уровни синий и желтый флуоресценции сразу на длине волны возбуждения 430/435 нм и эмиссии длинах волн 465/435 нм (синий) и 520/510 нм (желтый).
- Рассчитать лад отношения (отношение желтой флуоресценции обнаруженного на синем флуоресценции обнаруженного).
5. Метаболитов Анализы
- Принимать по 2 мл суточных проб, демонтированных в действии 3.2 выше и центрифуге при 100 мкг в течение 5 мин при 4 ° С. Удалить супернатант.
- Ресуспендируют клеточный осадок в 3 мл охлажденного льдом PBS и центрифуги снова при 100 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и ресуспендируют осадок клеток в 3 мл охлажденного льдом PBS, как описано выше. Разрушать ультразвуком образца 5x в течение 3 мин каждый на импульсе 15 сек на и 15 сек выкл. В этот момент клетки дополнительныйк.т.н. могут быть заморожены при желании.
- Используйте соответствующий комплект анализа глюкозы в соответствии с инструкциями изготовителя на образцах клеточных экстрактов для определения внутриклеточной концентрации глюкозы (см. таблицу материалов).
Примечание: Используйте соответствующие стандарты для построения стандартной кривой. В этой работе, концентрация стандартов колебалась в пределах 0-100 мМ. - Используя показания для стандартов, построить стандартную кривую и найти линейное уравнение наилучшего соответствия (в данном случае: у = 1310.51x - 723,43 где у показание поглощения и х является концентрация глюкозы).
- Вычислить концентрацию глюкозы с использованием стандартной кривой и принимая во внимание разбавление. Внутриклеточная концентрация глюкозы может быть рассчитана с использованием этого уравнения:
Для клеток СНО, объем одной клетки были рассчитаны на диаметр ячейки 12 мкм 12 - Используйте соответствующий комплект глютамин анализа в соответствии с инструкциями изготовителя на образцах клеточных экстрактов для определения внутриклеточной концентрации глутамина (см. таблицу материалов).
Примечание: Используйте соответствующие стандарты для построения стандартной кривой. В этой работе, концентрация стандартов колебалась между 0-2 мм. - Как и в 5,5 выше, построить калибровочную кривую (в данном случае у = 203.1x + 17,1, где Y является чтение поглощение и х представляет собой концентрацию глюкозы)
- С помощью стандартной кривой, рассчитать концентрацию глютамина образцов, принимая во внимание разбавление. Внутриклеточная концентрация глутамина может быть рассчитана с помощью уравнения 1 выше.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Обзор методологии представлена на рисунке 2. В работе, представленной в данном документе, клетки СНО, трансфицированных вектором FIBS и стабильных клеточных линий были выбраны при давлении антибиотиками 400 мкг / мл зеоцина. Два отдельных стабильные клеточные линии конституитивно выражающие глюкозы и глютамина датчики поэтому были созданы. На рисунке 1 представлены конфигурации двух биосенсоров, используемых в данном исследовании. Датчик глюкозы на основе Apo-Max принципе и соответствующая плазмида pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Это слияние расширенной голубой флуоресцентный белок (ECFP) и Афродита вариант расширенной желтого флуоресцентного белка (EYFP) к F16A мутанта Е. палочка глюкозы / галактозы периплазматическое связывающий белок. 11 аминокислотных остатков были удалены из линкерной области для повышения эффективности FRET 13. Этот вектор был клонирован в вектор pCDNA4/TO помощью UniqUE Eco RI и Pst I сайтами рестрикции, который использует промотор цитомегаловируса и энхансер SV40.
Датчик глутамин основана на принципе Apo-мин (рис. 1) и соответствующий плазмиду, полученного из вставки желтого флуоресцентного белка цитрине в Е. палочки глутамина связывающий белок периплазматического между аминокислотами 98 и 99 с прикрепленной к ECFP С-конце. Структура была отвержденной путем делеции остатков в соединяющей области, в то время как аминокислотная замена D157N было сделано в QBP увеличить сродство к глутамина, а затем нескольких мутаций для оптимизации эффективности FRET 8. Глютамин FRET построить поставлялся в растительном вектор экспрессии pUTKan и переваривают Bam HI и Sal I, чтобы освободить вставку. Последний был клонирован в соответствующих сайтов рестрикции в векторе pET41a в рамке с N-концевой очистки тфлаги. То же самое вставку лигировали в вектор pCDNA4/TO, после его переваривают с Bam HI и Xho I с использованием совместимые липкие концы, произведенные Sal I и Xho I, с получением вектора экспрессии млекопитающих.
