Summary
En beskrivning av hur man kalibrerar Förster Resonance Energy Transfer integrerade biologiska sensorer (FIBS) för in situ metabolisk profilering presenteras. De FIBS kan användas för mätning av intracellulära nivåer av metaboliter noninvasively medhjälp i utvecklingen av metaboliska modeller och högeffektiv screening av bioprocess betingelser.
Abstract
I en tid präglad av beräkningsbiologi, nya hög genomströmning experimentella system är nödvändiga för att befolka och förfina modeller så att de kan valideras för prognoser. Helst sådana system skulle vara låg volym, vilket utesluter provtagning och destruktiva analyser när tiden kursdata ska erhållas. Vad som behövs är en in situ-övervakning verktyg som kan rapportera nödvändig information i realtid och icke-invasivt. Ett intressant alternativ är att använda fluorescerande, proteinbaserade in vivo biologiska sensorer som föredragande av intracellulära koncentrationer. En särskild klass av in vivo biosensorer som har funnit tillämpningar inom metabolit kvantifiering är baserad på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) mellan två fluorescerande proteiner som förbinds med en ligandbindningsdomän. FRET integrerade biologiska sensorer (FIBS) är konstitutivt produceras inom cellinje, de har snabba svarstider och deras spektrala chaskaper ändras baserat på koncentrationen av metabolit i cellen. I detta dokument är den metod för att konstruera kinesisk hamsterovarie (CHO)-cellinjer som konstitutivt uttrycker en FIBS för glukos och glutamin och kalibrera de FIBS in vivo i batch-cellkultur för att möjliggöra framtida kvantifiering av intracellulär metabolit koncentration beskrivas. Data från fed-batch-CHO-cellkulturer visar att de FIBS kunde i varje fall för att detektera den resulterande förändring i den intracellulära koncentrationen. Med hjälp av fluorescerande signalen från FIBS och den tidigare konstruerade kalibreringskurvan, var den intracellulära koncentrationen noggrant bestämmas vilket bekräftas av en oberoende enzymatisk analys.
Introduction
Metabolite övervakning har olika tillämpningar inom biobehandling, inklusive processutveckling, media och foder design och metabolisk teknik. Olika metoder finns tillgängliga för koncentrationsmätningar genom användning av enzymatisk 1, kemiska 2, eller bindningsanalyser 3. Ett intressant alternativ är att använda fluorescerande, proteinbaserade in vivo biologiska sensorer som reportrar i den intracellulära koncentrationen av viktiga metaboliter. I ultra-låg volym analyser är fluorescens ett praktiskt verktyg som miniatyrisering faktiskt förbättrar signal-till-brus-förhållande 4,5 och proteinbaserade sensorer kan genetiskt kodad börden att inga exogena reagens är nödvändiga för metabolitanalys. Förster resonance energy transfer (FRET) biosensorer bestå av två fluorescerande proteiner förbundna med en ligandbindande domän. FRET är en icke-strålande överföring av energi från en fotoexciterade donator till en acceptor fluorescerande molekyl lokali ed i omedelbar närhet (<100). Ligand klyvning eller bindning orsakar en konformationsförändring i sensorn, vilket i sin tur inducerar en förändring i närheten av de fluoroforer, vilket leder till en förändring i FRET-effektiviteten mätt med förändringen i emissionsspektrumet. FRET integrerade biologiska sensorer (FIBS) är konstitutivt produceras inom cellinje och deras spektrala egenskaper ändras beroende på koncentrationen av metaboliten i cellen. FIBS har snabba svarstider gör dem idealiska för att göra mätningar för dynamiska modeller 6. Tidigare användningsområden är övervakning enstaka 7-9 och multipla 10 metaboliter och tillhandahålla uppgifter om spatiotemporal fördelning 11. FIBS kan skapas i två konfigurationer: Apo-Max, där ligandbindningen stör närhet fluoroforema sänka energiöverföring och Apo-Min, där ligand bindning ger de två fluoroforerna i närmare kontakt (figur 1).
