Summary
Se presenta una descripción de cómo calibrar Transferencia Förster Resonance Energy sensores biológicos integrados (FIBS) en el perfil metabólico situ. Los FIBS se pueden utilizar para medir los niveles intracelulares de metabolitos de forma no invasiva ayudando en el desarrollo de modelos metabólicos y cribado de alto rendimiento de las condiciones de bioprocesos.
Abstract
En la era de la biología computacional, nuevos sistemas experimentales de alto rendimiento son necesarios con el fin de poblar y refinar los modelos para que puedan ser validados para fines predictivos. Idealmente estos sistemas serían bajo volumen, que se opone a los análisis de muestreo y destructivas cuando los datos de curso de tiempo se han de obtener. Lo que se necesita es una herramienta de supervisión in situ en la que puede reportar la información necesaria en tiempo real y de forma no invasiva. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de concentraciones intracelulares a base de proteínas. Una clase particular de in vivo biosensores que ha encontrado aplicaciones en la cuantificación metabolito se basa en Förster de transferencia de energía de resonancia (FRET) entre dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET sensores biológicos integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular, que tienen tiempos de respuesta rápidos y su cha espectralrísticas cambios de acuerdo a la concentración del metabolito dentro de la célula. En este documento, se describe el método para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS para la glucosa y la glutamina y la calibración de los FIBS in vivo en cultivo celular por lotes con el fin de permitir que el futuro cuantificación de la concentración de metabolito intracelular. Los datos de fed-batch cultivos de células CHO demuestra que los FIBS fue capaz en cada caso para detectar el cambio resultante en la concentración intracelular. Uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la concentración intracelular se determinó con precisión como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente.
Introduction
Monitoreo metabolito tiene diversas aplicaciones en el procesamiento biológico, incluyendo el desarrollo del proceso, los medios de comunicación y el diseño de alimentación, y la ingeniería metabólica. Varios métodos están disponibles para las mediciones de concentración a través de la utilización de 1 enzimática, química 2, o ensayos de unión 3. Una opción interesante es el uso de lámparas fluorescentes, en sensores biológicos in vivo como reporteros de la concentración intracelular de metabolitos clave a base de proteínas. En los ensayos de volumen ultra bajo, la fluorescencia es una herramienta conveniente como la miniaturización realmente mejora la relación de 4,5-señal-ruido y sensores basados en proteínas puede ser codificado genéticamente el sentido de que no hay reactivos exógenos son necesarios para el análisis de metabolitos. Transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) biosensores consisten en dos proteínas fluorescentes conectadas por un dominio de unión a ligando. FRET es una transferencia de energía no radiante de un donante fotoexcitado a un aceptor fluorescente molécula locat ed en estrecha proximidad (<100). La escisión ligando o unión provoca un cambio conformacional en el sensor, que, a su vez, induce un cambio en la proximidad de los fluoróforos, lo que lleva a un cambio en la eficiencia de FRET medido por el cambio en el espectro de emisión. Sensores biológicos FRET integrados (FIBS) se producen de forma constitutiva dentro de la línea celular y sus características espectrales cambian en función de la concentración del metabolito dentro de la célula. FIBS tienen tiempos de respuesta rápidos lo que es ideal para la toma de mediciones para los modelos dinámicos 6. Aplicaciones anteriores incluyen el monitoreo individuales 7-9 y múltiples 10 metabolitos y proporcionar datos sobre la distribución espacio-temporal 11. FIBS se pueden crear en dos configuraciones: Apo-Max, donde la unión del ligando altera la proximidad de los fluoróforos bajada de transferencia de energía y Apo-Min, donde la unión del ligando trae los dos fluoróforos en contacto más estrecho (Figura 1).
