Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف

Published: March 10, 2014 doi: 10.3791/51201
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

Abstract

الخلايا البلعمية تلعب دورا رئيسيا في نظام المناعة الفطرية عن طريق إزالة والقضاء على غزو الكائنات الحية الدقيقة في phagosomes بهم. يبلوع النضج هو عملية معقدة ومنظم بإحكام خلالها يبلوع الوليدة يخضع التحول جذرية من خلال التفاعلات مدبرة جيدا مع مختلف العضيات ومقصورات الخلوية في السيتوبلازم. هذه العملية، وهو أمر ضروري لوظيفة الفسيولوجية للخلايا البلعمية عن طريق تزويدها phagosomes مع ممتلكاتهم التحللي وجراثيم، ويتوج في انصهار phagosomes مع الجسيمات الحالة ونشوء حيوي من phagolysosomes الذي يعتبر المرحلة الأخيرة والحاسمة من النضج لphagosomes. في هذا التقرير، ونحن تصف طريقة التصوير الخلية الحية القائمة على التحليل النوعي والكمي لعملية ديناميكية من يحلول ليبلوع تقديم المحتوى، والذي هو السمة المميزة ليحلول يبلوعي نشوء حيوي. يستخدم هذا النهج بلي مفتش المغلفة كنموذج لphagocytosis وfluorophore مترافق الجزيئات ديكستران باعتبارها اللمعية الليزوزومية التحقيق البضائع، من أجل متابعة تسليم ديناميكية من المحتويات lysosmal إلى phagosomes في الوقت الحقيقي في الضامة الحية باستخدام الوقت الفاصل بين التصوير والمسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري. نحن هنا تصف بالتفصيل الخلفية، خطوات تحضير والإعداد خطوة بخطوة تجريبية لتمكين نشر سهلة ودقيقة لهذا الأسلوب في مختبرات أخرى. أسلوبنا وصف بسيط، قوية، والأهم من ذلك، يمكن تكييفها بسهولة لدراسة التفاعلات phagosomal والنضج في النظم المختلفة وتحت مختلف إعدادات التجريبية مثل استخدام مختلف أنواع الخلايا البلعمية، وفقدان وظيفة من التجارب، تحقيقات مختلفة، و جسيمات البلعمة.

Introduction

البالعات المهنية، بما في ذلك الضامة، تلعب حاسما في الجهاز المناعي. بالإضافة إلى كونها خط الدفاع الأول في نظام المناعة الفطرية، كما أنها تلعب دورا حاسما في تفعيل المناعة التكيفية من خلال إشارات وتقديم المستضد دورا 1-3. بينما وظيفة البالعات المهنية متعددة الأوجه، يبلوع النضج هو العمود الفقري الحرجة للجراثيم ومستضد تجهيز ظيفة البالعات المهنية 4،5. على مستقبلات بوساطة الإحاطة وامتصاص هدفا البلعمية، مثل البكتيريا، ويبلوع الوليدة يمر عبر سلسلة معقدة ومنسقة جيدا من التفاعل والتبادل مع مقصورات للشبكة التقامي والعديد من العضيات الخلوية الأخرى 6. طبيعة المركبات تبادلها مع هذه الكيانات الخلوية وكذلك تنظيم وتوقيت الأحداث الانصهار يحدد اللمعية phagosomal الوسط وphagosالعمال تكوين الغشاء، وبالتالي 7، مصير يبلوع النضج 8.

ويتمثل أهمية الفسيولوجية لليبلوع النضج من الاستراتيجيات المتنوعة التي تستخدمها مختلف مسببات الأمراض بين الخلايا للهروب من واعتقال أو تخريب يبلوع النضج 9. معظم هذه الاستراتيجيات بشكل مباشر أو غير مباشر منع المرحلة النهائية والحاسمة من عملية النضج يبلوع: انصهار يبلوع مع أواخر مقصورات endosomal / الليزوزومية، التي يمنحها لهم الجزء الأكبر من الانزيمات حلمهي والعوامل المضادة للبكتيريا من يبلوع ناضجة 7 ، 8،10. تحليل هذه الخطوة النهائية والحاسمة وبالتالي يمكن أن توفر لنا مؤشرات قوية حول حالة نضوج phagosomes وإذا كانت الدولة الفسيولوجية الطبيعية يجري تتأثر سلبا أو إيجابا تحت إعدادات معينة التجريبية التي يجري استخدامها.

مقصورة أواخر endosomal / الليزوزومية وتعتبر ليالي عموما أن تكون المقصورات محطة لمسار التقامي، الذي يعرف ومتميزة من المقصورات التقامي في وقت مبكر عن وجود مختلف، مرحلة محددة، والجزيئات علامة. على سبيل المثال الانزيمات حلمهي أو مكونات الأغشية مثل البروتينات المرتبطة غشاء الليزوزومية (مصابيح) وغيرها 11. محطة التقامي المشار المقصورات من الآن فصاعدا إلى مجرد الجسيمات الحالة أيضا بمثابة الموقع الرئيسي للمراحل النهائية من عملية الهضم في نهاية أكلة / التقامي مسار 12. بهذه الطريقة، يمكن تحميلها من خلال تحقيقات غير قابلة للهضم والإلتقام macropinocytosis من الوسط خارج الخلية ونقلها عبر مسار التقامي إلى الجسيمات الحالة، حيث يتراكم 13،14 بعد اتباع دورة محددة من امتصاص والمطاردة. وتستخدم المجسات-Fluorophore مترافق للفحص المجهري الفلورسنت مثل البوليمر العضوية ديكستران غير قابلة للهضم عادة باسم endocyticprobes 15-17.

ق = "jove_content"> في هذه الطريقة، ونحن تصف استخدام بلي مفتش المغلفة كبضاعة البلعمية للتحقيق يبلوع النضج من خلال تحليل تسليم الليزوزومية المحتويات اللمعية لphagosomes. باستخدام مسبار ديكستران-fluorophore مترافق كعلامة كشفها بسهولة من الجسيمات الحالة في نخاع العظام الحية المستمدة الضامة (BMM) والوقت الفاصل بين التصوير الفيديو مع متحد البؤر المجهر الليزر المسح الضوئي، ونحن نتابع عملية ديناميكية من تسليم البضائع في phagosomes مع ارتفاع القرار الزماني. نحن ثم تصف كيف يمكن تقييم البيانات الوقت الفاصل بين التصوير التي تم جمعها باستخدام مفتوحة المصدر ومتاحة بحرية برمجيات تحليل الصور، فيجي (أو يماغيج)، وتحليلها إحصائيا باستخدام Microsoft Excel وعرضها باستخدام برامج GraphPad بريزم 14،18.

بعد وصف أسلوبنا، والتجارب مماثلة يمكن تصميم باستخدام إعدادات والعوامل المعدلة للتحقيق تأثيرها على يبلوع النضج؛ تقريبا أي بعد التمديدنوع من الخلايا البلعمية لها الأولية أو خط خلية ملتصقة، وفقدان الوراثية من التجارب ظيفة بما في ذلك الجينات خروج المغلوب وتدق إلى أسفل، المسوخ أو التعبير عن البروتينات الانصهار، الأهداف، أكلة، ومركبات الطلاء microbead، تحقيقات endosomal / الليزوزومية ومثل هذه العوامل السيتوكينات، مثبطات الكيميائية، أو سيرنا من بين أمور أخرى كلها المتغيرات التي يمكن تطبيقها على النهج الأساسي من هذا الأسلوب.