_content "> I detta arbete är ett protokoll som presenteras för att konstruera kinesisk hamster äggstock (CHO) cellinjer som konstitutivt uttrycker en FIBS för en metabolit, glukos eller glutamin. En metod är etablerad för kalibrering av sensorn in vivo för att möjliggöra framtida kvantitativa mätningar av intracellulär metabolit koncentration, enligt figur 2. Baserat på detta, den intracellulära koncentrationen av glukos eller glutamin kan bestämmas i fed-batch CHO cellkulturer, till vilken de två näringsämnen tillkom i höga koncentrationer i-process. Resultaten visa att du använder den fluorescerande signalen från FIBS och den tidigare konstruerade kalibreringskurvan, är möjligt att korrekt förutsägelse av den intracellulära koncentrationen, vilket bekräftas av en oberoende enzymatisk analys. Denna metod ger väsentliga fördelar jämfört med nuvarande analytiska tekniker eftersom det är icke-invasiv, billig och snabb, vilket ger en realtidssignal av de FIBS som kan vara månitored hela kulturen.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cellinje Revival och underhåll
- Revive CHO-celler i 9 ml CD-CHO-medium kompletterat med 8 mM L-glutamin och 10 ml / L 100x hypoxantin / tymidin-supplement (komplett tillväxtmedium).
- Centrifugera vid 100 x g under 5 min.
- Resuspendera cellerna i 10 ml färskt fullständigt tillväxtmedium.
- Avlägsna ett 1 ml prov och bestämma den viabla cellkoncentrationen genom Ijusmikroskopi med användning av trypanblått uteslutningsmetoden i en hemocytometer.
- Initiera en kultur med en såddtäthet av 3 x 10 5 celler / ml i 125 ml skakkolvar.
- Bibehåll kultur i en inkubator vid 37 ° C, en fuktig atmosfär av 5% CO2 på en roterande skakapparat roterande med 120 varv per minut.
- Subkultur varje 3-4 dagar i komplett tillväxtmedium med en såddtäthet av 2 x 10 5 celler / ml.
2. Transfektion av cellinjen med plasmiden Containing Biosensor Gene
- Bered-plasmid-DNA med användning av en storskalig plasmid-reningskit.
- Behåll cellerna vid lämpliga betingelser (37 ° C, 5% CO2) 12-24 h före transfektion att säkerställa att cellerna är aktivt delande vid tidpunkten för transfektion.
- Räkna celler med hjälp av trypanblått uteslutningsmetoden, då upprätta en arbetsvolym av 20 ml cellkultur i en 125 ml skakkolv vid en koncentration av 1 x 10 6 celler / ml.
- Använd en lämplig transfektion kit för den cellinje som används. Plasmid-DNA transfektionsreagens förhållandet kommer att vara beroende på cellinjen och vektor. Det rekommenderas att denna optimeras genom att testa en rad förhållanden inom det område som anges av tillverkaren innan du genomför de slutliga transfektionerna. Upprätthålla också minst en negativ kontrollkultur innehållande cellerna men ingen DNA.
- Inkubera i 4 dagar i statiskt läge och sedan överföra till en Shaking plattform som roterar vid 125 varv per minut.
- Lägg lämplig antibiotika för plasmid val till en lämplig koncentration som fastställs av en kill kurva. I denna studie var zeocin sattes till en slutlig koncentration av 400 | ig / ml för selektion av transfekterade celler.
- Ändra media vid ett lämpligt tidsintervall för cellinje, lägga antibiotika varje gång, tills cellerna i kontrollbrunn har dött.
- Använd de sammanflytande brunnarna att gå vidare till att skaka kulturer.
- Upprätta en cellbank genom att frysa cellerna i kryogena flaskor innehållande 10 7 viabla celler i en ml av frysblandning. I detta arbete består detta av 92,5% tillväxtmedium och 7,5% dimetylsulfoxid.
3. Batch och Fed-batch celltillväxt Curve
- Följ instruktionerna för cellunderhåll ovan för att etablera trefaldiga cellkulturer av de transfekterade CHO-celler i 250 ml skaka kolvar med en arbetsvolym på 50 ml.
- Bibehåll kultures i en fuktig cellinkubator vid 37 ° C med 5% CO2 på en roterande skakapparat roterande med 125 varv per minut och avlägsna 4,1 ml prover från varje växande kultur vid 24 timmars intervall.
- Använd 100 | il av provet för att bestämma den viabla cellkoncentrationen och cellernas livsduglighet med trypanblått uteslutningsmetoden.
- Upprepa tills den viabla cellkoncentrationen är reducerad till noll.
- Upprepa för fed-batch cellkulturer komplettera med lämplig mängd glukos eller glutamin på dag 6 för att återställa deras koncentrationer till sitt utgångsvärde av 36 mM och 4 mM, respektive. Det rekommenderas att ytterligare kontrollkulturer upprätthålls också, vilka skall matas med samma volym (12 ml i detta fall) för rent vatten.