_content "> En este trabajo, se presenta un protocolo para la construcción de ovario de hámster chino (CHO) líneas celulares que expresan constitutivamente una FIBS de un metabolito, glucosa o glutamina. Se establece una metodología para la calibración del sensor in vivo para permitir el futuro cuantitativa mediciones de la concentración de metabolito intracelular, tal como se presenta en la Figura 2. Sobre la base de esto, la concentración intracelular de glucosa o glutamina pueden determinarse en discontinuos alimentados cultivos de células CHO, al que se añadieron los dos nutrientes en altas concentraciones en-proceso. Los resultados demuestran que el uso de la señal fluorescente de los FIBS y la curva de calibración previamente construido, la predicción precisa de la concentración intracelular es posible, como se confirmó mediante un ensayo enzimático independiente. Este método ofrece ventajas sustanciales sobre tecnologías analíticas actuales, ya que no es invasiva y de bajo costo y rápido, dando una señal en tiempo real de los FIBS que pueden ser lunmonitoriza todo el cultivo.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Línea Celular Revival y mantenimiento
- Revive células CHO en 9 ml de medio de CD-CHO suplementado con 8 mM de L-glutamina y ml / L de suplemento de hipoxantina 100x / timidina 10 (medio de crecimiento completo).
- Se centrifuga a 100 × g durante 5 min.
- Resuspender las células en 10 ml de medio de crecimiento completo fresco.
- Extraiga una muestra de 1 ml y determinar la concentración de células viables mediante microscopía óptica utilizando el método de exclusión del colorante azul de tripano en un hemocitómetro.
- Iniciar un cultivo a una densidad de siembra de 3 x 10 5 células / ml en 125 ml agitar frascos.
- Mantener el cultivo en una incubadora a 37 ° C, una atmósfera humidificada de 5% de CO 2, en una plataforma de agitación orbital que gira a 120 rpm.
- Subcultura cada 3-4 días en el medio de crecimiento completo a una densidad de siembra de 2 x 10 5 células / ml.
2. La transfección de la línea celular con el plásmido Containing el biosensor Gene
- Preparar ADN plásmido usando un kit de purificación de plásmido a gran escala.
- Mantener las células en las condiciones apropiadas (37 ° C, 5% de CO 2) 12-24 h antes de la transfección para asegurar las células se están dividiendo activamente en el momento de la transfección.
- Contar las células usando el método de exclusión del colorante azul de tripano, y luego preparar un volumen de trabajo de 20 ml de cultivo de células en un matraz de agitación de 125 ml a una concentración de 1 x 10 6 células / ml.
- Utilice un kit de transfección adecuado para la línea celular en uso. El ADN plásmido relación de reactivos de transfección a será dependiente de la línea celular y el vector. Se recomienda que este se optimiza mediante pruebas de un intervalo de relaciones dentro del rango especificado por el fabricante antes de realizar las transfecciones finales. También mantener al menos un cultivo de control negativo que contiene las células, pero sin ADN.
- Incubar durante 4 días en modo estático y luego transferir a una Shaking plataforma que gira a 125 rpm.
- Añadir el antibiótico apropiado para la selección del plásmido a una concentración adecuada como se determina por una curva de muerte. En este estudio, se añadió zeocina a una concentración final de 400 g / ml para la selección de las células transfectadas.
- Cambie los medios en un intervalo de tiempo apropiado para la línea celular, añadiendo antibióticos cada vez, hasta que las células en el control así han muerto.
- Utilice los pozos más confluentes de progresar a temblar culturas.
- Establecer un banco de células mediante la congelación de las células en viales criogénicos que contienen 10 7 células viables en 1 ml de mezcla de congelación. En este trabajo, esta consiste en medio de crecimiento 92,5% y 7,5% de sulfóxido de dimetilo.
3. Lote y Fed-batch Curva de Crecimiento Celular
- Siga las instrucciones para el mantenimiento de células arriba para establecer cultivos de células por triplicado de las células CHO transfectadas en 250 ml de matraces de agitación con un volumen de trabajo de 50 ml.
- Mantener la cultures en un incubador humidificado de células a 37 ° C, con 5% de CO 2, en una plataforma de agitación orbital que gira a 125 rpm, y retirar 4,1 ml muestras de cada cultivo en crecimiento a intervalos de 24 hr.