نحدد الهدف والمتطلبات الأساسية لهذه الطريقة على النحو التالي:

  • الهدف من طريقة: لتمكين الملاحظة المباشرة، الكمية والنوعية وتحليل يبلوع النضج مع القرار الزماني عالية في الخلايا الحية البلعمية.
  • البضائع البلعمية: وmicroparticle المغلفة بشكل مناسب أو الهدف البيولوجية. نحن هنا استخدام مفتش المغلفة 3 ميكرون المجهرية الدقيقة البوليسترين كروية التي يتم المنضوية بسهولة عبر FC-γ مستقبلات بوساطة البلعمة. بدلا من ذلك، أي الكائنات الحية الدقيقة أو هيئة التصنيع العسكري المغلفةroparticle التي مستقبلات البلعمية موجود على خلايا يمكن استخدامها.
  • الخلايا البلعمية: الخلايا البلعمية تمسكا معربا عن مستقبلات البلعمية المناسبة. نحن هنا استخدام الماوس BMMs الأولية التي تعبر بجلاء المستقبلات FC-γ. بدلا من ذلك، يمكن أن تستخدم الخلايا الجذعية (DC)، وحيدات الخلايا الظهارية أو أكلة أو طفرات وراثية أو المتغيرات خروج المغلوب.
  • الليزوزومية البضائع: A التحقيق الليزوزومية fluorescently المسمى. هنا، يتم استخدام تكساس الأحمر مترافق-70،000 kiloDaltons ديكستران (Dex70kD) مثل البضائع اللمعية من الجسيمات الحالة. بدلا من ذلك، أي علامة fluorescently كشف من حجرة الخلوية أو عضية، أو التحقيق الملائمة لخصائص phagosomal مثل الحموضة أو الهادمة القدرات، يمكن أن تستخدم لدراسة تطور يبلوع النضج.
  • العوامل المؤثرة: على سبيل المثال، يشير الجزيئات، والمركبات الكيميائية، جين تدق إلى أسفل، أو التعبير عابرة للبروتينات متحولة يمكن. هنا، لقد forgواحد استخدام مثل هذا العامل من أجل البساطة، ولكن لمثال حديث مع متحولة التعبير البروتين وتدق إلى أسفل العوامل المؤثرة يرجى الاطلاع Kasmapour وآخرون 18 أي العوامل التي يمكن أن تؤثر على البلعمة أو الظروف والتنقل من phagosomes و / أو المقصورات التي تتفاعل مع phagosomes النضج يمكن استخدامها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

رعاية الحيوان وجميع الإجراءات في هذا البروتوكول اتباع المبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية.

إعداد التحضيرات التي بالرمز "Π" مسبقا.

1. إعداد BMMs

  1. تنفيذ اعدام الفئران عن طريق خلع عنق الرحم.
  2. إزالة عظم الفخذ وعظام الساق، وعظام خالية من الأنسجة وتقليم طرفي تتيح الاستفادة من نخاع العظام.
  3. إبقاء العظام في الجليد الباردة PBS أو الجليد الباردة المتوسطة DMEM (تستكمل مع 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين، على الجليد حتى الخطوة التالية.
    ملاحظة: إجراء الخطوات التالية في إطار مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية للحد من مخاطر التلوث.
  4. مسح تجويف النخاع مع الباردة PBS + البنسلين / الستربتوميسين باستخدام 26 G (0.45 ملم) إبرة تعلق على حقنة 1 مل.
  5. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 350 x ج لطيف لمدة 10 دقيقة، resuspend الكرية في ميد BMMالبوتاسيوم وصفيحة في علم الأحياء المجهرية العقيمة noncoated أطباق بتري.
    1. إعداد المتوسطة BMM
      • Dulbecco لتعديل النسور متوسطة DMEM
      • 10٪ المعطل FCS
      • 20٪ الماوس الخلايا الليفية خط L929 خلية ثقافة طاف (مصدر بلعم مستعمرة عامل تحفيز، M-CSF)
      • 5٪ مصل الحصان
      • 2 مم الجلوتامين
    2. إعداد خط الخلية مستنبت L929؛
      • RPMI (معهد روزويل بارك التذكاري) 1640 متوسطة
      • 10٪ المعطل FCS
      • 2 مم الجلوتامين
    3. إعداد الماوس الخلايا الليفية L929 خط خلية ثقافة طاف؛
      • تم تقسيم الخلايا متموجة L929 1:4، مثقف في 175 سم 2 قوارير لمدة 2 أيام باستخدام 20 مل L929 المتوسطة وطاف ثقافة جمعت بعد 48 ساعة، يصفى ويضاف إلى BMM المتوسطة
  6. احتضان الخلايا مسح منعظم الفخذ في حاضنة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  7. بعد كل 48 ساعة (الحد الأقصى 72 ساعة) من الحضانة، نضح المتوسطة واستبدالها بواسطة الطازجة المتوسطة BMM، لمدة تصل إلى 10 يوما. وكانت أكثر من 95٪ من الخلايا إيجابية لCD14 كما تم اختبارها من قبل التدفق الخلوي. CD14 هي مستقبلات التعرف على الأنماط عنها بشكل رئيسي من قبل الضامة. من خلال تحديد النسبة المئوية للخلايا إيجابية لهذا المستقبل، قد ولدت ثقافة نقية من BMMs ملتصقة.

ملاحظة: إعداد والثقافة الخلايا وفقا لذلك إذا تم استخدام أنواع الخلايا الأخرى.

2. طلاء من بلي كما أكلة البضائع

  1. لإعداد 1 مل حبة التعليق، استخدم 400 ميكرولتر من 2.5٪ 3 ميكرون المجهرية الدقيقة البوليسترين carboxylated، أو المجهرية الدقيقة بديلة.
  2. نقل تعليق حبة إلى 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، وغسل 3X مع برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر من 500 ملي 2 - (N-morpholino) ethanesulfonic ملح الصوديوم حامض، MES عازلة في درجة الحموضة 6.7 إلى بيليه حبة.
  3. حل 50 ميكروغرام الماوس مفتش (بولكلونل مفتش الأضداد) في 50 ميكرولتر العقيمة DDH 2 O وإضافة إلى تعليق حبة.
  4. ملء التعليق حتى 1 مل مع DDH العقيمة 2 O (450 ميكرولتر).
  5. احتضان الحل لمدة 15 دقيقة على عجلة دوارة في RT.
  6. إعداد EDAC عبر رابط، N-(3-dimethylaminopropyl) هيدروكلوريد-N'-ethylcarbodiimide في تركيز 10 ملغ / مل وإضافة 14 ميكرولتر لتعليق حبة.
    ملاحظة: EDAC عبر وصلات الأمينية مجموعات من مفتش مع مجموعات الكربوكسيل على السطح من الخرز ويسهل الشلل في مفتش على سطح حبة. هذا أمر بالغ الأهمية لامتصاص حبة وبالتالي ينبغي إعداد الحل طازجة.
  7. احتضان تعليق على عجلة دوارة لمدة 1 ساعة على RT.
  8. إضافة 14 ميكرولتر من EDAC عبر رابط واحتضان تعليق على عجلة دوارة لمدة 1 ساعة على RT.
  9. الطرد المركزي تعليق على 10،000 x ج لمدة 2 دقيقة في microcentrifuge.
  10. تغسل حبات 3x أخرى في المحطة العازلة (1٪ تريتون X-100 في 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 9.4) من أجل وقف رد الفعل عبر ربط، عن طريق إعادة التعليق بيليه في المخزن وقف والغزل الحل في 10،000 x ج لمدة 2 دقيقة.
  11. تغسل حبات 3X في برنامج تلفزيوني و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني مل 1.
    اختياري: إعداد مأخوذة العمل من 30-50 ميكرولتر.
  12. تخزين التعليق حبة مفتش المغلفة في 4 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن 4 أسابيع، وتسمح أبدا تعليق ليتم تجميدها.

ملاحظة: A حافظة مثل أزيد الصوديوم بتركيز نهائي من 0.02٪ (ث / ت) ويمكن أن يضاف إلى تعليق لمنع نمو البكتيريا والتلوث. في هذه الحالة غسل حبات قبل استخدامه لابد من القيام بها لتجنب الآثار السامة للخلايا من المواد الحافظة. أجهزة الطرد المركزي قسامة من التعليق على 10،000 x ج لمدة 2 دقيقة وتغسل حبات من قبل إعادةتعليق بيليه في برنامج تلفزيوني. تكرار غسل 3X.