4. FRET Ratio Mätningar
- Ta 2 ml av de dagliga prover som togs bort i steg 3.2 ovan och centrifugera vid 100 xg under 5 minuter vid 4 ° C.
- Resuspavslutades cellpelleten i 2 ml iskall fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Överför denna in i en 6-brunnsplatta och lägg ett blankprov som inte innehöll några celler till en väl.
- Mäta nivåerna av blått och gult fluorescens omedelbart vid en excitationsvåglängd av 430/435 nm och emissionsvåglängder av 465/435 nm (blå) och 520/510 nm (gult).
- Beräkna FRET nyckeltal (kvot av gul fluorescens upptäckts över blå fluorescens upptäcks).
5. Metabolit Assays
- Ta 2 ml av de dagliga prover som togs bort i steg 3.2 ovan och centrifugera vid 100 xg under 5 minuter vid 4 ° C. Avlägsna supernatanten.
- Resuspendera cellpelleten i 3 ml iskall PBS och centrifugera igen vid 100 x g under 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellpelleten i 3 ml iskall PBS som ovan. Sonikera provet 5x i 3 min vardera vid en puls på 15 sekunder på och 15 sekunder bort. Vid denna punkt i cellen extraCTS kan frysas om så önskas.
- Använd en lämplig glukosanalyskitet enligt tillverkarens instruktioner på prover av cellextrakt för att bestämma den intracellulära glukoskoncentrationen (se tabell av material).
Obs: Använd lämpliga standarder för att konstruera en standardkurva. I detta arbete, koncentrationen av standard varierade mellan 0-100 mM. - Med hjälp av avläsningarna för de standarder, konstruera standardkurvan och hitta den linjära ekvationen för bästa passform (här: y = 1310.51x - 723,43 där y är absorbansen läsning och x är glukoskoncentrationen).
- Beräkna de glukoskoncentrationer med användning av standardkurvan och med utspädnings beaktas. Den intracellulära glukoskoncentration kan sedan beräknas med användning av ekvationen:
För CHO-celler, var den enda cellvolymen beräknas med hjälp av en celldiameter på 12 ^ M 12 - Använd en lämplig glutamin assay kit enligt tillverkarens instruktioner om prover av cellextrakt för att bestämma den intracellulära glutamin koncentration (se tabell av material).
Obs: Använd lämpliga standarder för att konstruera en standardkurva. I detta arbete, koncentrationen av standard varierade mellan 0-2 mM. - Som i 5.5 ovan, konstruera kalibreringskurvan (i detta fall y = 203.1x + 17,1 där y är absorbansen läsning och x är glukoskoncentrationen)
- Med användning av standardkurvan, beräknar glutamin koncentration av proverna, varvid utspädningen i beaktande. Den intracellulära glutamin koncentrationen kan beräknas med hjälp av ekvation 1 ovan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En översikt av den metod som presenteras i figur 2. I det arbete som presenteras häri, har CHO-celler transfekterade med den FIBS vektorn och stabila cellinjer valdes ut på ett antibiotikum tryck av 400 ug / ml zeocin. Två separata stabila cellinjer som konstitutivt uttrycker de glukos och glutamin sensorer därför skapas. Figur 1 visar konfigurationerna av de två biosensorer som används i denna studie. Glukossensorn är baserad på den Apo-Max princip och den motsvarande plasmiden är pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Detta är en fusion av den förstärkta cyan fluorescent protein (ECFP) och Aphrodite variant av den förstärkta gult fluorescerande protein (EYFP) till F16A mutant av E. coli glukos / galaktos periplasmatiskt bindande protein. 11 aminosyrarester avlägsnades från linkerregion att förbättra FRET effektivitet 13. Denna vektor klonades in i pCDNA4/TO vektorn med användning av unique EcoRI och PstI-restriktionsställen, som använder en cytomegalovirus-promotor och en SV40-förstärkaren.
