Summary
In situ metabolik profilleme için Förster Rezonans Enerji Transferi entegre biyolojik sensörler (FIBS) kalibre nasıl bir açıklama sunulmuştur. FIBS invaziv olmayan metabolik modelleri ve biyoproses koşullarının yüksek miktarda madde taraması gelişiminde yardım metabolitlerin hücre içi seviyelerini ölçmek için kullanılabilir.
Abstract
Hesaplamalı biyoloji çağında, yeni yüksek kapasiteli deneysel sistemler onlar tahmin amacıyla valide böylece modelleri doldurmak ve rafine etmek için gereklidir. İdeal tür sistemler zaman ders veri elde edilecek zaman örnekleme ve yıkıcı analizlerini engeller düşük hacimli olacaktır. Gereken şey, gerçek-zamanlı ve noninvaziv gerekli bilgileri rapor edebilecekleri in situ izleme aracıdır. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein-bazlı hücre içi konsantrasyonlarının muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Metabolit nicellendirmesinde bulmuştur in vivo biyosensör bir özel sınıfı, bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein arasında Förster rezonans enerji transferi (FRET) dayanmaktadır. Entegre biyolojik sensörler (FIBS) Fret yapıcı hücre hattı içinde üretilen, onlar hızlı yanıt süreleri ve spektral cha varhücre içindeki metabolitin konsantrasyonuna göre değişiklik tikleri. Bu yazıda, hücre içi metabolit konsantrasyonunun gelecek ölçümü sağlamak amacıyla yapısal olarak glikoz ve glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık yapımında ve toplu hücre kültüründe in vivo olarak fibs kalibre edilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinden elde edilen veriler, FIBS hücre içi konsantrasyonunda elde edilen değişikliği tespit etmek için, her durumda mümkün olduğunu göstermektedir. Bağımsız bir enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyalini kullanarak, hücre içi konsantrasyonu tam olarak tespit edilmiştir.
Introduction
Metaboliti izleme süreç geliştirme, medya ve yem tasarım ve metabolik mühendislik dahil bioprocessing çeşitli uygulamalar vardır. Çeşitli yöntemler enzimatik 1, kimyasal 2, 3 ya da bağlama deneylerinde kullanımıyla konsantrasyonu ölçümleri için kullanılabilir. İlginç bir seçenek, floresan kullanılmasıdır, protein bazlı anahtar metabolitlerin hücre içi konsantrasyonunun muhabir olarak in vivo biyolojik sensörler. Küçültme aslında sinyal-gürültü oranı, 4,5 artırır ve protein bazlı sensörler eksojen genetik olarak reaktif metabolit analizi için gerekli olduğu anlamını kodlanabilir gibi ultra-düşük hacim deneylerinde, floresan bir araçtır. Förster rezonans enerji transferi (FRET) biyosensörler bir ligand bağlama alanı ile bağlanmış iki floresan protein oluşur. FRET bir alıcı, flüoresan molekül locat bir fotoğraf eksitasyonlu bir vericiden bir radyatif olmayan enerji transferi yakın (<100) ed. Ligand bağlayıcı bir bölünme ya da sırayla, emisyon spektrumunda bir değişiklik ile ölçüldüğü FRET veriminde bir değişime yol açan, florofor yakın bir değişim olmaktadır, sensörün bir konformasyonel değişikliği neden olur. FRET entegre biyolojik sensörleri (FIBS) yapıcı hücre hattı içinde üretilir ve spektral özellikleri, hücre içinde metabolitin konsantrasyonuna göre değişir. FIBS dinamik modellerin 6 ölçümler için idealdir hızlı tepki süreleri var. Önceki uygulamaların 7-9 tekli ve çoklu 10 metabolitleri izleme ve uzaysal dağılımı 11 veri sağlayan içerir. Ligand bağlama enerjisi transferi ve bir ligand bağlanma yakın temas eder (Şekil 1) içine, iki florofor getirir Apo-Min, düşürücü florofor yakınlığını bozan Apo-Max,: FIBS iki konfigürasyonlarda oluşturulabilir.