- Utilice 100 l de la muestra para determinar la concentración celular y la viabilidad celular viable con el método de exclusión del colorante azul de tripano.
- Repetir hasta que la concentración de células viables se reduce a cero.
- Repetir para los cultivos de células de alimentación por lotes se completa con la cantidad apropiada de glucosa o glutamina en el día 6 para restaurar sus concentraciones a sus valores iniciales de 36 mM y 4 mM, respectivamente. Se recomienda que también se mantienen los cultivos de control adicional, que han de ser alimentados con el mismo volumen (12 ml en este caso) de agua pura.
4. FRET mediciones de la relación
- Tomar 2 ml de las muestras diarias retirados en el paso 3.2 anterior y se centrifuga a 100 × g durante 5 min a 4 ° C.
- Resuspfinalizado el pellet de células en 2 ml de hielo frío tampón fosfato salino (PBS). Transfiera esta en una placa de 6 pocillos y añadir una muestra en blanco que no contiene células a un pocillo.
- Medir los niveles de fluorescencia azul y amarillo de inmediato a una longitud de onda de excitación de 430/435 nm y de emisión de longitudes de onda de 465/435 nm (azul) y 520/510 nm (amarillo).
- Calcular los ratios de FRET (relación de fluorescencia amarilla detectado más de fluorescencia azul detectada).
5. Metabolito Ensayos
- Tomar 2 ml de las muestras diarias retirados en el paso 3.2 anterior y se centrifuga a 100 × g durante 5 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante.
- Resuspender el sedimento celular en 3 ml de PBS enfriado en hielo y se centrifuga de nuevo a 100 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante y resuspender el botón celular en 3 ml PBS helado que el anterior. Sonicar el 5x muestra durante 3 minutos cada uno en un pulso de 15 segundos encendido y 15 segundos apagado. En este punto, la celda adicionalcts pueden congelarse si se desea.
- Utilice un kit de ensayo de glucosa adecuado, según las instrucciones del fabricante, con muestras de extractos de células para determinar la concentración intracelular de glucosa (ver tabla de materiales).
Nota: Utilice las normas apropiadas para construir una curva estándar. En este trabajo, la concentración de las normas osciló entre 0-100 mM. - El uso de las lecturas de las normas, construir la curva patrón y encontrar la ecuación lineal de mejor ajuste (en este caso: y = 1310.51x - 723,43 donde y es la lectura de la absorbancia y x es la concentración de glucosa).
- Cálculo de las concentraciones de glucosa utilizando la curva estándar y teniendo en cuenta la dilución. La concentración intracelular de la glucosa puede entonces ser calculado utilizando la siguiente ecuación:
Para las células CHO, el volumen de una sola célula se calculó utilizando un diámetro de célula de 12 M 12 - Utilice un kit de ensayo de glutamina adecuada según las instrucciones del fabricante, con muestras de extractos de células para determinar la concentración de glutamina intracelular (ver tabla de materiales).
Nota: Utilice las normas apropiadas para construir una curva estándar. En este trabajo, la concentración de las normas osciló entre 0-2 mM. - Como en 5.5 anteriormente, construir la curva de calibración (en este caso y = 203.1x + 17,1 donde y es la lectura de la absorbancia y x es la concentración de glucosa)
- Utilizando la curva estándar, calcular la concentración de glutamina de las muestras, teniendo en cuenta la dilución. La concentración de glutamina intracelular se puede calcular utilizando la Ecuación 1 anterior.