Den glutamin sensor är baserad på den Apo-Min princip (fig 1) och motsvarande plasmid härledd från en insertion av den gula fluorescerande protein citrin in i E. coli-glutamin periplasmiska bindande proteinet mellan aminosyrorna 98 och 99 med en ECFP fäst vid C-terminalen. Strukturen har befästs genom deletion av rester i den bindande regionen, medan aminosyrasubstitution D157N har gjorts till QBP att öka affinitet för glutamin, följt av flera mutationer för att optimera FRET effektivitet 8. Den glutamin FRET konstruera tillfördes i pUTKan växtexpressionsvektor och digererades med BamHI och Sall för att frigöra insatsen. Den senare klonades in i de motsvarande restriktionsställen i vektorn pET41a i ram med den N-terminala rening tags. Samma infogningen ligerades in i pCDNA4/TO vektor, efter att det hade digererats med Bam Hl och Xho I genom att använda de kompatibla klibbiga ändar som produceras av Sal I och Xho I, för framställning av däggdjursexpressionsvektor.
Plasmid uttryck bekräftades genom att kvantifiera mRNA nivåer av biosensorer som använder QRT-PCR. Båda FIBS befanns vara aktivt transkriberas vid 25-44 mRNA-kopior per cell antar β-aktin på 3.000 utskrifter per cell vid mitten av exponentiell nivå 14.
Batch växa över kulturer av varje cellinje bibehölls ta dagliga prover för kalibrering av varje FIBS in vivo. Det viabla celltillväxtprofilen av de två cellinjerna visas i Figur 3 och motsvarande FRET mätningar och intracellulära metabolitkoncentrationer bestämda av enzymatiska analyser presenteras i tabell 1. En fluorescens-plattläsare användes för att mätafluorescens av prover vid en excitationsvåglängd av 430/35 nm och emissionsvåglängder av 465/435 nm för cyan och 520/510 nm för gult. Det konstaterades att låga cellantal som är närvarande i de första fyra dagars odling lett till otillförlitliga FRET signal. Likaså lyser den höga cell närvarande efter dag 8 av kultur producerade en stor mängd ljusspridning. Endast data för dagar 4-8 används därför för att konstruera kalibreringskurvorna för glukos och glutamin FIBS, är ekvationer för vilket visas i tabell 1. Resultaten visar att den FIBS signal ger en tillförlitlig korrelation med de intracellulära koncentrationer av 1-5 mM för glukos och 0,3-2 mM för glutamin.
Efter detta och att validera ovanstående resultat fed-batch växa över kulturer av de två cellinjer utfördes. Ett foder som innehåller hög substratkoncentration (glukos i fallet med glukos FIBS och glutamin i fallet med glutamin FIBS) kompletteradespå dag 6 av cellkulturen för att höja de extracellulära koncentrationer av substratet. I fallet med glukosmatad kultur den extracellulära glukoskoncentrationen ökades tillbaka upp till 36 mM, medan den för glutamin matad kultur fick glutamin koncentrationen ökade till 4 mM. Figur 4 visar representativa resultat från denna studie. Figurerna 4A och 4C avbildar FRET nyckeltal på varje dag, som tydligt svarar på matning genom att vända trenden de följde upp till dag 6. Specifikt, i figur 4A, FRET-förhållande för glukos fibs CHO-cellinjen minskar på dag 7 som svar på glukos Eftersom glukos FIBS följer APO-On konfiguration. På liknande sätt i figur 4C, FRET förhållande för glutamin fibs CHO-cellinje ökningar i svar på glutamin Dessutom, i enlighet med principen av Apo-Off sensorer.
Dessa FRET mätningar slutligen användes för att calcUlate motsvarande intracellulära glukos och glutamin-koncentrationer baserade på de ovannämnda kalibreringskurvor och resultaten visas i figur 4B för glukos och Figur 4D för glutamin. De jämförs med de faktiska intracellulära koncentrationer av dessa substrat som bestäms med glukos och glutamin enzymatiska analyser och visar tillräcklig överenskommelse.
.. Tabell 1 Resultat för in vivo-kalibrering av FRET-förhållande för glukos och glutamin FIBS De kalibreringskurvor som beskrivs av de följande ekvationerna, som kan användas för att göra förutsägelser: y =-1.232x + 8,034 för glukos (R 2 = 0,961), och y = 1.892x + 0,332 för glutamin (R 2 = 0,879), där y är den FRET-förhållande och x är koncentrationen i mM.
Figur 1. Principerna för den FIBS användes i denna studie. Glutamin FIBS (vänster) följer den Apo-Min princip, genom vilken glutamin binder till de avkännande domäner och genererar en konformationell förändring som medför både fluorescerande proteiner närmare varandra, vilket ökar FRET. Glukos FIBS (höger) följer den Apo-Max princip, genom vilken glukos binder till sensor domän och genererar en konformationsförändring som skiljer de fluorescerande proteiner, vilket minskar FRET.