Bu çalışmada _content ">, bir protokol kurucu bir metaboliti, glukoz ya da glutamin için bir ifade fibs (CHO) hücre çizgileri, Çin hamsteri yumurtalık oluşturmak için sunulmuştur. bir yöntem, in vivo olarak, sensörün kalibrasyonu için kurulur gelecek Quantitative etkinleştirme Şekil 2'de gösterildiği gibi. Buna göre hücre içi metabolit konsantrasyonunun ölçümleri, glukoz veya glutamin hücre içi konsantrasyonu, iki besin işlemdeki yüksek konsantrasyonlarda ilave edildi için, beslemeli-kesikli CHO hücre kültürlerinde tespit edilebilir. sonuçlar Bu invaziv olmayan, düşük maliyetli olduğundan bağımsız enzimatik deneyi ile teyit edildiği gibi FIBS ve daha önceden oluşturulan kalibrasyon eğrisinden floresan sinyali kullanarak, hücre içi konsantrasyonunun doğru tahmini mümkün olduğunu göstermektedir. bu yöntem mevcut analitik teknolojiler üzerinde önemli avantajlar sunar ve hızlı mon olabilir FIBS bir gerçek-zamanlı sinyal vererekkültür boyunca itored.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Hücre Hattı Revival ve Bakım
- 8 mM L-glutamin ve 10 ml / L 100x hipoksantin / timidin takviyesi (tam büyüme ortamı) ile takviye 9 ml CD-CHO ortamı içinde CHO hücreleri canlandırmak.
- 5 dakika boyunca 100 x g'de santrifüj.
- Taze tam büyüme ortamında 10 ml hücreleri yeniden süspanse edin.
- 1 ml'lik bir numune alın ve bir hemasitometre içinde tripan mavi boya eksklüzyon metodunu kullanarak, ışık mikroskopisi ile viyabl hücre konsantrasyonunu belirler.
- 125 ml 3 x 10 5 hücre / ml 'lik bir yoğunlukta bir tohum kültürünü başlatmak çalkalama cam deney şişesinin.
- 120 rpm'de dönen bir yörüngesel çalkalama platformu üzerinde, 37 ° C,% 5 CO2 bulunan nemli bir atmosferde bir inkübatörde kültür koruyun.
- 2 x 10 5 hücre / ml 'lik bir tohumlama yoğunluğunda tam büyüme ortamı içinde her 3-4 günde bir alt kültür.
2. Plasmid C Hücre Hattı transfeksiyonuBiosensor Gene ontaining
- Bir büyük ölçekli plazmid saflaştırma kiti kullanılarak plazmid DNA hazırlayın.
- (37 ° C,% 5 CO2), transfeksiyondan önce 12-24 saat hücreler aktif transfeksiyon anda bölünen sağlamak için uygun koşullar altında hücrelerin koruyun.
- Tripan mavi boya eksklüzyon metodunu kullanarak, hücre sayımı, daha sonra 1 x 10 6 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda bir sallama şişesi içinde 125 ml hücre kültürü, 20 ml bir çalışma hacmini hazırlayın.
- Kullanılan hücre hattı için uygun bir transfeksiyon kiti kullanın. Transfeksiyon reaktifleri oranı plasmid DNA hücre çizgisi ve vektör üzerindeki bağımlı olacaktır. Bu önceki son transfections yürütülmesi için üretici tarafından belirtilen aralık dahilinde oranların bir dizi test ile optimize önerilir. Ayrıca hücrelerin ancak DNA ihtiva eden en az bir negatif kontrol kültürü korumak.
- Statik modu, 4 gün boyunca inkübe edin ve daha sonra bir transfer Şeki125 rpm'de dönen ng platformu.
- Bir öldürme eğrisi tarafından tespit edildiği üzere, uygun bir konsantrasyona kadar plazmid seçimi için uygun antibiyotik ekleyin. Bu çalışmada, zeosin transfekte edilmiş hücrelerin seçilmesi için 400 ug / ml 'lik bir nihai konsantrasyona kadar ilave edildi.
- Kontrol çukurdaki hücre ölmüş kadar, antibiyotik her zaman bir ekleyerek, hücre hattı için uygun bir zaman aralığında ortam kullanın.