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Representative Results
Una visión general de la metodología se presenta en la Figura 2. En el trabajo presentado en este documento, las células CHO fueron transfectadas con el vector de FIBS y líneas celulares estables se seleccionaron a una presión de antibiótico de 400 mg / ml de zeocina. Por lo tanto, se crearon dos líneas celulares estables que expresan constitutivamente separados los sensores de glucosa y glutamina. Figura 1 representa las configuraciones de los dos biosensores utilizados en este estudio. El sensor de glucosa se basa en el principio de Apo-Max y el plásmido correspondiente es pRSET-FLIPglu600μΔ11Aphrodite. Esta es una fusión de la proteína fluorescente cian mejorada (ECFP) y la variante de Afrodita de la proteína fluorescente amarilla mejorada (EYFP) para el mutante F16A de la E. coli glucosa / galactosa periplásmico proteína de unión. 11 residuos de aminoácidos fueron retirados de la región de engarce para mejorar la eficiencia de FRET 13. Este vector se clonó en el vector pcDNA4/TO usando el unique Eco RI y Pst I sitios de restricción, que utiliza un promotor de citomegalovirus y un promotor de SV40.
El sensor de glutamina se basa en el principio de Apo-Min (Figura 1) y el plásmido correspondiente se deriva de una inserción de la citrino proteína fluorescente amarilla en la E. periplásmico de glutamina coli la proteína de unión entre los aminoácidos 98 y 99 con un ECFP unido al C-terminal. La estructura se ha rigidizado por la eliminación de residuos en la región de enlace, mientras que el D157N sustitución de aminoácidos se ha hecho a la QBP para aumentar la afinidad por glutamina, seguido de varias mutaciones para optimizar la eficiencia de FRET 8. La glutamina FRET constructo se suministra en el vector de expresión vegetal pUTKan y se digirió con Bam HI y Sal I para liberar el inserto. Este último se clonó en los sitios de restricción correspondientes en el vector pET41a en marco con la purificación de N-terminal Tags. El mismo inserto se ligó en el vector pcDNA4/TO, después de que había sido digerido con Bam HI y Xho I usando los extremos cohesivos compatibles producidos por Sal I y Xho I, para producir el vector de expresión de mamífero.
La expresión del plásmido se confirmó mediante la cuantificación de los niveles de mRNA de los biosensores utilizando QRT-PCR. Se encontró que ambos FIBS que se transcribe activamente en 25-44 mRNA copias por célula suponiendo β-actina en 3000 por transcripciones de las células a nivel exponencial media 14.
Lotes overgrow culturas de cada línea celular se mantuvieron tomando muestras diarias para la calibración in vivo de cada FIBS. El perfil de crecimiento de células viables de las dos líneas de células se muestra en la Figura 3 y las mediciones de FRET correspondientes y las concentraciones de metabolitos intracelulares determinados por ensayos enzimáticos se presentan en la Tabla 1. Un lector de placas de fluorescencia se utilizó para medirfluorescencia de las muestras a una longitud de onda de excitación de 430/35 nm y de emisión de longitudes de onda 465/435 nm para el cian y el 520/510 nm para el amarillo. Se encontró que los números bajos de células presentes en los primeros 4 días de cultivo dieron lugar a señal de FRET poco fiable. Del mismo modo, el alto nivel de las células lisadas presente después de día 8 de cultivo producido una gran cantidad de dispersión de la luz. Por lo tanto, sólo los datos para los días 4-8 se utiliza para construir las curvas de calibración para los FIBS glucosa y glutamina, las ecuaciones para las que se muestran en la Tabla 1. Los resultados muestran que la señal de FIBS produce una correlación fiable con las concentraciones intracelulares entre 1-5 mm para la glucosa y 0,3-2 mM para glutamina.
A raíz de esto y para validar las conclusiones anteriores, fed-batch overgrow Se realizaron cultivos de las dos líneas celulares. Una alimentación que contiene alta concentración de sustrato (glucosa en el caso de los FIBS de glucosa y glutamina en el caso de los FIBS de glutamina) se complementóen el día 6 del cultivo celular para elevar las concentraciones extracelulares de sustrato. En el caso de la cultura-glucosa alimentado la concentración extracelular de glucosa se incrementó de nuevo hasta 36 mM, mientras que para la cultura-glutamina alimentado, la concentración de glutamina se aumentó a 4 mM. La figura 4 muestra resultados representativos de este estudio. Figuras 4A y 4C representan las proporciones traste en cada día, que responden claramente a la alimentación mediante la inversión de la tendencia que siguieron hasta el día 6. Específicamente, en la Figura 4A, la relación de FRET para la glucosa FIBS línea celular CHO disminuye en el día 7, en respuesta a la adición de glucosa, ya que los FIBS de glucosa sigue la configuración de APO-On. Del mismo modo, en la figura 4C, la relación de FRET para la glutamina mentirijillas CHO línea celular aumenta en respuesta a la adición de glutamina, en línea con el principio de los sensores Apo-Off.