Figur 2. Översikt av metoden för FIBS kalibrering och efterföljande icke-invasiv kvantifiering av intracellulära glukos och glutamin koncentrationer.
Figur 3. Viabel cellkoncentrationsprofilen för kull växa över kulturer av glukos FIBS-och glutamin FIBS-uttryckande CHO-cellinjer (n = 2 biologiska upprepningar med tre mätningar per cellinje).
Figur 4. Fed-batch kultur FIBS-producerande CHO-celler och motsvarande FRET mätningar. (A) Daglig migasurements av FRET-förhållande av fed-batch-CHO-cellkulturer som uttrycker glukos FIBS. Pilen anger tillsättning av glukos till cellodlingen. (B) Den faktiska intracellulär glukoskoncentrationsprofil mäts med användning av en glukosanalyskitet mot värden predikterade baserat på in vivo-glukoskalibreringskurva (tabell 1). (C) Dagliga mätningar av FRET-förhållande av fed-batch-CHO-cellkulturer som uttrycker glutamin FIBS. Pilen anger tillsats av glutamin till cellkulturen. (D) Verklig intracellulär glutamin koncentrationsprofilen mätt med en glutamin analyskit mot värden förutsagda baserat på in vivo-glutamin kalibreringskurva (tabell 1). I samtliga fall är n = 2 biologiska upprepningar med tre mätningar per cellinje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De FIBS möjliggör in vivo och in situ kvantifiering av viktiga molekyler, i det här fallet tillväxtbegränsande näringsämnen, ta bort osäkerhet som härrör från släckning och utvinning metoder. Resultaten tyder på att det finns en god korrelation mellan FIBS signalen och de intracellulära koncentrationer i intervallet 1-5 mM för glukos och 0,3-2 mM för glutamin. I sats CHO cellodling, är dessa koncentrationer påträffas i exponentiella, stationära, och tidiga nedgång faserna. Den exponentiella och stationära faser är de mest kritiska när det gäller utformningen av lämpliga strategier för utfodring, användningen av dessa biosensorer för att uppskatta de metaboliska kraven i cellerna är därför industriellt relevant. Resultaten av fed-batch experiment bekräftar FIBS lämplighet att tillhandahålla beräkningar av intracellulär glukos och glutamin koncentrationer. Avvikelser ställde ut vid tidigare tidpunkter kan ha uppstått på grund av lägre livskraftiga celler numledamöter och / eller på grund av inblandning av andra metaboliter, t.ex. genom galaktos i fallet med glukos FIBS, samt av andra aminosyror i fallet med glutamin FIBS. Speciellt har det visat sig att en minskning på upp till 20% under det FRET förhållandet kan ske i närvaro av aspartat, glutamat, glycin, treonin, valin och tyrosin 15. Sammantaget antyder dessa resultat att felet i FIBS signalen är relativt låg.
Även om denna metod endast kan övervaka ett begränsat antal molekyler åt gången, kan det ge värdefull information för cellinje och processutveckling, eller till och med datainsamling för validering av matematiska modeller. Med tanke på mångfalden av periplasmiska bindande proteiner, kan liknande biosensorer utvecklas för en matris för små molekyler inklusive andra aminosyror, sockerarter och joner såsom sulfat och fosfat 16, vilket gör detta till en mångsidig metod för metabolit kvantifiering i realtid i levande celler .
En viktig fördel med att använda FIBS är möjligheten att få online-mätningar potentiellt på ett kontinuerligt sätt. Metoden lämpar sig därför för hög genomströmning applikationer som kan minska manuell hantering och påskynda utvecklingsarbetet. Med den ökade tillgängligheten av mikroreaktorer miljöer med inbyggd funktionalitet för fluorescensdetektering, är det tänkt att ett FIBS-aktiverad metabolit profilering plattform kan användas för cellscreening, media och processoptimering och process uppskalning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Vi tackar professor Wolf Frommer (Carnegie Institution for Science, Stanford University) för vänligt ger oss glukosen FRET plasmiden och Dr Uwe Ludewig (Hohenheim Universitet) för vänligt tillföra glutamin FRET konstruera i pUTKan växtexpressionsvektor. AB finansieras av BBSRC Riktade prioriterade doktorandprogram. Både CK och KP stöds av RCUK stipendier i Biopharmaceuticals Processing. CK vill även tacka Lonza Biologics för deras ekonomiska stöd. Centrum för syntetisk biologi och innovation är generöst stöd av EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