- Kültürleri sallayarak ilerleme için en Konfluent kuyuları kullanın.
- Dondurma karışımı 1 ml 10 7 canlı hücreleri içeren şişeler içinde kriyojenik dondurma hücreleri tarafından hücre bankası kurulması. Bu çalışmada, bu% 92.5 büyütme ortamı ve% 7.5 dimetil sülfoksit oluşur.
3. Toplu ve Fed-batch Cell Büyüme Eğrisi
- 50 ml çalışma hacmine sahip 250 ml'lik çalkalama cam deney şişesinin içinde transfekte edilmiş CHO hücrelerinin hücre kültürlerinin, üçlü kurmak için yukarıdaki hücre bakım talimatları takip edin.
- Cultu koruyunnemli bir hücre 125 rpm'de dönen bir yörüngesel çalkalama platformu üzerinde,% 5 CO2 ile 37 ° C'de kuluçka, ve 24 saatlik aralıklarla her bir büyüme kültüründen 4.1 ml örnekleri kaldırmak de res.
- Tripan mavi boya eksklüzyon yöntemi ile, viyabl hücre yoğunluğu ve hücre yaşayabilirliğini belirlemek için numune 100 ul kullanın.
- Viyabl hücre konsantrasyonu sıfıra indirgenene kadar tekrar edin.
- Beslemeli-kesikli hücre kültürleri, sırasıyla 36 mM ve 4 mM başlangıç değerlerine şekilde bunların konsantrasyonlarını geri 6. günde glukoz veya glutamin, uygun miktarda takviye için tekrarlayın. Bu, saf suyun aynı hacimde (bu durumda 12 mi) ile beslenmeleri için olan ek kontrol kültürleri de korunur önerilir.
4. Oranı Ölçümleri FRET
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g yukarıdaki aşama 3.2 ve santrifüj altında uzaklaştırıldı günlük numunelerin 2 ml alın
- Resuspbuz soğuğu fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) içinde bir 2 ml hücre pelletini sona erdi. 6 oyuklu bir plakaya aktarılır ve bu da bir hücre içeren herhangi bir boş örnek ekleyin.
- Derhal 465/435 nm (mavi), 520/510 nm (sarı) 430/435 nm ve emisyon dalga boylarındaki bir uyarma dalga boyunda ve sarı, mavi floresan seviyeleri ölçülür.
- FRET oranları (algılanan mavi floresan yerinde tespit sarı floresan oranı) hesaplayın.
5. Metabolit Tahliller
- 4 ° C'de 5 dakika boyunca 100 x g yukarıdaki aşama 3.2 ve santrifüj altında uzaklaştırıldı günlük numunelerin 2 ml alın Süpernatant kaldırmak.
- 5 dakika boyunca 100 x g hızında tekrar 3 ml buz gibi soğuk PBS ve santrifüj hücre pelletini.
- Süpernatantı ve yukarıdaki gibi 3 ml buz gibi soğuk PBS ile hücre pelletini. 15 saniyelik bir darbe de 3 dakika, her 15 saniye için kapalı örnek 5x sonikasyon. Bu noktada, hücre ilaveİsterseniz cts donmuş olabilir.
- (Malzemelerin tabloya bakınız) hücre içi glikoz konsantrasyonunu belirlemek için, hücre ekstrelerinin örnekler üzerinde üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir glükoz tahlil kiti kullanın.
Not: bir standart eğri oluşturmak için uygun standartları kullanın. Bu çalışmada, standartların konsantrasyonu 0-100 mM arasında değişmektedir. - Standartları için okumalar kullanarak, standart eğri oluşturmak ve (bu durumda: y = 1310.51x - y absorbans okuma ve x, glikoz konsantrasyonu olan 723,43) en uygun doğrusal denklemi bulabilirsiniz.
- , Standart eğri kullanılarak ve dikkate alınarak seyreltme glikoz konsantrasyonları hesaplayın. Hücre içi glikoz konsantrasyonu daha sonra, bu denklem kullanılarak hesaplanabilir:
CHO hücreleri için, tek bir hücre hacmi, 12 uM, 12 'lik bir hücre çapı kullanılarak hesaplanmıştır - (Malzemelerin tabloya bakınız) hücre içi glutamin konsantrasyonunu belirlemek için, hücre ekstrelerinin örnekler üzerinde üreticinin talimatlarına uygun olarak, uygun bir glutamin deney kiti kullanın.