Estas mediciones FRET fueron finalmente utilizan para calcUlate la correspondiente concentraciones de glucosa y glutamina intracelulares basados en las curvas de calibración mencionadas anteriormente y los resultados se muestran en la Figura 4B para la glucosa y la figura 4D para glutamina. Ellos se comparan con las concentraciones intracelulares reales de estos sustratos como se determina con la glucosa y ensayos enzimáticos de glutamina y muestran un acuerdo adecuado.
.. Tabla 1 Resultados para la calibración in vivo de la relación de FRET para la glucosa y glutamina FIBS Las curvas de calibración se describen por las siguientes ecuaciones que se pueden utilizar para hacer predicciones: y =-1.232x + 8,034 para la glucosa (R2 = 0,961), e y = 1.892x + 0,332 por glutamina (R 2 = 0.879), donde y es la relación de FRET y x es la concentración en mM.
Figura 1. Principios de los FIBS utilizados en este estudio. Las FIBS de glutamina (izquierda) sigue el principio de Apo-mínima, por el que la glutamina se une a los dominios de detección y genera un cambio conformacional que trae ambas proteínas fluorescentes más cerca juntos, aumentando así de FRET. Los FIBS de glucosa (derecha) sigue el principio de Apo-Max, por el cual la glucosa se une al dominio de detección y genera un cambio conformacional que separa las proteínas fluorescentes, disminuyendo así de FRET.
Figura 2. Visión general de la metodología para FIBS calibración y posterior cuantificación no invasiva de las concentraciones de glucosa intracelular de glutamina y.
Perfil de la figura 3. Concentración de células viables para el lote overgrow culturas de FIBS-y glucosa FIBS-glutamina que expresan líneas de células CHO (n = 2 repeticiones biológicos con tres mediciones por línea celular).
Figura 4. Cultivo discontinuo Fed de FIBS productoras de células CHO y las correspondientes mediciones de FRET. (A) Todos los días mehicieron mediciones de relación de FRET de fed-batch cultivos de células CHO que expresan FIBS de glucosa. La flecha indica la adición de glucosa al cultivo celular. (B) perfil de la concentración intracelular de glucosa actual medida utilizando un kit de ensayo de glucosa frente a los valores predichos basándose en in vivo curva de calibración de glucosa (Tabla 1). (C) Las mediciones diarias de la relación de FRET de flujo discontinuo cultivos de células CHO que expresan FIBS glutamina. La flecha indica la adición de glutamina para el cultivo de células. (D) actual perfil de concentración de glutamina intracelular se mide usando un kit de ensayo de glutamina contra los valores predicho basado en in vivo curva de calibración glutamina (Tabla 1). En todos los casos, n = 2 repeticiones biológicos con tres mediciones por línea celular.