Экспрессионной плазмиды была подтверждена количественной оценки уровней мРНК с использованием биосенсоров Qrt-PCR. Оба ФИБС были найдены активно транскрибируется в 25-44 мРНК копий на клетку при условии β-актина в 3000 транскриптов на клетку в середины экспоненциальной уровне 14.
Пакетная зарастают культуры каждой клеточной линии были сохранены ежедневно принимать образцы для калибровки в естественных условиях каждый FIBS. Жизнеспособным профиль рост клеток этих двух клеточных линий показано на фиг.3 и соответствующих измерений FRET и внутриклеточных концентраций метаболита, определенных ферментативных анализов представлены в таблице 1. Читатель флуоресценции пластина используется для измеренияфлуоресценции образцов при длине волны возбуждения 430/35 нм и длине волны эмиссии 465/435 нм для голубого и 520/510 нм для желтого цвета. Было обнаружено, что низкие количества клеток, присутствующие в первых 4 дней культуры привело к ненадежной сигнала FRET. Кроме того, высокий уровень клетки lysated присутствует за днем 8 культуры производится большое количество рассеяния света. Использовали только данные, в течение нескольких дней 4-8, следовательно, используется для построения калибровочных кривых для глюкозы и глутамина FIBS, уравнения для которых показаны в таблице 1. Результаты показывают, что сигнал FIBS производит надежную корреляцию с внутриклеточной концентрации между 1-5 мм для глюкозы и 0,3-2 мМ глутамина.
После этого и для проверки вышеуказанные заключения, при периодическом зарастают проводились культуры двух клеточных линий. Корм, содержащий высокую концентрацию субстрата (глюкоза в случае FIBS глюкозы и глутамина в случае глутамина FIBS) была дополненана 6-й день культуры клеток, чтобы поднять внеклеточные концентрации субстрата. В случае глюкозо-кормили культуры внеклеточной концентрации глюкозы была увеличена обратно до 36 мм, в то время как для глутамина кормили культуры, концентрация глутамина была увеличена до 4 мм. Рисунок 4 показывает репрезентативные результаты данного исследования. 4A и 4C изображают отношения ладу каждый день, которые четко отвечают на питание обратить вспять тенденцию они следовали до 6 дня. В частности, на фиг.4А, отношение FRET для глюкозы FIBS клеточной линии СНО, уменьшается на 7 день в ответ на глюкозу того, поскольку FIBS глюкозы следует конфигурацию APO-О. Аналогичным образом, на фиг.4С, отношение FRET для глутамина FIBS СНО клеточной линии возрастает в ответ на глутамин Кроме того, в соответствии с принципом апо-офф датчиков.
Эти измерения FRET были, наконец, использовать известковоУлате соответствующий внутриклеточные концентрации глюкозы и глутамина на основе вышеуказанных калибровочных кривых и результаты показаны на фиг.4В глюкозы и рис 4D для глутамина. Они сравнению с фактическими внутриклеточных концентраций этих субстратов, как определено с глюкозой и глутамина ферментативных анализов и показывают достаточную соглашение.
.. Таблица 1 Результаты для калибровки в естественных условиях соотношения FRET для глюкозы и глютамина FIBS Калибровочные кривые описываются следующими уравнениями, которые можно использовать, чтобы сделать прогноз: у =-1.232x + 8,034 для глюкозы (R 2 = 0,961), и у = 1.892x + 0.332 глутамина (R 2 = 0,879), где у представляет собой отношение рвать и х представляет собой концентрацию в мМ.
Рисунок 1. Принципы в FIBS используемых в данном исследовании. Глутаминовый ФИБС (слева) следует принципу Апо-мин, с помощью которого глутамина связывается с доменами зондирования и генерирует конформационную сдвиг, который приносит и флуоресцентные белки ближе друг к другу, тем самым увеличивая волнуйтесь. В ФИБС глюкозы (справа) следует Апо-Max принцип, с помощью которого глюкоза связывается с домена зондирования и генерирует конформационные изменения, разделяющий флуоресцентные белки, тем самым уменьшая волнуйтесь.