Not: bir standart eğri oluşturmak için uygun standartları kullanın. Bu çalışmada, standartların konsantrasyonu 0-2 mm arasında değişmektedir. - Yukarıda 5.5 'de olduğu gibi, (y absorbans okuma ve x, y = 203.1x + 17.1 glikoz konsantrasyonu bu durumda) kalibrasyon eğrisi oluşturmak
- Standart eğri kullanılarak, dikkate alınarak seyreltme, numunelerin glutamin konsantrasyonunu hesaplamak. Hücre içi glutamin konsantrasyonu, yukarıdaki denklem 1 kullanılarak hesaplanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Metodolojinin bir bakış, Şekil 2'de sunulmuştur. Burada sunulan çalışma olarak, CHO hücreleri FIBS vektör ve stabil hücre hatları ile transfekte edilmiş 400 ug / ml zeosin bir antibiyotik basınçta seçildi. Yapısal olarak glikoz ve glutamin sensörler sentezleyen iki ayrı kararlı hücre soyları bu nedenle, yaratılmıştır. Şekil 1, bu çalışmada kullanılan iki biyosensör konfigürasyonlarını göstermektedir. Glikoz sensörü Apo-Max prensibine dayanan ve mukabil plasmid pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite olmasıdır. Bu, gelişmiş bir mavi floresan proteinin (eCFP) olan bir füzyon ve E. F16A mutant için gelişmiş sarı floresan proteini (EYFP) en Aphrodite çeşididir coli glikoz / galaktoz bağlayıcı proteini periplazmik. 11 amino asit kalıntıları 13 FRET verimliliği artırmak için bağlayıcı bölgeden çıkarıldı. Bu vektör, uniq kullanarak pCDNA4/TO vektörüne klonlandıue bir sitomegalovirüs promotörü ve bir SV40 artırıcı kullanır Eco RI ve Pst I kısıtlama sahaları,.
Glutamin sensörü Apo-Min prensibi (Şekil 1) ve karşılık gelen plasmid E. coli içine sarı floresan protein sitrin bir ekleme elde edilmiştir dayanır glutamin coli periplazmik C-terminaline bağlanmış bir eCFP amino asitler 98 ve 99 arasında bağlayıcı protein. Amino asit ikamesi D157N FRET verimliliğini optimize etmek için birkaç 8 mutasyonlar takiben glutamin için afinitesini artırmak için QBP için yapılmıştır ise yapısı, bağlama bölgedeki artıkların silinmesi ile bükülmez edilmiştir. Glutamin oluşturmak pUTKan bitki ekspresyon vektörü içinde temin edildi ve eklemeyi salıvermek için Bam HI ve Sal ile sindirilmiştir FRET. İkincisi N-terminal arıtma t ile çerçeve içinde vektör pET41a içinde karşılık gelen kısıtlama bölgelerinde klonlandıags. Bu, memeli sentezleme vektörünün üretilmesi için, Sal I ve Xho I ile uyumlu üretilen yapışkan uçları ile Bam HI ve Xho I ile sindirilmiş sonra aynı parça, pCDNA4/TO vektörüne lige edilmiştir.
Plasmid ifade QRT-PCR kullanılarak biyosensör mRNA seviyelerinin ölçülmesi ile teyit edilmiştir. Hem FIBS aktif orta üslü düzeyinde 14 de hücre başına 3.000 Transkriptime β-aktin varsayarak hücre başına 25-44 mRNA kopya olarak deşifre edilecek bulundu.