3. إعداد محلول المخزون ديكستران دقق

  1. حل kiloDaltons تكساس الأحمر ديكستران 70،000 (Dex70kD) في برنامج تلفزيوني في 20 ملغ / مل وتخزينها في -20 درجة مئوية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: حافظ على الأسهم في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أشهر، أو عند 4 درجة مئوية لمدة أسابيع قليلة، راجع وثائق الشركات المصنعة.
  2. إعداد الحل ديكستران للتجربة من الأسهم عن طريق تمييع كاملة في DMEM خلية ثقافة المتوسط ​​(DMEM، و 10٪ FCS، 2 مم L-الجلوتامين) في ما يقرب من 1 ملغ / مل (أضعاف العديد من محلول مركز من شأنها أن تضعف إلى تركيز العمل النهائية من 20 ميكروغرام / مل قبل بالإضافة إلى الخلايا).
  3. استخدام الموجات فوق الصوتية لمياه حمام يصوتن للقسامة ديكستران لمدة 5 دقائق إلى التجانس الحل وحل المجاميع التي يمكن أن تؤدي لاحقا إلى جيل قطعة أثرية أثناء التصوير.
  4. أجهزة الطرد المركزي في أقصى زلمدة 5 دقائق في microcentrifuge لإزالة أي كتل غير منحل أو الملوثات من الحل.
  5. نقل بعناية طاف لأنبوب جديد مع تجنب بيليه في أسفل الأنبوب وتمييع الحل لتركيز العمل النهائية من 20 ميكروغرام / مل في DMEM كاملة خلية ثقافة المتوسط.
  6. تصفية العقيمة الحل باستخدام 0.2 ميكرون حقنة شنت التصفية.

4. ديكستران تحميلها مسبقا

  1. خلايا البذور في التصوير الخلية الحية طبق أسفل الزجاج واحتضان لمدة 12 ساعة على الأقل (عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي) لضمان المرفق والتأقلم.
    ملاحظة: هناك أطباق أسفل الزجاج مجزأة المتاحة التي تسمح إجراء التجارب متعددة (تصل إلى أربعة أقسام) لكل طبق.
  2. إعداد ديكستران في حل DMEM كما هو موضح في البروتوكول 3. الاحماء أعد ديكستران في حل DMEM، وذلك باستخدام حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
  3. نضح المتوسطة والثانية إضافة إلى حل ديكستران الخلايا بعناية واحتضان عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي لل2-8 ساعة لامتصاص.
    ملاحظة: الخطة وتحسين البروتوكول استنادا إلى التحقيق وخلية النوع الذي يستخدم والحفاظ بشكل صارم لهذه المدة عند تكرار التجارب. هذا أمر ضروري لالشخصى تراكم ديكستران في مسار التقامي وبالتالي استنساخ التجارب.
  4. غسل الخلايا 3X مع prewarmed كاملة المتوسطة DMEM؛ نضح المتوسطة وشطف الخلايا بعناية مع المتوسطة الطازجة.
  5. احتضان الخلايا مع DMEM المتوسطة كاملة لل4-12 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الغلاف الجوي.
  6. غسل خلايا مرة واحدة مع prewarmed كاملة الفينول تصفيتها الحمراء الخالية DMEM المتوسطة.
  7. للحصول على نتائج التصوير الأمثل، وتغير لprewarmed كاملة الفينول تصفيتها الحمراء الخالية DMEM المتوسطة على الأقل 30 دقيقة قبل بدء التصوير. قد يسبب الفينول الحمراء التبريد من إشارات الفلورسنت، وزيادة الضوضاء في الخلفية ووبالتالي تقليل تباين الصورة والوضوح.

ملاحظة: إعداد المجهر وإعدادات التصوير في وقت مبكر، وفقا لبروتوكول مبرمجا والأمثل استنادا إلى نوع من التحقيق والخلايا التي يتم استخدامها.

5. مضيفا الخرز مفتش المغلفة

  1. تتوازن قسامة من معد مسبقا 1٪ حبة التعليق على RT ويصوتن في حمام ماء الموجات فوق الصوتية لمدة 2-3 دقيقة.
  2. إضافة 1-6 ميكرولتر من تعليق خرزة 1٪ إلى تصفية كاملة الفينول الحمراء المتوسطة DMEM الحرة في إطار مجلس الوزراء من الدرجة الثانية للسلامة الأحيائية للحد من مخاطر التلوث (تركيز انطلاق جيدة 1 ميكرولتر / 2 سم 2 سطح الطبق).
    ملاحظة: تم المصنفة هنا BMMs في 25،000 خلية / جيدا وتمت إضافة 6 ميكرولتر من 1٪ الأسهم حبة التعليق إلى المتوسطة في الطبق. هذا يعادل تقريبا نسبة حبة / خلية من 15:01. نسبة لابد من تعديلها لنوع من الخلايا المستخدمة والمواد حبة؛ ط.ه. حبات اللاتكس يكون منخفض الكثافة و لا تنزل الى القاع بسرعة، في حين تغرق الخرز البوليسترين وتأتي في اتصال مع الخلايا الملتصقة أسرع بكثير، وبالتالي في أعداد أكبر.
    ملاحظة: اعتمادا على التجربة، قد يكون من ميزة لتحديد المنطقة التي سيتم مراعاتها في وقت مبكر. ويمكن بعد ذلك أن تضاف حبة التعليق فقط إلى أن منطقة محددة من الطبق أسفل الزجاج، وبالتالي زيادة احتمال مراقبة الأحداث امتصاص مواتية.
  3. سحابة كثيفة من حبات يمكن أن تنتشر من قبل pipetting بلطف تعليق في الطبق أسفل الزجاج.
  4. الانتظار حتى حبات تنزل الى قاع الطبق أسفل الزجاج وما يقرب من في نفس الطائرة مع الخلايا البلعمية ملتصقة.
  5. التركيز على المنطقة ذات الاهتمام (ROI) وبدء الوقت الفاصل بين التصوير.

ملاحظة: قد يكون من الضروري لصقل التركيز أثناء التصوير هو في التقدم، اعتمادا على نظام التصوير الذي يستخدم، في ستابيليتي وتنقل الخلايا ملاحظتها. ومع ذلك، لاحظ أن هذا قد تجعل من المستحيل، التحليل السليم للphagosomes التي تحيد بشدة من الطائرة من التركيز نتيجة لإعادة تركيز.