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Discussion
Los FIBS permiten in vivo y en la cuantificación in situ de moléculas clave, en este caso nutrientes limitantes del crecimiento, la eliminación de incertidumbres derivadas de temple y métodos de extracción. Los hallazgos sugieren que existe una buena correlación entre la señal FIBS y las concentraciones intracelulares en el rango de 1-5 mm para la glucosa y 0,3-2 mM de glutamina. En el lote de cultivo de células CHO, estas concentraciones se encuentran en las fases de declive exponencial, estacionaria, y los primeros. Las fases exponenciales y estacionarias son las más críticas en cuanto a la elaboración de estrategias apropiadas de alimentación, por lo que el uso de estos biosensores para la estimación de las necesidades metabólicas de las células es de interés industrial. Los resultados del experimento de alimentación discontinua confirman la idoneidad de los FIBS de proporcionar estimaciones de las concentraciones de glucosa intracelular de glutamina y. Desviaciones expuestos en los puntos de tiempo anteriores pueden haber surgido debido a la menor número de células viablesbros y / o por la interferencia de otros metabolitos, por ejemplo, por la galactosa en el caso de los FIBS de glucosa, y por otros aminoácidos en el caso de los FIBS glutamina. Específicamente, se ha demostrado que una reducción de hasta el 20% en la proporción de FRET puede ocurrir en la presencia de aspartato, glutamato, glicina, treonina, valina, tirosina y 15. En general, estos resultados sugieren que el error en la señal de FIBS es bastante bajo.
Aunque esta metodología sólo puede controlar un número limitado de moléculas a la vez, puede proporcionar información útil para la línea celular y el desarrollo de procesos, o la adquisición de datos, incluso para la validación de modelos matemáticos. Dada la diversidad de proteínas de unión periplásmicas, biosensores similares pueden ser desarrollados para una serie de moléculas pequeñas, incluyendo otros aminoácidos, azúcares, y los iones tales como sulfato y fosfato 16, haciendo de este un método versátil para la cuantificación de metabolitos en tiempo real en células vivas .
Un beneficio clave de la utilización de FIBS es la capacidad para obtener mediciones en línea potencialmente de una manera continua. Por consiguiente, el método se presta para aplicaciones de alto rendimiento que puede reducir la manipulación manual y acelerar los esfuerzos de desarrollo. Con el aumento de la disponibilidad de entornos microreactor con funcionalidad incorporada para la detección de fluorescencia, se prevé que un metabolito FIBS habilitado perfiles de plataforma puede ser utilizado para el cribado de células, medios de comunicación y la optimización del proceso, y el proceso de aumento de escala.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos al profesor Lobo Frommer (Institución Carnegie para la Ciencia, la Universidad de Stanford) para la amabilidad de darnos la glucosa FRET plásmido y el Dr. Uwe Ludewig (Universidad de Hohenheim) por la amabilidad de suministro de la glutamina FRET construir en el vector de expresión vegetal pUTKan. AB está financiado por el programa de becas de Prioridad BBSRC apuntado. Tanto CK y KP son apoyados por RCUK Becas en Procesamiento biofarmacéuticos. CK También desea agradecer a Lonza biológicos por su apoyo financiero. El Centro para la Biología Sintética e Innovación es generosamente apoyada por el EPSRC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CHO-S Cells | Life Tecnologies | 11619-012 | Cell line will vary depending on the goals of the study |
| pCDNA4/TO vector | Life Tecnologies | ||
| TransIT-PRO Transfection Reagent | Mirus Bio | MIR 5700 | Transfections can be accomplished using any method suitable for the cell line under study |
| Zeocin | Invivogen | ||
| CD-CHO medium | Life Technologies | 10743-011 | Cell growth medium is dependent upon the cells under study |
| 100x HT Supplement | Life Technologies | 11067-030 | |
| L-Glutamine 200 mM (100x), Liquid | Life Technologies | 25030032 | |
| InfinitePRO 200 plate reader | Tecan | FLx800TBI | Any 96-well fluorescence plate reader that can access the required wavelengths can be substituted |
| Filters for plate reader | Tecan | 30000463 | |
| Maxiprep Plasmid Purification Kit | Qiagen | 12163 | Any suitable kit can be substituted |
| Amplex Red glucose/glucose oxidase assay kit | Invitrogen | A22189 | Any suitable kit can be substituted |
| EnzyChrom Glutamine Assay Kit | BioAssay Systems | EOAC-100 | Any suitable kit can be substituted |
| Improved Neubauer hemocytometer | Fisher Scientific | MNK-420-010N | |
| Incubator | Nuaire | NU-5510E |
References
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