Toplu her bir hücre hattı kültürleri her FIBS in vivo kalibrasyon için günlük olarak numuneler alınarak fazla büyümek muhafaza edilmiştir. İki hücre çizgilerinin viyabl hücre büyümesi profili, Şekil 3 ve enzimatik tahlilleri ile belirlenen karşılık gelen FRET ölçümleri ve hücre içi metabolit konsantrasyonları gösterilmiştir Tablo 1 'de sunulmuştur. Bir floresan plak okuyucu ölçmek için kullanılmıştırkırmızı ve sarı için 520/510 nm için 465/435 nm 430/35 nm ve emisyon dalga boylarında bir uyarma dalga boyunda floresan numunelerin. Bu kültürün ilk 4 gün içinde bulunan düşük hücre sayıları güvenilmez sinyal FRET neden olduğu bulunmuştur. Benzer şekilde, hücrenin üst düzey ışık saçılması yüksek miktarda üretilen kültür 8. gün sonra mevcut parçalanır. 4-8 gün için sadece veriler bu nedenle, glikoz ve glutamin FIBS için kalibrasyon eğrileri oluşturmak için kullanılan, için eşitlikleri, Tablo 1 'de gösterilmektedir. Sonuçlar FIBS sinyal glutamin için glikoz ve 0.3-2 mM için 1-5 mM arasında hücre içi konsantrasyonları ile güvenilir bir korelasyon ürettiğini göstermektedir.
Bu ve yukarıdaki bulgular doğrulamak için izlenerek, beslemeli-kesikli iki hücre çizgilerinin kültürleri yapıldı fazla büyümek. Yüksek substrat konsantrasyonu (glikoz FIBS ve glutamin FIBS durumunda glutamin durumunda glikoz) ihtiva eden bir besleme ilave edilmişsubstratın hücre dışı konsantrasyonlarını yükseltmek için, hücre kültürünün 6. günde. Glutamin beslemeli kültürü için, glutamin konsantrasyonu, 4 mM kadar arttırılmıştır glikoz beslenen kültür durumunda, hücre dışı glükoz konsantrasyonu, tekrar 36 mM kadar yükseltildi. Şekil 4, bu çalışma için temsili sonuçlarını gösterir. Şekil 4A ve 4C açıkça onlar kadar günde 6 izlenen eğilimin tersine çevrilmesi ile beslenmeye yanıt her gün FRET oranları, tasvir. Özel olarak, Şekil 4A'da, glikoz için FRET oranı glikoz FIBS APO-On yapılandırmayı takip Başlangıcı CHO hücre hattı, ek glikoza tepki olarak 7. günde FIBS azalır. Benzer şekilde, Şekil 4C'de, glutamin için FRET oran Apo-Off sensörlerin ilkesi doğrultusunda, ilave glutamin tepki olarak CHO hücre çizgisi FIBS artar.
Bu ölçümler FRET sonunda kalk için kullanıldıulate belirtilen kalibrasyon eğrileri ve sonuçlara göre, hücre içi, glikoz ve glutamin konsantrasyonu glutamin için glikoz ve Şekil 4D Şekil 4B'de gösterilmektedir karşılık gelmektedir. Bunlar, glukoz ve glutamin enzimatik deneyleri ile belirlenmiş ve yeterli bir anlaşma gösterdiği gibi, bu alt-tabakaların, gerçek hücre içi konsantrasyonlarına karşılaştırılır.
.., Y =-glükoz için 1.232x + 8,034 (R 2 = 0.961): Tablo 1 glikoz ve glutamin FIBS için FRET oranının in vivo kalibrasyonu için sonuçlar kalibrasyon eğrileri tahminleri yapmak için kullanılabilir, aşağıdaki denklem ile tarif edilir ve glutamin (R 2 = 0.87 için y = 1.892x + 0.3329), burada Y, FRET oranıdır ve x mM konsantrasyonudur.
Şekil 1,. Bu çalışmada kullanılan FIBS prensipleri. Glutamin FIBS (solda), glutamin algılama etki bağlanan ve bu nedenle artan FRET, birbirine yakın iki floresan proteinleri bir araya getiren bir konformasyonel değişimi üretir ile Apo-Min prensibi takip eder. Glikoz FIBS (sağ) glikoz algılama alanına bağlanan ve bu nedenle azalan FRET, floresan proteinleri ayıran bir konformasyonel değişikliği oluşturur hangi Apo-Max prensibi takip eder.
Parti için Şekil 3,. Uygun bir hücre konsantrasyonu profili CHO hücre hatları (n = hücre hattı için üç ölçümlerle 2 Biyolojik tekrarlarını) ifade FIBS-glikoz FIBS ve glutamin kültürleri fazla büyümek.