6. التصوير

اتبع الإرشادات العامة أدناه للحصول على جودة التصوير الأمثل؛

  1. استخدام نظام التصوير متحد البؤر مثل نظام الليزر أو مسح القرص الغزل.
    ملاحظة: تم استخدام لايكا TCS SP5 AOBS ليزر متحد البؤر المجهر تسيطر عليها البرنامج لايكا LAS AF ومجهزة غرفة التحكم البيئي هنا عن الوقت الفاصل بين التصوير الفيديو.
  2. تحسين إعدادات التصوير مثل سرعة المسح الضوئي، والتكبير، والقرار، الخ. بطريقة تسمح لمعدل إطار في كل 7-20 ثانية، اعتمادا على النظام المستخدم.
    ملاحظة: هنا، بسرعة 200 هرتز المسح الضوئي، والماسح الضوئي 2X تقريب والمتوسط ​​خط 2-3X بدرجة وضوح 512 بكسل العاشر 512 دورة الفتشوبlted في وقت تسجيل بين 3-5 ثانية / رامي. تم استخدام معدل إطار في كل 10 ثانية لتسجيل الأفلام الفاصل الزمني مع فترات من 120 دقيقة على الأقل.
  3. استخدام إعدادات الإثارة / الانبعاثات المناسبة بناء على نظام يستخدم التصوير والتحقيق (ق).
    1. تحسين إعدادات لمنع الإفراط في الصورة تبيض.
      ملاحظة: وهنا، كان تكساس الأحمر ديكستران 70kD متحمس باستخدام DPSS (561 نانومتر) تم الكشف عن الليزر وانبعاث الضوء من خلال جهاز كشف الهجين لايكا (HYD) في 600-650 نانومتر مع ذروة الانبعاثات في 610 نانومتر. كثافة الليزر لابد من تكييفها وفقا لكثافة إشارة وتظل منخفضة قدر الإمكان لتقليل الصورة تبيض من fluorophore (ق) والصورة تأثير سمية ضوء الليزر على الخلايا. عموما، من المهم تحقيق التوازن بين سرعة المسح الضوئي، الخط المتوسط، دقة المسح الضوئي، الإطار الزمني ومدة التصوير للحصول على السليم والمستقر كثافة إشارة والتقاط مدة كاملة من امتصاص حبة ويبلوع النضج المواليةسيس.
  4. تشمل مشرق الميدان (BF) قناة لمراقبة حبات إذا لم يتم مترافق مع fluorophore.
    ملاحظة: بجوار القناة الأحمر تكساس، وكان يستخدم قناة BF لتصور الخرز، وكان يستخدم نفس DPSS الليزر كما تم الكشف عن مصدر الضوء وإشارة مع مضاعف صورة (PMT) كاشف.
    ملاحظة: تأكد من تطبيق الإعدادات تسجيل متطابقة عند الحصول على البيانات التي سيتم جمعها. المعلمات أهمها: شدة الإثارة ليزر، ووضع كاشف، وإعدادات الاستحواذ، والتكبير فترات الإطار. لن باستخدام فترات الإطار متطابقة تستلزم خطوة منحنى المتوسط ​​كما سوف نقاط البيانات الملاحظة لا تتداخل (على سبيل المثال لجمع ملاحظة مع إطارات المكتسبة في كل 7 ثوانى مع مجموعة أخرى مع إطارات في كل 12 ثانية). وهذا من شأنه زيادة الخطوات المطلوبة لتقييم البيانات وتتطلب برامج إضافية مع وظيفة منحنى المتوسط، مثل OriginLab 'ق المنشأ البرمجيات إحصاءات برو ( http://www.originlab.com/ ).
  5. ويفضل، حفظ الفيديو في الوقت الفاصل بين الأم ملف تنسيق نظام التصوير المستخدمة وتجنب المصدرة في شكل مضغوط.

ملاحظة: وهنا، تم حفظها الأفلام الفاصل الزمني في شكل لايكا LAS AF الأم الملفات، والتي تم استيرادها ثم مباشرة لفتح في فيجي (LIF). فيجي هي قادرة على قراءة تنسيقات الملفات الأصلية من معظم الشركات المصنعة باستخدام المجهر شملت بيو صيغ المستورد في المكونات. تصدير ملف الفيلم مرور الزمن في سلسلة الصور مع JPG أو TIFF أو كملف فيديو في شكل الحاوية AVI ليس من الضروري أو الموصى بها. بالإضافة إلى الحفاظ على جودة الصورة أفضل وجه ممكن من ملاحظة الأصلي عن طريق تجنب خوارزميات الضياع (مثل JPEG)، وذلك باستخدام تنسيق ملف المجهر الأم يؤمن بأن البيانات الفوقية للملف (طوابع الوقت، والتكبير، والليزر واكتساب شدة، وإعدادات كاشف الخ) والحفاظ عليها والمتاحة لفيجي. ومع ذلك، إذا كان لأي سبب من الأسباب، تحتاج ملفات الفيديو في الوقت الفاصل بين ليتم تصديرها في شكل مختلف للتحليل، للتأكد من استخدام تنسيقات الملفات غير المضغوطة مثل سلسلة صورة TIFF ومنفصلة اللون RGB (الأحمر والأخضر والأزرق) قنوات بالفعل في هذا خطوة، وفيجي في كثير من الأحيان لا يمكن فصل بنجاح القناة BF من القنوات لون آخر في الملفات التي تم تصديرها. أيضا، تأكد للحفاظ على الملفات المجهر الأصلي كمرجع.

7. تحليل الوقت الفاصل بين الأفلام

  1. استخدام يماغيج، فيجي أو أي برامج أخرى التي توفر القدرة على التحليل الجمعيات إشارة نظائرها.
    ملاحظة: وهنا استخدمت فيجي لتحليل الأفلام مرور الزمن. فيجي هي توزيع يماغيج تحتوي على حزمة معالجة الصور مع القوائم أداة تنظيم والأم المكونات الإضافية إضافية، متوفرة للتحميل مجانا في http://fiji.sc . عملية وصفها في هذه الطائفةويصور أيون في الشكل 2.
  2. فتح الملف في فيجي بالنقر على "ملف"، "فتح" واختيار الملف، أو عن طريق سحب وإسقاط الملف إلى فيجي.
  3. اختيار الخيارات التالية؛
    1. كومة المشاهدة: مشاهدة كومة مع Hyperstack،
    2. خيارات الألوان: وضع اللون الملونة،
    3. قنوات تنقسم إلى نوافذ منفصلة: قنوات سبليت (RGB لكل لون القناة التي تم تسجيلها سيتم فتح نافذة منفصلة).
  4. في حالة سلسلة الصورة لاستخدامه، تحميل سلسلة لفيجي من خلال الذهاب الى "ملف"، "استيراد"، "تسلسل الصور" واختيار أي ملف صورة في المجلد الذي يحتوي على سلسلة صورة الهدف.
    1. مجموعة الفلاتر والظروف لتحميل الصور المختارة في هذه السلسلة، على سبيل المثال؛
      1. عدد الصور: كم هي إطارات ليتم تحميلها.
      2. بدءا الصورة: الصورة التي هو الإطار الانطلاق في هذه السلسلة.
      3. زيادة: الزيادة بينإطارات ليتم تحميلها (كل إطار، كل الإطار الثاني، الخ).
      4. اسم الملف يحتوي على: ترشيح لقناة معينة باستخدام اسم الملف (على سبيل المثال من خلال وضع "C001"، والذي هو عادة كيف وصفت الصور من "القناة 1" بعد فصل ألوان متعددة من الفيديو في الوقت الفاصل بين).
  5. إزالة القشور عن طريق الذهاب إلى "تحليل"، "تعيين نطاق ..."، والتحقق من مربع "جلوبل" والنقر على "انقر لإزالة نطاق".
    ملاحظة: هذه الخطوة تتيح تحليل بكسل على أساس من الصور في حال استخدمت تكبير مختلفة لمختلف مجموعات التجريبية التي سيتم تقييمها. إذا كانت دائما الاحتفاظ إعدادات التكبير المستمر وتم استيراد ملف المجهر الأم مباشرة إلى فيجي، وهذه الخطوة يمكن تخطي، وفيجي يمكن فهم واستخدام التكبير وحجم البيانات الوصفية من ملف المجهر.
  6. إعداد معلمة القياسق عن طريق الذهاب إلى "تحليل"، "مجموعة القياسات" والتحقق من المربعات التالية: "المنطقة"، "الانحراف المعياري"، "الكثافة المتكاملة"، "تسمية العرض" و "متوسط ​​القيمة الرمادية".
  7. إعادة توجيه إلى قناة اللون الذي يحتوي على إشارة من مسبار التي سيتم قياسها والتأكد من صحة مع "موافق".
  8. انتقل إلى الإطار الذي والقياسات لتكون بدأت وحدد الإطار قناة BF بالضغط على الحافة العلوية من النافذة.
  9. استخدام "أداة التحديد البيضاوي" لتحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI)، أي العائد على الاستثمار التعميم على حبة المنضوية. ضمان أن اختيار يتم تركيبها بإحكام على الحافة الخارجية للحبة كما مرئية في قناة BF.
    ملاحظة: عند استخدام جهاز كمبيوتر، مع الاستمرار على مفتاح Shift أثناء باستخدام أداة التحديد لضمان العائد على الاستثمار دائرية.
  10. بدء القياس على النحو الأمثل إطارات قليلة قبل الغمر الكامل للحبة اكتمال ولاحظالإطار الذي يتم تشكيل تشكيلها بالكامل الوليدة حبة يبلوع ويتم إغلاق كوب البلعمية. هذا ينبغي أن يكون نسبيا ملحوظ بوضوح في قناة BF.
  11. انتقل إلى "تحليل" وانقر على "قياس" لتنفيذ القياس، وسيتم عرض النتيجة في نافذة منفصلة بعنوان "نتائج".
  12. انتقل إلى الإطار التالي، وضبط الموقف من العائد على الاستثمار في حال انتقلت حبة، وتكرار القياس. سيتم إضافة النتيجة إلى القائمة في إطار النتيجة، ويمكن تحديد كل إطار تحليلها على أساس القيمة في العمود "تسمية".
    ملاحظة: استخدام مفاتيح الاختصار (على سبيل المثال "M" لقياس) يمكن تسريع كبيرة في عملية التقييم، وانظر قائمة الاختصارات وتعيين تلك زي ضمن القائمة "الإضافات".
  13. بعد الانتهاء من قياس جميع الأطر ذات الصلة، والنتائج التي يمكن نسخها إلى تطبيق جدول بيانات مثل مايكروسوفت إكسل. عمود "IntDen" يصور intensitieق من المنطقة المحددة في القناة أن قياس تم توجيهه إلى.