Рисунок 3. Жизнеспособных профиль концентрации клеток для партии зарастают культуры глюкозы FIBS-и глютамина FIBS-клеточных линий, экспрессирующих СНО (N = 2 биологические повторы с трех измерений на клеточной линии).
Рисунок 4. ФРС партия культура FIBS производящих клеток СНО и соответствующих измерений волнуйтесь. (А) Ежедневно мнеasurements из соотношения ладу с подпиткой СНО клеточных культур, выражающих ФИБС глюкозы. Стрелка указывает добавление глюкозы к культуре клеток. (Б) Фактический профиль внутриклеточная концентрация глюкозы измеряли с помощью анализа глюкозы комплект против предсказанных значений на основе глюкозы в естественных условиях калибровочной кривой (табл. 1). (С) Ежедневные измерения соотношения ладу с подпиткой СНО клеточных культур, выражающих глютамина ФИБС. Стрелка указывает добавление глутамина в клеточной культуре. (Г) Фактический профиль внутриклеточная концентрация глутамина измеряли с использованием набора для анализа глутамин против значений предсказать на основе глутамина в естественных условиях калибровочной кривой (табл. 1). Во всех случаях, п = 2 биологические повторяется с тремя измерениями на клеточной линии.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В ФИБС включить в естественных условиях и на месте количественного ключевых молекул, в данном случае ограничивающим рост питательных веществ, удаление неопределенности, вытекающие из закалки и добыча методы. Полученные данные свидетельствуют, что существует хорошая корреляция между FIBS сигнала и внутриклеточных концентрациях в диапазоне 1-5 мм для глюкозы и 0,3-2 мм для глутамина. В пакетном СНО клеточной культуре, эти концентрации встречаются в экспоненциальной, стационарных и ранних фаз упадка. Показательные и стационарные фазы являются наиболее важными с точки зрения разработки соответствующих стратегий кормления; использование этих биосенсоров для оценки метаболических потребностей клетки Поэтому промышленно актуальны. Результаты подпиткой эксперимента подтверждают пригодность FIBS "оценок факторов внутриклеточной глюкозы и концентрации глютамина. Отклонения выставлены на более ранних временных точках, возможно, возникла из-за низкой жизнеспособного пит клетокБерс и / или из-за помех со стороны других метаболитов, например, путем галактозы в случае FIBS глюкозы, и другими аминокислотами в случае глютамина FIBS. В частности, было показано, что уменьшение до 20% в соотношении FRET может происходить в присутствии аспартат, глутамат, глицин, треонин, валин, тирозин и 15. В целом, эти результаты предполагают, что ошибка в сигнале FIBS является довольно низким.
Хотя эта методика может контролировать ограниченное число молекул в то время, он может дать полезную информацию для клеточной линии и разработке процесса, или даже получения данных для проверки математических моделей. Учитывая разнообразие периплазматических связывающих белков, аналогичных биосенсоры могут быть разработаны для массива для малых молекул, включая других аминокислот, сахаров и ионов, таких как сульфат и фосфат 16, что делает этот универсальный метод для метаболита количественного в реальном времени в живых клетках .
Основное преимущество использования FIBS является возможность получить онлайн измерения потенциально в непрерывном режиме. Метод поэтому поддается для высокой пропускной приложений, которые могут уменьшить ручной обработки и ускорению усилий в области развития. С увеличением доступности микрореактора средах с встроенных функций для обнаружения флуоресценции, предусматривается, что ФИБС поддержкой метаболит профилирования платформу можно использовать для скрининга клеток, средств массовой информации и оптимизации процессов, и процесс расширения масштабов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего раскрывать.
Acknowledgments
Мы благодарим профессора Вольфа Фроммер (Институт Карнеги по науке, Стэнфордский университет) за любезно предоставленные нам с глюкозой FRET плазмиды и д-р Уве Людвиг (Хоэнхайм университет) за любезно поставляет глютамин FRET построить в растительном вектор экспрессии pUTKan. А.Б. финансируется BBSRC Целевая программа Приоритетные Studentships. Оба CK и КП поддерживаются RCUK стипендий в Biopharmaceuticals обработки. CK также хотела бы поблагодарить Lonza Biologics за их финансовую поддержку. Центр по синтетической биологии и инноваций щедро поддерживается EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