Şekil 4. FIBS üreten CHO hücreleri ve FRET ölçümleri karşılık gelen beslemeli kesikli kültür. (A) Günlük meglikoz FIBS ifade beslemeli-kesikli CHO hücre kültürleri FRET oranı asurements. Ok, hücre kültürüne glikoz ilave gösterir. Değerlerine karşı bir glükoz tahlil kiti kullanılarak ölçülmüştür (b) Gerçek hücre içi glukoz konsantrasyonu profili in vivo glikoz kalibrasyon eğrisi (Tablo 1) bağlı olarak tahmin. (C) glutamin fibs ifade beslemeli-kesikli CHO hücre kültürleri FRET oranı üzerinde günlük ölçümler. Ok, hücre kültürüne ilave glutamin gösterir. Değerlerine karşı bir glutamin tahlil kiti kullanılarak ölçülmüştür (d) gerçek hücre içi glutamin konsantrasyon profili, in vivo glutamin kalibrasyon eğrisi (Tablo 1) göre tahmin. Tüm durumlarda, n = hücre hattı için üç ölçümleri ile 2 biyolojik tekrarlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
FIBS yöntem söndürülmesi ve ekstraksiyon kaynaklanan engelleyerek Bu durumda, büyüme sınırlayıcı besin in, in vivo ve in önemli moleküllerin in situ olarak nicelendirilmesi sağlar. Bulgular FIBS sinyal ve glutamin için glikoz ve 0,3-2 mm 1-5 mM aralığı içinde, hücre içi konsantrasyonları arasında iyi bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Toplu CHO hücre kültürü, bu konsantrasyonlar, üstel sabit ve erken aşamalarında düşüş rastlanmaktadır. Üstel ve durağan fazlar uygun besleme stratejilerinin tasarım açısından en önemli olan, hücrelerin metabolik ihtiyaçlarını tahmin etmek için, bu biyosensör kullanımı bu nedenle endüstriyel ilgilidir. Beslemeli-kesikli Deneyin sonuçları hücre içi glikoz ve glutamin konsantrasyonlarının tahminleri sağlamak için fibs 'uygunluğunu doğrulamaktadır. Erken zaman noktalarında sergilenen sapmalar nedeniyle düşük canlı hücre num ortaya çıkmış olabiliryle ve / veya çünkü glikoz FIBS durumunda, galaktoz, örneğin, diğer metabolitlerin, ile ve glutamin FIBS durumunda, diğer amino asitler ile girişim. Özel olarak, FRET oranında% 20'ye kadar bir azalma aspartat, glutamat, glisin, treonin, valin, tirozin ve 15 varlığında oluşabilir gösterilmiştir. Genel olarak, bu sonuçlar FIBS sinyali bu hata oldukça düşük olduğunu göstermektedir.
Bu metodoloji bir seferde sadece moleküllerin sınırlı sayıda izleyebilirsiniz rağmen, hücre hattı ve proses geliştirme, ya da matematiksel modellerin doğrulanması için bile veri toplama için yararlı bilgiler sağlayabilir. Periplazmik bağlayıcı proteinlerin çeşitliliği göz önüne alındığında, benzer biyosensörler canlı hücreler olarak, gerçek zamanlı olarak bu metaboliti miktar tayini için bir çok yönlü bir yöntem yapma, diğer amino asitler, şekerler ve bu gibi sülfat ve fosfat iyonları içeren 16 gibi küçük moleküller için bir dizi için geliştirilebilir .