8. تصحيح تبيض

اعتمادا على التحقيق المستخدمة وإعدادات التصوير، قد تحدث الصورة تبيض. اعتمادا على مداه، وهذا يمكن أن يؤثر بشدة على نتائج التقييم. ومع ذلك، وهذا التأثير يمكن تصحيحه جزئيا من خلال تطبيق معدل متساوية ولكن العكس من تغيير في القيم المقاسة. إذا كان موجودا، ويمكن حساب معامل الصورة تبيض عن طريق قياس انخفاض تعتمد على الوقت كثافة إشارة في الإطار كله، أو المساحة المزروعة خصيصا من الإطار، وخلال الفترة الزمنية ذات الصلة لتحليل كل يبلوع. وصفت هذه العملية في أرقام 3 و 4.

  1. تحت "الإضافات" القائمة في فيجي، واستخدام "محلل السلاسل الزمنية" في المكونات لتحديد انخفاض عام في كل إطار، أو العائد على الاستثمار محددة كثافة إشارة المسبار على مر الزمن (الشكل 3).
    ملاحظة: السلسلة الزمنية محلل في المكونات هو متاح للتحميل في http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ، في حالة عدم وجود بالفعل في قائمة الإضافات.
  2. مؤامرة ضد قياس الوقت (بالثواني) في MS Excel، فقط للإطارات التي تتوافق مع إطارات من يبلوع تحليلها.
  3. تطبيق خط الاتجاه الخطي (الشكل 4A) في المؤامرة؛ منحدر سلبي للإشارة خفض يدل على وجود تأثير تبيض الصورة.
  4. تطبيق المنحدر إلى عكس القيم من يبلوع تحليل (أرقام 4B و 4C): تصحيح كثافة إشارة (SI) = الخام SI + (الوقت بالثواني * عكس المنحدر)

ملاحظة: ستكون كل واحدة يبلوع تحليل لها فترة زمنية محددة (ابتداء من الساعة كاملة إطار امتصاص) أثناء تسجيل الفيلم مرور الزمن، والصور bleacيجب أن يكون حساب هينج لفترة محددة والتي سوف تكون صالحة فقط لتصحيح القيم المقاسة من أن يبلوع محددة.

9. تقييم البيانات

  1. جمع البيانات وحساب متوسط ​​والإحصائية الخطأ من القيم لتصحيح تبيض في مجال البرمجيات المناسبة.
  2. رسم البيانات تقييمها في شكل مناسب.

ملاحظة: هنا، فإن الإحصاءات العلمية والبرمجيات بالتآمر GraphPad بريزم ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ كانت تستخدم). برامج المنشور قادرة على توليد ورسم منحنى متوسط ​​مع مؤشرات الخطأ المقابلة طالما لديك كل البيانات نفس معدل الإطار (أي تم الحصول عليها مع كل نفس في فترات، مثل إطار واحد كل 10 ثانية).

ملاحظة: الاختلافات واسعة من القيم SI المطلق في غضون يكرر نفس experimسوف أعرض مجموعة والأنف والحنجرة الخطأ إحصائية كبيرة جدا وتقديم البيانات غير صالحة للاستعمال. وهذا يمكن أن يكون عليه الحال إذا كان البروتوكول، وإعدادات مثل التصوير، لا يتم عقد متطابقة تماما بين تكرار تجربة مختلفة التي سيتم جمعها.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

يظهر إعداد الصحيح للخلايا والخرز لتصوير أمر بالغ الأهمية. الشكل 1 مخطط البذر، التحقيق التحميل والخطوات التصوير الأولي في هذا الأسلوب، استنادا لدينا بروتوكول الأمثل لBMMs. فمن الضروري إذن أن المعلمات بروتوكول يتم اختبارها والأمثل اعتمادا على نوع من الخلايا وتحقيقات التي سيتم استخدامها.

بعد إضافة حبات مفتش المغلفة للخلايا مسبقة، من المهم أن مجال الرؤية يتم اختيار بطريقة لتوفير أكبر عدد من الأحداث المحتملة في امتصاص أكبر عدد ممكن من الخلايا، مع الحفاظ على الإعداد التكبير مسبقا من البروتوكول. كما هو مبين في الشكل 2، ويمكن هذا النهج لتوفير عدد أكبر من phagosomes للتحليل في كل الفيديو في الوقت الفاصل بين. بالإضافة إلى زيادة نقاط البيانات في العائد الفيديو من كل مجموعة التجربة، وهذا يقلل من الاختلاف الذي عرضته periphe متفاوتةشروط راؤول ويزيد من متانة البيانات.

فمن المستحسن أن الإجراء قياس إشارة الجمعيات (الشكل 2) أن يقوم بها الشخص نفسه وبطريقة عمياء إذا كان ذلك ممكنا. هذا يمكن أن يساعد على تقليل الخطأ من خلال القضاء على مصادر متعددة من الأخطاء الشخصية والحد من التحيز، والعائد على الاستثمار المخصصة لكل يبلوع هي التي سيتم اختيارها ونقلها يدويا بعد كل إطار.

بينما من الطبيعي أن قاعدة "كلما زاد حجم العينة، كان ذلك أفضل" ينطبق هنا أيضا، أن نتجنب تقييم أكثر من 5 حبة يبلوع لكل خلية في مجال الرؤية لمنع إعطاء الكثير من الوزن لخلية واحدة كما سلوك جميع الخلايا داخل نفس الثقافة ليست بالضرورة متجانسة 19. وينبغي اختيار هذه phagosomes عشوائيا بقدر الإمكان. في هذا السياق، المعلمات مثل phagosomes كونها واضحة تماما في المستوى البؤري طوال مدة التصوير، وكذلك عدمتتأثر المفرط تبيض الصورة ضرورية. علاوة على ذلك، uptaking عدد كبير من الجزيئات الكبيرة من قبل خلية واحدة يمكن أن تؤثر على ديناميات الانصهار لphagosomes في تلك الخلية، لذلك ينبغي أن تعطى الأولوية لphagosomes التي uptaken في عملية في وقت سابق من قبل نسبيا "خلية فارغة". كقاعدة عامة، ينبغي للقياسات متوسط ​​من خمسة على الأقل من الخلايا تصل إلى خمس تجارب مستقلة (وبالتالي، ما يصل إلى 25 phagosomes) توفر دلالة إحصائية جيدة.

تطبيق تحليل السلاسل الزمنية أو طريقة مماثلة للكشف عن احتمال تأثير الصورة تبيض (الشكل 3) مهم جدا، حيث أن بعض المجسات سيعانون من تبيض قوية جدا في حين أن بعض-الصورة مستقرة. يجب فقط تطبيق تصحيح الصورة الخطوة تبيض (الشكل 4) إذا لوحظ تأثير التبييض قوية في جميع التجارب مع نفس التحقيق. لا بد من الإشارة إلى أن هذه العملية لا يمكن إلا الصحيح جزئياتأثير التبييض. الأهم من ذلك، تبيض المفرطة في حالات قليلة فقط يمكن أن يكون علامة على الظروف nonoptimal، مثل الإثارة خاطئ أو إعدادات التصوير والمتوسطة خاطئ ودرجة الحموضة، وخلايا غير صحية، أو الكواشف nonfresh.

في الشكل 5C، أشار حبة يبلوع مع السهم في الشكل و5A في الشكل 5B، ويتم تحليل ويتم رسم Dex70kD كثافة إشارة (SI) لجمعية تستحق يبلوع خلال فترة من 90 دقيقة. مصدر الضوضاء في منحنى هو الإطار إلى الإطار الاختلافات في إشارة يقاس بسبب عوامل مثل عرقلة يبلوع تحليلها من قبل الآخرين ويبلوع البؤري التقلبات. ومع ذلك، فإن الاتجاه الزماني للجمعية إشارة إلى يبلوع واضح بسهولة. بعد التحليل المتوسط ​​من 10 phagosomes من اثنين من الخلايا المرئية في الشكل 5A، منحنى متوسط ​​يمكن رسم (الشكل 5D) التي البريد الإحصائيةrror يمكن رسم كما الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) أو الانحراف المعياري (SD) اعتمادا على حجم العينة والظروف التجريبية. في حين أن القيم SI المطلقة لمنحنى متوسط ​​يختلف عادة من أن أي واحد يبلوع تحليلها، فإن الاتجاه الزمني هو عادة مشابهة جدا. بعد التحليل، يمكن الاستنتاج أن تسليم البضائع Dex70kD كما الليزوزومية اللمعية إلى حبة phagosomes في BMMs النوع البري وصلت إلى هضبة داخل 35-40 دقيقة بعد البلعمة.

وبالتالي، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة لدراسة تأثير نوعي أو كمي لعوامل مختلفة على عملية نضوج يبلوع.

الشكل 1
الشكل 1. إعداد الخلايا للتصوير. هي المصنفة معد مسبقا BMMs في قاع الطبق الزجاج لا يقل عن 12 ساعة قبل الجمعمن ديكستران، يضاف محلول ديكستران في المتوسط ​​20 في تركيز ميكروغرام / مل والمحتضنة لمدة 2-8 ساعة (تحميل)، يتم غسل الخلايا، يتم إضافة المتوسطة الطازجة ويتم تحضين الخلايا لمدة 4 ساعة على الأقل (مطاردة)، والخلايا هي غسلها مرة أخرى ويتم إضافة تعليق حبة فقط قبل بدء التصوير. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 2
الشكل 2. خطوة خطوة تعليمات لتحليل الصور. بعد تحميل الفيديو في الوقت الفاصل بين أو تسلسل الصور في قنوات مختلفة في فيجي، يتبع التقييم في هذه الخطوات (لاحظ أن هذا الرقم يصور الكولاج الصورة وليس كل النوافذ المعروضة هنا ستبقى مفتوحة في وقت واحد ). (أ) تحت عنوان "تحليل" القائمة، بكسل لتتم إعادة تعيين القياس عن بعد في حالة البيانات الفوقية من الصور ليست متاحة لفيجي، تكبير مختلفة تم استخدامها سابقا في فيجي أو التسجيلات مرور الزمن هي في تكبير مختلفة، عن طريق الذهاب الى (ب) "تعيين مقياس"، ( ج) بوضع علامة في الخانة "جلوبل" التي ينطبق عليها إعادة تعيين جميع سلسلة صورة تحميل في وقت لاحق والنقر على "انقر لإزالة مقياس". (د) تأكد من أن كلا من حقل مشرق (BF) قناة صورة سلسلة (حيث حبة phagosomes هي واضحة للعيان) والقناة التي تحتوي على إشارة التحقيق يتم تحميلها ويكون بالضبط نفس الإطار التهم وأبعاد بكسل، على سبيل المثال. سلسلتين من كل 400 الإطارات مع 450 X 450 بكسل الأبعاد. (ه) تحت عنوان "تحليل" القائمة، المعلمات التقييم يمكن تعيين تحت عنوان "القياسات مجموعة"، حيث "المساحة"، "الكثافة المتكاملة" والمعلمات "تسمية العرض" يجب أن يكون محددا. (و (ز) وهذا يضمن قياس كثافة الحمراء قناة في نفس المنطقة ذات الاهتمام (ROI) التي دلت على ذلك الخط المنقط والسهم الأبيض في الحمراء القناة. يتم تحديد العائد على الاستثمار التعميم في قناة BF باستخدام "البيضاوي" أداة التحديد. (ح) بدء قياس تحت عنوان "تحليل"، "قياس" أو باستخدام الأمر الاختصار، وتكرار لكل إطار سلسلة كاملة لمدة المرجوة من التجربة (على سبيل المثال 90 دقيقة). في كل إطار، نقل وتعديل الموقع العائد على الاستثمار إلى حبة يبلوع من الاهتمام ونلاحظ أن الذهاب إلى الإطار التالي في سلسلة BF وإعطاء "قياس" القيادة تلقائيا يقيس العائد على الاستثمار في إطار المقابلة من القناة الحمراء. (ط) نتائج القياسسوف تظهر قائمة في "نتائج" نافذة. تحت العمود "تسمية"، يتم التعرف على الإطار المحدد لكل خط واضح، واستخدام هذه للتحقق من القياس المتكرر لإطار واحد أو تخطي إطارات في صورة سلسلة طويلة. (ي) "IntDen" قصيرة لكثافة متكامل هو معلمة الإخراج الحرجة؛ نسخ على الأقل التسمية و"IntDen" القيم إلى ورقة MS Excel إلى الاستمرار في التقييم. وحدة من قيمة IntDen هو غير معروف وأشارت وحدات التعسفي (الاتحاد الافريقي)، وهذا لا يخلق أي مشاكل طالما يتم اتباع بروتوكولات صارمة. شريط النطاق هو 10 ميكرون. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 3
الرقم 3. تحليل الصورة تبيض.60؛ (أ) صورة سلسلة مفتوحة في قناة المصالح وتأكد من تمت إزالة نطاق وإذا لزم الأمر، (ب) تحت "الإضافات" القائمة فوق (ج) "السلاسل الزمنية محلل". (د) باستخدام أداة التحديد مستطيلة، رسم مستطيل ROI تغطي تقريبا الإطار كله، أو على الأقل الخلية بأكملها من الفائدة لكامل مدة الفيلم، (ه) إضافة ROI المحدد، (و) انقر على "احصل على متوسط "سيتم عرض و (ز) نتائج في" الوقت يتتبع "الجدول و" الوقت يتتبع متوسط ​​"المؤامرة. لكن لاحظ أن يتم رسم على (متوسط ​​الكثافة) قيمة "متوسط" فقط ضد عدد الإطار وليس "IntDen" القيمة. (ح) تحت عنوان "تحليل" القائمة، تشغيل "قياس" دون تغيير أي معايير أخرى، لقياس "IntDen" لنفس العائد على الاستثمار بالضبط في نفس الإطار. هذا وسوف توفر ما يعادل عنيكثافة في "IntDen"، استخدم هذه القيمة لحساب عامل التحويل (يساوي "المنطقة") ورسم "IntDen" من العائد على الاستثمار لكامل الإطار مع الزمن بالثواني في MS Excel. (ي) انقر على "قائمة"، نسخ قائمة القيم إلى ورقة إكسل وتحويل جميع "يعني" القيم "IntDen" القيم. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 4
الشكل 4. تصحيح الصورة تبيض. اعتمادا على التحقيق المستخدمة وإعدادات التصوير، قد تحدث الصورة تبيض. وهذا يمكن أن يؤثر بشدة على نتائج التقييم. أ) يتم رسم القيم IntDen الخام (في الاتحاد الافريقي) لجنة التحقيق من الإطار كله ضد الزمن بالثواني في MS Excel. إضافة الخطيةيتم تعويض يشير إلى وجود ميل سلبي بشكل واضح وجود تأثير تبيض الصورة B) وكمثال على ذلك، وتطبيق اندلق على عكس IntDen الخام باستخدام الصيغة تصحيح عوائد القيم IntDen في IntDen تصحيح C) تصحيح جزئيا ل؛ خط الاتجاه. تأثير الصورة تبيض. اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الرقم 5
الرقم 5. عرض ممثل الخلايا، حركية والمتوسط ​​للإشارة تصحيحها. A) BMMs محملة التحقيق ديكستران في دقيقة 0 على امتصاص حبة مفتش المغلفة يشير إليه السهم. شريط النطاق هو 10 ميكرون. يتوافق مع فيلم 1 B) التكبير 2.5X إدراج من فيلم مرور الزمن، والتي تصور يبلوع أشارت وعلى مدى 85 دقيقة بعد امتصاص، الملونة كاذبة لتحسين الرؤية مع "ثال" الجدول نظرة الهاتفي (طرفية) في ImageJ. يشار إلى يبلوع ROI قياس مع خط متقطع الأبيض. يشار إلى حالات التسليم ديكستران وتراكم في يبلوع مع السهام البيضاء. C) تصحيح إشارة مضان تكساس الأحمر ديكستران 70kDa تسليمها من الجسيمات الحالة إلى يبلوع المشار إليه. D) وبلغ متوسط ​​قيم مضان IntDen من 10 phagosomes في غضون شهرين الخلايا المشار ± SEM . اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في المقطع التالي سوف نناقش الخطوات الحاسمة من طريقة عرض وحدوده. أبعد من ذلك، ونحن سوف تواصل بعض المشاكل الشائعة مع حلولها، وإدخال التعديلات الممكنة والنظر في مزايا أسلوبنا فضلا عن أساليب تكميلية مناسبة لهذا النهج.