FIBS kullanımının önemli bir avantajı, sürekli bir şekilde potansiyel olarak çevrimiçi ölçümler elde etmek için yeteneğidir. Yöntem, bu nedenle elle taşıma azaltmak ve geliştirme çabalarını hızlandırmak, yüksek hacimli uygulamalar için oldukça rahat. Floresan tespiti için dahili işlevselliği ile mikroreaktör ortamlarının artan durumu ile, bir platform profilleme FIBS etkin metaboliti hücre tarama, medya ve proses optimizasyonu ve süreç ölçek-up için kullanılabileceği düşünülmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz nazik pUTKan bitki ekspresyon vektörü olarak inşa FRET glutamin temini için plazmid ve Dr Uwe Ludewig (Hohenheim Üniversitesi) Fret nazik glikoz ile bize sağladığı için Profesör Kurt Frommer (Bilim Carnegie Enstitüsü, Stanford Üniversitesi) teşekkür ederim. AB BBSRC Hedefli Öncelik Studentships programı tarafından finanse edilmektedir. CK ve KP Hem Biopreparatlar İşleme RCUK Bursu tarafından desteklenmektedir. CK da mali destek için Lonza Biologies teşekkür etmek istemektedir. Sentetik Biyoloji ve Yenilik Merkezi cömertçe EPSRC tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
- Moser, I., Jobst, G., Urban, G. A. Biosensor arrays for simultaneous measurement of glucose, lactate, glutamate, and glutamine. Biosens. Bioelectron. 17 (4), 297-302 (2002).
- Billingsley, K., et al. Fluorescent nano-optodes for glucose detection. Anal. Chem. 82 (9), 3707-3713 (2010).
- Dattelbaum, J. D., Lakowicz, J. R. Optical Determination of Glutamine Using a Genetically Engineered Protein. Anal. Biochem. 291 (1), 88-95 (2001).
- Kfouri, M., et al. Toward a miniaturized wireless fluorescence-based diagnostic imaging system. IEEE J. Sel. Top. Quantum Electron. 14 (1), 226-234 (2008).
- Dittrich, P. S., Manz, A. Single-molecule fluorescence detection in microfluidic channels—the Holy Grail in muTAS. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 382 (8), 1771-1782 (2005).
- Hou, B. H., Codamo, J., Pilbrough, W., Hughes, B., Gray, P. P., Munro, T. P. Optical sensors for monitoring dynamic changes of intracellular metabolite levels in mammalian cells. Nat. Protoc. 6 (7), 1818-1833 (2011).
- Bermejo, C., Haerizadeh, F., Takanaga, H., Chermak, D., Frommer, W. B. Dynamic analysis of cytosolic glucose and ATP levels in yeast using optical sensors. Biochem. J. 432, 399-406 (2010).
- Yang, H. Y., Bogner, M., Stierhof, Y. D., Ludewig, U. H(+)-independent glutamine transport in plant root tips. Plos One. 5, (2010).
- Fehr, M., Takanaga, H., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Evidence for high-cavacity bidirectional glucose transport across the endoplasmic reticulum membrane by genetically encoded fluorescence resonance energy transfer nanosensors. Mol. Cell. Biol. 25 (24), 11102-11112 (2005).
- Ai, H. W., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Campbell, R. E. Fluorescent protein FRET pairs for ratiometric imaging of dual biosensors. Nat. Methods. 5 (5), 401-403 (2008).
- Ouyang, M. X., Sun, J., Chien, S., Wang, Y. X. Determination of hierarchical relationship of Src and Rac at subcellular locations with FRET biosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105 (38), 14353-14358 (2008).
- Han, Y., et al. Cultivation of recombinant Chinese hamster ovary cells grown as suspended aggregates in stirred vessels. J. Biosci. Bioeng. 102 (5), 430-435 (2006).
- Deuschle, K., Okumoto, S., Fehr, M., Looger, L. L., Kozhukh, L., Frommer, W. B. Construction and optimization of a family of genetically encoded metabolite sensors by semirational protein engineering. Protein Sci. 14 (9), 2304-2314 (2005).
- Wong, D. C. F., Wong, N. S. C., Goh, J. S. Y., May, L. M., Yap, M. G. S. Profiling of N-Glycosylation gene expression in CHO cell Fed-batch cultures. Biotechnol. Bioeng. 107 (2), 516-528 (2010).
- Behjousiar, A., Kontoravdi, C., Polizzi, K. M. In Situ Monitoring of Intracellular Glucose and Glutamine in CHO Cell Culture. PLoS One. 7, (2012).
- Dwyer, M. A., Hellinga, H. W. Periplasmic binding proteins: a versatile superfamily for protein engineering. Curr. Opin. Struct. Biol. 14 (4), 495-504 (2004).