إعداد حبات، بما في ذلك اقتران مفتش على سطح حبة، أمر بالغ الأهمية، وينبغي تجنب استعمال مستحضرات أونفريش. في الإضافات إلى ذلك، فإنه أمر بالغ الأهمية أيضا أن يتم إعداد ديكستران من الأسهم المجمدة (المخفف وتعقيمها) طازجة قبل كل تجربة. من المهم أن التحميل من ديكستران يلي جدول زمني دقيق لتحقيق الاتساق في امتصاص الخلوية وتوزيع المقصورة والتراكم. بالإضافة إلى ذلك، من المهم أن تستخدم ليس فقط نفس الإعداد المجهر وإعدادات البرامج، ولكن أيضا للحفاظ على الظروف المحيطية ثابتة قدر الإمكان (مثل الشركة المصرية للاتصالاتmperature، CO 2، والرطوبة، وتقنية حبة بالإضافة إلى ذلك، الخ). النقطة الحرجة آخر هو اختيار مجال الرؤية أو خلية من الفائدة، يجب مستكشف العينة قبل بدء التصوير من أجل اختيار الخلايا التي هي ممثل.

واحدة من القيود الرئيسية من هذه الطريقة عدد من التجارب اللازمة لانتاج أحجام عينات كبيرة. الطريقة الموصوفة حان الوقت نسبيا والعمل المكثف، منذ عدد من phagosomes الملحوظة في حقل واحد للعرض، اعتمادا على قرار اختياره، محدودة. تجميع نتائج عدد منخفض جدا من phagosomes اختيارها عشوائيا ينطوي على خطر أن بعض القيم المتطرفة تطرفا يمكن أن يكون لها تأثير بارز على القيم المتوسط. سوف عينة أكبر الأحجام من ناحية أخرى تمكن من اخفاء يبلوع إلى يبلوع أو خلية الى خلية الاختلافات.

المشاكل الشائعة التي قد تحدث تشمل التلوث، وعدم البلعمة وتبيض المفرطة والصورةتأثير سمية بسبب ضوء الليزر.

العقم، والتخزين السليم وإعداد ديكستران حاسمة لتجنب التلوث. في تجربتنا، لا ينبغي النظر في ديكستران شراؤها كحل العقيمة. خطر التلوث عينة يمكن الحد بشكل كبير عن طريق الطرد المركزي واسعة من الأسهم والترشيح العقيمة الحل ديكستران المخففة. من ناحية أخرى، وإعداد العادية للتعليق حبة الطازجة، والتي تحتوي على البروتينات وعرضة للالتلوث، ويمكن أيضا أن يقلل من خطر التلوث.

نقص أو انخفاض مستويات البلعمة قد يكون عائدا لالأمثل مفتش طلاء من الخرز. وبالتالي، فإنه من المهم لإعداد مكونات لاقتران مفتش من حبة (مفتش الحل، EDAC) طازجة وعدم استخدام الخرز التي هي أكثر من 4 أسابيع من العمر أم لا ظلت حصرا على 4 درجات مئوية. منذ وو sonicated حبات لفترة وجيزة قبل الاستخدام، فمن المستحسن أن يعدمأخوذة العمل لتجنب صوتنة المتكررة لتعليق الأسهم. سبب آخر لأقل من الأداء المتوقع أكلة يمكن أن يكون غير صحي، مثقف الحالات النادرة أو الخلايا القديمة، وبالتالي الالتزام الصارم لشروط الثقافة الموصى بها لنوع من الخلايا تستخدم أمر ضروري. على سبيل المثال، يمكن أن trypsinization المفرطة أثناء الحصاد تضر مستقبلات سطح البلعمية ويضعف قدرة البلعمة.

قد يكون مبالغا فيه الصورة تبيض مشكلة كبرى مع بعض fluorophores. ضبط إعدادات المجهر، أي شدة الضوء الإثارة ومدة التعرض العينة، وفقا لقابلية تبيض من fluorophore يساعد على التحكم في التبييض. فيما يتعلق الفاصل الزمني بين عمليات الاستحواذ من الأطر المتعاقبة، والتوازن بين معدل الإطار، والتي على تردد أعلى ينص القرار الزماني أعلى والوحي أفضل للديناميات التفاعل مهم، وتبيض من لجنة التحقيق قد رس وتوجيهه. التوازن الأمثل يعتمد بالدرجة الأولى على المسائل التي سيتم تناولها في تجربة معينة. ضبط دقة المسح الضوئي، وتردد مسح خط أو الإطار المتوسط ​​تمثل الإعدادات التي يمكن تغييرها لزيادة الاستخدام الأمثل للمدة التعرض العينة إلى ضوء الإثارة. ومع ذلك يتم تحديد توافر بعض هذه الخيارات حسب نوع النظام المجهر الذي يتم استخدامه.

ينبغي اتباع نفس المبادئ التوجيهية العامة للحد من تأثير الصورة السامة من ضوء الليزر الإثارة على الخلايا. هذا التأثير يمكن أن تتجلى كما فاة الخلايا المعرضة لضوء الليزر أثناء التصوير أو زيادة ملحوظة في الأشكال التضاريسية غير طبيعية 20.

نحن هنا قدمنا ​​الطريقة الأساسية والعامة، والذي يسمح للتعديلات والتكيف مع إعدادات التجريبية المختلفة. كما ذكر، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم لفقدان وظيفة من الدراسات مثل نماذج خروج المغلوب،ضربة قاضية الجين أو البروتين متحولة التعبير. كما يسمح لاستراتيجيات مختلفة لاستهداف طهاية مستقبلات أكلة معينة، واستخدام مختلف تحقيقات endosomal / الليزوزومية فضلا عن دراسة مثبطات الكيميائية أو السيتوكينات.

يمكن التعبير على الدراسات مع مختلف البروتينات الفلورية والانصهار المسوخ التي يمكن استخدامها لتحقيق الآثار على تسليم تحقيقا المناسبة لphagosomes. وعلاوة على ذلك حركية وديناميكية التفاعل بين البروتين نفسه مع phagosomes يمكن تحليلها. هناك عدة تحقيقات المتاحة التي يمكن استخدامها لهذه الأغراض. ومن الأمثلة البارزة من الدرجة المشتركة للتحقيقات تشمل مجموعة من الأصباغ LysoTracker acidotropic، والتي تستخدم على نطاق واسع لتعقب التجويف أيون الهيدروجين الموجب من المقصورات endosomal فضلا عن التجويف phagosomal. طلاء من الخرز يقدم العديد من الاحتمالات أخرى. بروابط، بما في ذلك الأحماض النووية مثل المواقع الدليل السياسي الشامل محددة من الحمض النووي البكتيري 21، البكتيريامكونات سطح الريال مثل LPS، والبروتينات مثل أفيدين، والبروتينات في الدم بما في ذلك العوامل المتممة (مثل C1q أو iC3b) جميع يمكن عبور مرتبطة الخرز 22-24. وهذا يسمح للدراسة دور هذه بروابط في البلعمة ويبلوع النضج. باستخدام إشارات الجزيئات وسطاء المناعي (على سبيل المثال السيتوكينات) فتح مجموعة أخرى من الاحتمالات.

أخيرا، يمكن أيضا أن هذا الأسلوب يمكن توسيعها وتكييفها لإجراء دراسات مباشرة مع الكائنات الحية الدقيقة، على سبيل المثال من خلال مقارنة امتصاص مقابل الحية المسببة للأمراض أو قتل مقابل بكتيريا غير إمراضية، على الرغم من أن شكل غير منتظم من البكتيريا تحديات جديدة خلال تحليل الصور.

التطبيقات المستقبلية لهذه الطريقة هي متعددة مثل التعديلات التي يمكن تطبيقها. كخطوة تالية، يمكن تكييفها أساليب التحليل نسبة متري. مزيج من درجة الحموضة ودرجة الحموضة حساسة وغير حساسة الأصباغ الفلورية للحبة طلاء، أو الاستفادة من تحقيقات واحد لالاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافتتوفر لدى عودتهم phagosomal 25-31 درجة الحموضة (مثل pHrodo، FluoProbes) وكذلك المركبات التي تجعل من الممكن لمتابعة تجريبيا حركية من البروتين والدهون تدهور داخل يبلوع (على سبيل المثال OVA، HRP، ألبومين المصل البقري وركائز الليباز الدهون الثلاثية). هذه معا تجعل من الممكن إقامة عدد كبير من نهج التحقيق استنادا إلى الطريقة الأساسية لتصوير الخلايا الحية من phagosomes المقدمة هنا.

الطريقة الموصوفة يمكن تحقيق قرارات الزمانية أعلى بكثير بالمقارنة مع النهج التي تقوم على عزل يبلوع 32. ELISA أو البقعة الغربية تحليلات phagosomes يمكن أن تمثل أعداد كبيرة جدا من الأحداث في نقاط معينة الوقت، ولكن تمثيل البيانات يبلغ عدد سكانها أكثر بكثير غير متجانسة ويحتمل أن تكون غير المتزامنة للأحداث. التدفق الخلوي النهج القائمة تسمح نظريا التحليل وصولا الى مستوى الخلايا الفردية، وبهذه الطريقة قد تكون أقل عرضة للheterogeneiتاي من السكان الخلية ولكن مشكلة مماثلة التزامن غير مؤكدة وضرورة التهم الحدث عالية جدا لتقييم موثوق بها لا تزال قائمة. ومع ذلك، فإن إنتاجية عالية، وحساسية واستنساخ النهج تدفق الخلوي 33،34 جعلها عنصرا مكملا الأمثل لنهج التصوير الخلية الحية.

أخذت معا، والاستفادة من أسلوب لدينا تكمن في الدقة وعالية الاستبانة الزمنية التي phagosomes واحدة يمكن اتباعها في عملية نضوج في الخلايا الحية. مقارنة لجميع المناهج الأخرى التي تحد من الملاحظات إلى نقاط زمنية أقل، في الخلايا غير قابل للحياة وسابقة التجهيز، فمن الممكن هنا لمتابعة الأحداث الخلوية حيوي ومستمر على مدى فترات طويلة من الزمن في ظل الظروف الفسيولوجية للتعديل بسهولة. يمكن للمرء تحديد الأحداث نسبة إلى الإقبال على البضائع البلعمية، والذي يسمح تمييز من مراحل البلعمة على نحو أدق. بهذه الطريقة، والتزامن يتيح ليست ستصور نلي سلوك مماثل من phagosomes، بل يسمح أيضا تحديد الفروق الفردية بسبب مثل خلية الى خلية الاختلافات. الأهم من ذلك، ديناميكية التفاعلات التي قد تحمل مفتاح لفهم التفاعلات المعقدة يمكن أن تكون مضيئة بشكل فعال في القرار الزمانية عالية باستخدام نهجنا التصوير الخلية الحية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

نشكر أعضاء مختبر علم الأحياء يبلوع لقراءة نقدية للمخطوطة. ويدعم هذا العمل من خلال منحة هيلمهولتز يونغ محقق (مبادرة وصناديق شبكات للجمعية هيلمهولتز) وبرنامج منح الأولوية SPP1580 مجلس البحوث الألمانية (الألمانية للبحوث، DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) PAA, Austria E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) PAA, Austria E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA, Austria A15-151
L-Glutamine PAA, Austria M11-004
PBS PAA, Austria H15-002
Penicillin/Streptomycin PAA, Austria P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) WillCo Wells, Netherlands GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm Greiner Bio one, Germany 627871 Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres Polysciences, USA #09850 Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles Kisker Biotech, Germany PPs-3.0COOH
Triton-X 100 ROTH, Germany 305.1.3
mouse whole IgG Rockland, USA 010-0102
EDAC crosslinker Sigma-Aldrich, USA E6383-1g
10 mM Tris Sigma-Aldrich,USA T1503
1-ml syringe Omnifix -F B.Braun, Germany 9161406V
26 G needle (0.45*25 mm) B.Baun, Germany 4657683
RPMI 1640 PAA, Austria E15-039
Horse Serum Gibco, USA 16050-122
MES hydrate Sigma-Aldrich, USA M2933
0.2 μM syringe mounted filter Sartorius, Germany 83.1826.001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
  2. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
  3. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  4. Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
  5. Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  7. Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
  8. Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
  9. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  10. Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
  11. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
  12. Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
  13. Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
  14. de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
  15. Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
  16. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  17. Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
  18. Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
  19. Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
  20. Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
  21. Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
  22. Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
  23. Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
  24. Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
  25. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
  26. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
  27. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
  28. Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  29. Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
  30. Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
  31. Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).
  32. Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
  33. Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  34. Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).

Tags

علم المناعة، العدد 85، يحلول، يبلوع، يحلول يبلوعي، والتصوير الخلية الحية، البالعات، الضامة
دراسة يحلول يبلوعي النشوء الأحيائي في الضامة لايف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bronietzki, M., Kasmapour, B.,… More

Bronietzki, M., Kasmapour, B., Gutierrez, M. G. Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages. J. Vis. Exp. (85), e51201, doi:10.3791/51201 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter