Abstract
吞噬细胞去除和消除其吞噬体入侵的微生物发挥先天免疫系统的重要作用。吞噬体成熟是复杂而严格监管的过程中，其中一个新兴的吞噬体通过与各种细胞器和车厢在细胞质中精心策划的互动经历了激烈的变革。这个过程，这是对吞噬细胞的吞噬体赋予其溶菌和杀菌性能的生理功能所必需的，高潮在融合吞噬体与溶酶体并且被认为是成熟为吞噬体的最后和关键的阶段吞噬溶酶体的生物合成。在这份报告中，我们描述了一个活细胞成像为基础的方法对溶酶体的动态过程的定性和定量分析，以吞噬小体内容交付，这是吞噬溶酶体生物发生的一个标志。这种方法使用IgG包被微珠作为一种模式phagocytosis和荧光标记的葡聚糖分子作为管腔溶酶体货物感，为了使用时间推移成像和激光扫描共聚焦显微镜遵循lysosmal含量的动态传递到吞噬体中实时直播巨噬细胞。在这里，我们详细描述了后台，准备步骤和一步一步的实验装置，以便在其他实验室容易和精确部署此方法。我们描述的方法很简单，功能强大，而且最重要的是，可以很容易地适应学习在不同的系统，并根据不同的实验设置，如利用各种吞噬细胞类型，功能丧失的实验，不同探头的吞噬体相互作用和成熟，以及吞噬颗粒。
Introduction
专业的吞噬细胞，包括巨噬细胞，发挥着关键的免疫系统。除了 作为防御的第一线中的先天免疫系统，它们也激活适应性免疫通过其信令和抗原中发挥关键作用呈递作用1-3。虽然专业吞噬细胞的功能是多方面的，吞噬体成熟是专业吞噬细胞4,5的杀菌和抗原处理功能的关键支柱。经受体介导的吞噬和吞噬靶，如细 菌的吸收，新生的吞噬体经过一个复杂的和精心策划的互动和交流与内吞网络的舱室和其他一些细胞器6的序列。所述化合物的性质交换与这些细胞的实体，以及调节和融合事件的定时决定了管腔吞噬体环境和phagosOMAL膜组成，因此7，成熟的吞噬体8的命运。
吞噬体成熟的生理意义是由各种细胞内的病原体采用从逃跑，逮捕或颠覆吞噬体成熟9多样化战略例证。大多数这些策略的直接或间接阻止吞噬体成熟过程的最后和关键的阶段：融合吞噬体与晚期胞内体/溶酶体区室，因而具有大量的水解酶和一个成熟的吞噬体7的抗菌因素，8,10。因此，这最后的和关键的一步分析，可以为我们提供强有力的指标有关的吞噬体的成熟的状态，如果自然的生理状态是正面或负面的根据正在使用的特定的实验设置的影响。
晚期内体/溶酶体S是通常被认为是内吞途径的终端室，通过各种存在的定义，并区别于早期的内吞车厢，特定阶段，标记分子。例如水解酶或膜成分，例如溶酶体相关膜蛋白（灯）等等11。终端内吞区室，此后简称为溶酶体，也可作为消化的最后阶段的主要位置处的吞噬/内吞途径12的端部。以这种方式，不易消化的探针可以通过内吞作用和巨胞饮作用从细胞外环境被加载，并通过内吞途径到溶酶体，在那里它下面定义的摄取和追逐的循环后累积13,14输送。荧光团共轭的探针，用于荧光显微镜，诸如有机聚合物的不易消化葡聚糖通常用作endocyticprobes 15-17。
14,18呈现。
按照我们的方法的描述，类似的实验，可以使用修改后的设置和因素，探讨其在吞噬体成熟的影响进行设计;几乎任何OT她的类型附着的初级或细胞系吞噬细胞，功能实验包括遗传损失基因敲除和敲除体，突变体或融合蛋白，吞噬靶，微珠涂覆化合物，核内体/溶酶体探针和因素，例如一个表达细胞因子，化学抑制剂，或siRNA等等都可以应用这种方法的基本方法的所有变量。
我们定义该方法的如下目标与基本要求：
- 目标的方法：启用直接，定量和定性的观察吞噬体成熟和分析生活中的吞噬细胞高时间分辨率。
- 吞噬货物：一个适当包衣微粒或生物靶标。在这里，我们用IgG包被通过的Fc-γ受体介导的吞噬作用容易内化3微米的球形聚苯乙烯微粒。另外，任何微生物或涂层麦克风可用于roparticle为其中吞噬受体是存在于细胞中。
- 吞噬细胞：表达适当的吞噬受体粘附吞噬细胞。在这里，我们用鼠标主要桥梁养护管理的丰富表达的Fc-γ受体。可替换地，树突状细胞（DC），单核细胞或吞噬上皮细胞或其遗传突变或敲除变体也可以使用。
- 溶酶体货物：一个荧光标记的溶酶体探针。这里，德克萨斯红偶联70000千道尔顿的葡聚糖（Dex70kD）用作溶酶体的腔货物。可替换地，一个细胞区室或细胞器，或用于吞噬体性能如酸度或降解能力的适当的探针的任何荧光检测的标志物，可用于研究吞噬体成熟的进展。
- 影响因素：例如，信号分子，化合物，基因敲下来，或突变蛋白可能的瞬时表达。在这里，我们已经锻件1使用这样的一个因素为简单起见，但对于最近的一个例子与突变体蛋白的表达和敲低影响因素请参阅Kasmapour 等人 18，可以影响细胞吞噬吞噬体或情况和迁移率和/不限因子或与吞噬体成熟交互的车厢可能被使用。
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Protocol
在这个协议的动物保健和所有程序遵循的制度和国家指导方针。
准备是由“Π型”预先指示的准备工作。
1。桥梁养护管理的制备
- 颈椎脱位进行小鼠的扑杀。
- 从组织中取出股骨和胫骨，免费骨骼和修剪两端的骨髓的可访问性。
- 保持骨骼在冰冷的PBS或冰冷的DMEM培养基（补充有100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素，置于冰上，直到下一个步骤。
注 ：进行下一个二类生物安全柜下面的步骤，以尽量减少污染的风险。 - 用冷PBS +青霉素/使用26克（0.45mm）内针连接到1毫升注射器链霉素冲洗髓腔。
- 丸粒细胞通过温和离心分离，在350×g离心10分钟，沉淀重悬在BMM MED鎓和板块在无菌微生物未涂覆培养皿。
- 在BMM培养基的制备
- Dulbecco改良的Eagle培养基DMEM
- 10％灭活FCS
- 20％的小鼠成纤维L929细胞株培养上清（巨噬细胞集落刺激因子，M-CSF源）
- 5％马血清
- 2mM谷氨酰胺
- 在L929细胞系培养基的制备;
- RPMI（Roswell公园纪念研究所）1640
- 10％灭活FCS
- 2mM谷氨酰胺
- 的小鼠成纤维细胞L929细胞株培养上清准备;
- 汇合的L929细胞被分裂1:4，在175厘米培养2培养瓶中使用20毫升L929培养基和培养物上清液2天了48小时后收集，过滤并加入到BMM培养基
- 在BMM培养基的制备
- 从孵育冲洗细胞股骨在培养箱中在37℃下在5％CO 2气氛中。
- 每48小时培养的（最多72小时）后，吸出培养基并用新鲜BMM培养基更换，长达10天。超过95％的细胞呈阳性反应，CD14，流式细胞仪的测试。 CD14主要表达的巨噬细胞模式识别受体。通过测定细胞阳性该受体的百分比，已产生粘附桥梁养护的纯培养物。
注 ：准备和培养细胞相应地，如果其他细胞类型的使用。
2。微球作为吞噬货物的涂层
- 准备1毫升悬浮微珠，用400微升2.5％3微米羧基化聚苯乙烯微粒，或替代微粒。
- 转让珠悬浮液到1.5 ml离心管，洗3次，用PBS，加入100微升500毫米2 - （N-吗啉）乙烷ulfonic酸的钠盐，MES缓冲液，在pH 6.7到胎圈芯块。
- 溶于50微克小鼠IgG（多克隆IgG抗体）在50微升无菌DDH 2 O和添加到珠悬浮液。
- 填写停牌长达1毫升无菌DDH 2 O（450微升）。
- 孵育在旋转轮在室温15分钟，该溶液中。
- 准备EDAC交联物，N-（3 - 二甲基氨基丙基）-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐的10毫克/毫升的浓度，并添加14微升的悬浮液珠。
注意 ：EDAC交联的氨基酸的IgG组与小珠的表面上的羧基和促进IgG固定在胎圈表面上。这是珠吸收的关键，因此，溶液应新鲜配制。 - 孵育悬浮液在旋转的车轮1小时在室温下。
- 加14μl的EDAC交联物的孵育在一个旋转的车轮1小时在室温下将悬浮液。
- 离心悬浮液以10,000 xg在微量离心2分钟。
- 洗珠3倍于终止缓冲液（1％的Triton X-100在10mM Tris，pH值9.4），以停止该交联反应，通过再悬浮沉淀于终止缓冲液和纺丝溶液以10,000×g离心2分钟。
- 洗涤珠3次在PBS中重悬沉淀在1ml PBS中。
可选：准备30-50微升的分装。 - 存储IgG包被微珠悬浮液在4℃下不超过4周，绝不允许悬挂被冻结。
注意 ：防腐剂如叠氮化钠以0.02％的终浓度（重量/体积）可以加入到悬浮液中，以防止细菌的生长和污染。在这种情况下，其使用前的珠子洗涤必须执行，以避免防腐剂的细胞毒性作用。离心该悬浮液的等分试样以10,000×g离心2分钟，并通过重新洗珠悬浮于PBS中的沉淀。重复洗涤3次。
3。葡聚糖探针储备溶液的制备
- 溶解德克萨斯红70000千道尔顿的葡聚糖（Dex70kD）在PBS中于20毫克/毫升，并储存在-20℃下，按照制造商的说明。
注意 ：保持库存在-20℃可保存数月，或于4℃下几个星期，看厂家的文档。 - 通过在约1毫克/毫升它在完全DMEM细胞培养基中稀释（DMEM，10％FCS，2mM的L-谷氨酰胺）（几倍浓缩溶液将稀释至准备用于从库存的实验葡聚糖溶液的20微克/毫升加入到细胞之前最终工作浓度）。
- 使用超声水浴下超声葡聚糖等分试样5分钟使其均匀化溶液和溶解的聚集，可能以后导致工件生成成像期间。
- 离心机在最大克为5分钟，在微量离心从溶液中除去任何不溶团块或污染物。
- 小心地将上清液移至新管中，同时避免了沉淀在试管底部并稀释至20微克/毫升的完全DMEM细胞培养基中的最终工作浓度。
- 过滤灭菌使用0.2μm的注射器过滤器安装在该溶液中。
4。葡聚糖预压
- 种子细胞在活细胞成像玻璃底菜和孵育至少12小时（37℃，5％CO2气氛），以确保依恋和驯化。
注意 ：有，让每盘进行多个实验（最多四个车厢）可分割的玻璃底菜。 - 如在协议3的介绍准备葡聚糖的DMEM液。预热的DMEM溶液的制备葡聚糖，使用水浴在37℃。
- 吸介质次添加葡聚糖溶液至细胞小心和孵育在37℃，5％CO 2的气氛中2-8小时进行摄取。
注意 ：计划和优化的基础上，用于和重复实验时，严格保持此期间探针和细胞类型的协议。这是必不可少的，以便内吞途径的葡聚糖积累的轮廓，从而再现性的实验。 - 洗涤细胞3倍与预热的完全DMEM培养基，吸出培养基，并仔细冲洗细胞用新鲜培养基。
- 在5％CO 2气氛中培养细胞以完全DMEM培养基为4-12小时，在37℃。
- 用预热的完整过滤的无酚红的DMEM培养基洗细胞一次。
- 为了获得最佳的成像效果，改变成像开始之前预热完成滤波的无酚红的DMEM培养基中至少30分钟。酚红可能引起的荧光信号淬灭，增加背景噪声和从而降低图像的对比度和清晰度。
注意 ：设置显微镜和预先摄像设置，根据基于探针与细胞中所使用的类型预先计划的和优化的协议。
5。加入IgG包被磁珠
- 平衡的预先制备1％珠悬浮液至室温等分和超声处理在超声水浴2-3分钟。
- 加1-6微升1％的珠悬浮到下一个二类生物安全柜的完整的滤波无酚红DMEM培养基，以尽量减少污染（一个很好的起点浓度为1μL/ 2平方厘米的菜面）的风险。
注 ：此处桥梁养护接种在25,000个细胞/孔和6微升1％的库存珠悬浮液加入到培养基中的菜。这大致等于15:1珠/细胞的比例。的比例要调整到用于和胎圈材料的细胞的种类;岛Ë。乳胶珠具有密度低，不沉底很快，而聚苯乙烯珠下沉，并提出与贴壁细胞接触得更快，从而在更大的数字。
注：根据不同的实验，它可能是优势，选择将提前观察到的区域。珠悬浮液然后可以只添加到玻璃底菜的特定区域，因此增加观测有利的摄取事件的概率。 - 致密云的珠可以轻轻吹打悬浮液在玻璃底培养皿中扩散。
- 等到珠沉到玻璃底培养皿的底部和大致与所述贴壁吞噬细胞的同一平面上。
- 专注于感兴趣区（ROI）的区域，并启动时间推移成像。
注意 ：这可能是必要的微调焦点而成像过程中，根据所使用的成像系统，其站稳定性和所观察到的细胞的移动性。但是，请注意，这可能使不可能的，吞噬体的强烈的焦点偏离平面作为重新定位的结果的正确分析。
6。成像
按照下面的最佳成像质量的一般准则;
- 使用共焦成像系统，如激光扫描或旋转盘片的系统。
注 ：徕卡TCS SP5 AOBS激光扫描共聚焦显微镜的徕卡LAS AF软件控制，并配备了一个环境控制室使用这里的时间推移视频成像。 - 优化影像设置，如扫描速度，放大倍率，分辨率等 。的方式，以允许对一个帧的每7-20秒的速率，取决于所使用的系统。
注 ：在这里，一个200赫兹的扫描速度，扫描仪2倍变焦和2 - 3倍的512×512像素RESU分辨率的平均线lted在3-5秒/ RAME之间的录制时间。一帧中每10秒的速率来记录时间推移电影与至少120分钟的持续时间。 - 使用基于所使用的成像系统和探头（S）适当的激发/发射设置。
- 优化设置，以防止过度的光漂白。
注 ：在这里，德州红葡聚糖70KD很兴奋，使用半导体泵浦（561纳米）激光发射光由徕卡混合检测器（路政署）在600-650 nm的在610 nm处的发射峰检测。激光强度必须适应信号的强度，并保持尽可能低，以减少光致漂白的荧光基团（S）和所述激光对细胞照片毒性效应。通常，为了平衡扫描速度，行平均，扫描分辨率，帧间隔和成像的持续时间，以获得适当的和稳定的信号强度，并捕获珠吸收和吞噬体成熟亲的完整持续时间是很重要的塞斯。
- 优化设置，以防止过度的光漂白。
- 包括亮场（BF）信道用于观察珠子如果它们不共轭的荧光团。
注意 ：除了将德克萨斯红通道，BF通道被用于可视化的珠子，相同的DPSS激光器被用作光源和信号与一个光电倍增（PMT）检测器进行检测。
注意 ： 请确保采集数据要被整理时，套用相同的录制设置。最重要的参数是：激发激光强度，探测器的设置，采集设置，放大倍率和帧间隔。没有使用相同的帧间隔将需要一个曲线平均的步骤，因为观测数据点不重叠（例如整理的观察与收购在每7秒，另一组与帧画面，在每12秒帧）。这会增加所需的数据评估的步骤，而且需要用曲线平均功能的附加软件，如OriginLab'源流专业统计软件（ http://www.originlab.com/ ）。 - 最好，保存在用过的成像系统的本机文件格式的时间推移视频，并避免出口压缩格式。
注 ：在这里，时间推移电影被保存在本机徕卡LAS AF格式的文件，然后将其直接导入在斐济开（LIF）。斐济是能够从使用附带生物格式导入插件，在大多数显微镜制造商读取本机文件格式。以JPG或TIFF或作为一个AVI容器格式的视频文件导出时间推移电影文件中的图像序列是没有必要或建议。除了从原始观测保持最佳的图像质量，避免有损压缩算法（如JPEG），使用原生显微镜文件格式确保了该文件的元数据（时间标记，放大，激光和采集强度，探测器的设置等）保存并提供给斐济。但是，如果由于某种原因，时移视频文件需要分析不同的格式导出，确保使用未压缩的文件格式，如TIFF图像系列和独立的RGB颜色（红，绿，蓝）通道已经在这步骤，斐济往往不能成功地从其他颜色通道中导出的文件分开BF通道。此外，请务必保留原始显微镜的文件作为参考。
7。的时间推移电影分析
- 使用ImageJ的，斐济，或提供一个类似物信号关联分析能力的任何其他软件。
注 ：在这里，斐济被用于定时短片的分析。斐济是一个包含一个图像处理软件包与重组工具菜单和附加原生的插件，可在免费下载的ImageJ的分布http://fiji.sc 。在这个教派所描述的过程离子是描绘在图2中 。 - 点击“文件”，“打开”，然后选择该文件，或通过拖放文件到斐济打开斐济文件。
- 选择以下选项;
- 堆栈观看：查看堆栈与Hyperstack，
- 颜色选择：色彩模式彩色的，
- 拆分通道分离为单独的窗口：斯普利特通道（用于记录每个RGB颜色通道的一个单独的窗口将被打开）。
- 在情况下的图像系列是被使用，进入“文件”，“导入”，“图像序列”，然后选择包含目标图像序列文件夹中的所有图像文件加载一系列斐济。
- 设置过滤器，并在一系列装载选定的图像，例如条件;
- 图像的数目：多少帧将被加载。
- 启动图像：这形象是该系列中的起始帧。
- 增加：之间的增量帧被加载（每帧，每第二帧， 等等 ）。
- 文件名中包含：使用文件名（例如，通过设置“C001”，这是多么正常的“通道1”的图像分色多通道时间推移视频后，被标记）过滤特定的通道。
- 设置过滤器，并在一系列装载选定的图像，例如条件;
- 进入“分析”，“设置比例...”，选中复选框“环球”，然后点击“点击清除水垢”删除缩放。
注意 ：该步骤允许基于像素的不同放大倍率的已被用于各种试验台是要评估的情况下的图像的分析。如果放大率设置一直保持不变，原生显微镜的文件直接导入到斐济，这一步可以跳过，因为斐济能理解并使用从显微镜文件的元数据的放大倍率和规模的数据。 - 设置测量参数s由去“分析”，“设置测量”，并勾选下列方块：“区”，“标准偏差”，“集成密度”，“显示标签”和“平均灰度值”。
- 重定向到包含从探针是被测量并用“OK”信号的颜色通道。
- 去其中的测量是应该开始，并且通过点击窗口的上边缘选取BF通道窗口框架。
- 使用“椭圆选择工具”，选择感兴趣区域（ROI）， 即一个圆形的投资回报率的内在珠上。确保挑选紧紧地装到所述胎圈在BF通道为可见的外边缘。
注意 ：当使用一台PC，使用选择工具，以确保一个圆形的投资回报，同时按住Shift键。 - 开始测量优化胎圈的全部吞没前几帧完成并注意帧，其中一个完全形成的新生珠吞噬小体的形成，吞噬杯被关闭。这应该是相对的高炉通道清晰可辨。
- 去“分析”，然后点击“测量”执行测量，其结果将显示在一个单独的窗口标题为“结果”。
- 转到下一帧，调整投资回报率的情况下珠已经移动的位置，并重复测量。结果将被添加到该列表中的结果窗口中，每个分析帧可以基于在“标签”列中的值来识别。
注意 ：使用快捷键（如“M”为衡量标准）可显著加快评估进程;看到快捷键的列表和菜单中的“插件”下的指定服装的人。 - 在完成所有相关的帧的测量后，结果可以被复制到电子表格应用程序，如MS Excel中。列“IntDen”描绘了intensitie在那只测量被重定向到信道所选择的区域。
8。漂白校正
根据所使用的探针和成像设置，可能会发生光漂白。根据其程度，这可能强烈地影响了评价的结果。但是，这种影响可以部分通过应用变革的相等但方向相反率测量值校正。如果存在的话，光漂白系数可通过测量随时间变化的信号强度降低，在整个帧或该帧的具体裁剪区域，相关于每个吞噬体的分析的时间范围内进行计算。这个过程示于图3和图4。
- 在斐济的“插件”菜单中，使用“时间序列分析”插件来确定，一般跌幅在整个帧，或在一段时间的投资回报率特异性探针的信号强度（ 图3）。
注 ：时间序列分析仪插件可供下载的http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html ，如果不是已经存在的插件菜单。 - 暗算时间的测量（以秒为单位）在MS Excel中，只对对应于分析吞噬的帧的帧。
- 应用一个线性趋势线（ 图4A）的曲线图;负斜率的减小信号表示的光致漂白效应的存在。
- 从分析的吞噬小体（ 图4B和4C）应用逆转斜率值： 修正信号强度（SI）=原SI +（以秒为单位的时间*反向坡）
注 ：每单分析吞噬体将一个记录的时间推移电影中有一个特定的时间跨度（从完整的摄取帧）;光bleac兴必须重新计算该特定跨度和将只对从该特定吞噬体校正测量值。
9。数据评估
- 整理数据，并计算在适当的软件漂白校正的值的平均值和统计误差。
- 剧情以适当的形式的评估数据。
注 ：在这里，科学统计和绘图软件的GraphPad棱镜（ http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）使用。 Prism软件能够生成并画出平均曲线与相应的错误指示灯，只要所有的数据具有相同的帧速率（即所有都在相同的时间间隔，比如一帧每隔10秒与收购）。
注意 ：绝对的SI值相同experim的重复中宽变化耳鼻喉科集将介绍非常大的统计误差和呈现数据无法使用。这可能是情况下，如果协议中， 如成像设置，没有举行不同的实验重复要被整理中严格相同。
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Representative Results
正确的制剂的细胞和珠子成像是至关重要的。 图1显示了播种，探针装载和在该方法中初始成像步骤，根据我们对桥梁养护管理优化的协议的轮廓。它是必不可少的，因此，该协议参数进行测试和优化取决于细胞和探针要使用的类型。
另外的抗体包被的珠的预加载的细胞后，重要的是，视场被选择的方式，以提供最大数目的潜在摄取事件的最大数量的细胞成为可能，同时保持预定义的倍率设置该协议。如描绘在图2中 ，这种方法可以提供用于在每个时移视频更大数目可分析的吞噬体中。除了每每个实验组视频增产的数据点，这降低了通过改变periphe引入的变化拉尔条件，提高了数据的可靠性。
因此建议该信号关联的测量程序（ 图2）进行由同一人，并以盲方式，如果可能的。这可以帮助消除多个人的误差源，以减少错误并减少偏差，作为分配给每个吞噬体的ROI被选择，每个帧后，手动移动。
而自然的法则“的样本量越大越好”，也适用于这里，我们避免了评估超过5％的细胞在视场中珠吞噬体，以防止单个单元格，因为所有的行为给予太多的重量同一文化内的细胞不一定均匀19。这些吞噬体应选择随机尽可能。在这种情况下，参数如吞噬体用于成像的整个持续时间是完全可见的焦平面，也并非受过度的光漂白是必不可少的。此外，由一个单细胞吸收的影响大量的大颗粒会影响在该单元格中的吞噬体的融合力度，所以应优先考虑到由一个相对“空单元格”前面的过程中摄取的吞噬体。作为一般规则，从由多达五个独立的实验（因此，可达25吞噬体）的至少5细胞中的平均测量结果应提供良好的统计学意义。
时间序列分析的应用程序或类似的方法来检测可能的光漂白作用（ 图3）是非常重要的，因为一些探测器将强漂白患而另一些则非常光稳定性。如果强大的漂白作用被观察到在所有实验中以相同的探针的光致漂白校正步骤（ 图4）应仅被应用。它必须指出的是，这个过程可以只是部分正确漂白的效果。重要的是，过度漂白的只有少数病例可的非最佳条件下，如错误的激励或成像设置，错误的培养基pH值，不健康的细胞，或nonfresh试剂的标志。
在图5C中 ，胎边吞噬体用箭头表示在图5A和图5B中，进行了分析和Dex70kD信号强度（SI）关联到90分钟的范围内熟化吞噬体绘制。在曲线的噪声源是帧被测信号的帧变化等因素所致的梗阻等吞噬体和焦平面波动分析吞噬的。然而，在吞噬信号关联的时间趋势很容易清楚。从两个小区在图5A可见10吞噬体均经过分析，平均曲线可以绘制（ 图5D）该统计éRROR可以被绘制为均值的标准误差（SEM）或标准偏差（SD）根据样品的尺寸和实验条件。而平均曲线的绝对SI值通常是从任何一个单一分析吞噬体的不同，时间的趋势通常是非常相似的。经过分析，可以得出结论，Dex70kD交付溶酶体管腔货物珠吞噬体在野生型桥梁养护管理吞噬后35-40分钟内达到平台期。
该方法因此可以被用来研究各种因素对吞噬体成熟过程中的定性或定量的效果。
图1。细胞成像的制备。预先制备桥梁养护管理接种在玻璃底菜至少12小时之前，除了葡聚糖，葡聚糖在介质的溶液中加入浓度为20μg/ ml的浓度，并温育2-8小时（加载），洗涤细胞，加入新鲜培养基和细胞孵育至少4小时（追），细胞是再次洗涤，悬浮微珠是成像开始之前，为了补充道。 点击这里查看大图 。
图2。一步一步的指示进行图像分析。加载时间推移视频或图像序列在斐济不同的渠道后，评价遵循这些步骤（请注意，图中描绘的图像拼贴，而不是在这里所示的窗口将同时继续开放）。 （ 一 ）在“分析”菜单，像素距离缩放的情况下图像的元数据不可用斐济复位，不同的放大倍数先前已在斐济使用或延时录音是在不同的放大倍数，通过去（二）“设置量表”，（ 三）滴答作响，适用复位到所有随后加载映像系列“环球”框中，单击“单击以清除水垢”。 （ 四）确保两个明场（BF）通道图像序列（如珠吞噬体清晰可见），并包含探针信号通道加载和有相同的帧计数和像素尺寸， 例如 。两个系列具有450 X 450像素大小每400帧。 （e）在“分析”菜单，评价参数可以在“设置测量”，其中“区”，“综合密度”和“显示标签”参数必须选择设置。 （六克 ）这保证了红色通道强度的测定在感兴趣（ROI）的相同区域，是由虚线和白色箭头在红色通道表示。该通函投资回报率中选择使用“椭圆”工具选择的BF通道。 （ 八）开始测量下的“分析”，“测量”，或使用快捷命令，并重复整个一系列的实验所需的持续时间（ 如 90分钟）的每一帧。在每一帧，移动和重新调整投资回报位置到珠吞噬的兴趣和注意，将下一帧中的BF系列，并自动给予“测量”命令测量投资回报率在红色通道的相应帧。 （ⅰ）的测量结果将出现在“结果”窗口的列表。在“标签”栏，每行的确切框架明确，用它来检查一个帧的重复测量或长的图像序列被跳过的帧。 （j）在“IntDen”短集成密度是关键输出参数，至少在标签和“IntDen”值复制到MS Excel工作表继续进行评估。 IntDen值的单位是不确定的，并表示为任意单位（AU），这不，只要协议是严格遵循产生任何问题。比例尺是10微米。 点击这里查看大图 。
图3。分析光漂白的。60，（ 一 ）打开图像序列中感兴趣的通道，并确保如果需要的规模已被删除，（b）根据“插件”菜单中，单击（三）“时间序列分析”。 （d）用矩形选择工具，画一个矩形ROI几乎覆盖了整个画面，或感兴趣的电影的整个持续时间，（五）添加选定的投资回报率至少在整个小区，（六），点击“获取的平均“及（g）结果将显示在”时间跟踪“表和”时间跟踪平均“的情节。但是请注意，只有一个“平均”（平均亮度）值绘制在帧数，而不是“IntDen”的价值。 （ 八）在“分析”菜单，运行“办法”在不改变其他任何参数，来衡量“IntDen”为完全相同的投资回报率在相同的框架。这将提供我的等价在“IntDen”的强度，使用这个值来计算转换系数（相当于“区”），并绘制了“IntDen”争分夺秒整个帧的投资回报率在MS Excel中秒钟。 （ 十）点击“列表”，值列表复制到一个Excel工作表，并把所有“中庸”的价值观，以“IntDen”的价值观。 点击这里查看大图 。
图4。光致漂白的校正。根据所使用的探针和成像设置，可能会发生光漂白。这可能会极大地影响了评价的结果。 一 ）从整体框架探头的原始IntDen值（非盟）被暗算的时间以秒为单位在MS Excel中。添加一个线性趋势线;。一个明确的负斜率表示的光致漂白效应的存在B）作为一个例子，使用校正公式施加扭转斜率对原始IntDen收益率校正IntDen C）更正IntDen值被部分地用于补偿光漂白的效果。 点击这里查看大图 。
图5。演示文稿的代表性细胞动力学和校正信号的平均值。 A）桥梁养护装有葡聚糖探针在最小值0后，按箭头所示的IgG抗体包被的珠粒的摄取。比例尺是10微米。对应于电影1 B）2.5倍变焦从时间推移的影片插入，描绘了超过85分钟的跨度指定的吞噬体吸收后，假彩色与“地贫”查找起来表（LUT）的ImageJ的更好的可视性。测得的吞噬体的ROI被指示以白色虚线。从两个显示单元±标准差之内吞噬体10右旋糖酐交付和堆积在吞噬体的实例，以表示白色箭头。 三）纠正了德州红的70kDa的葡聚糖从溶酶体交付到指定的吞噬体D）荧光信号平均荧光IntDen值。 点击此处查看大图 。
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Discussion
在下面的部分我们将讨论所提出的方法及其局限性的关键步骤。此外，我们将连接一些与他们的解决方案中常见的问题，提出可能的修改，并考虑我们的方法的优点，以及合适的配套方法，这种方法。
的珠子，包括IgG的胎圈表面上的耦合的制备方法，是至关重要的，应该避免使用unfresh制剂。在增加的，它是同样重要的是葡聚糖是从冷冻股票（稀释和消毒）新鲜每次实验前准备。这是很重要的葡聚糖的装载如下一个精确的时间表，以达到在细胞摄取和隔室的分布和积累的一致性。此外，它不仅使用相同的显微镜设置和软件设置，但也保持了外围条件尽可能保持恒定（ 例如 TE是很重要的温度，CO 2，湿度，珠另外的技术， 等等 ）。另一个关键点是视图或感兴趣的细胞字段的选择，样品应成像开始之前，以选择单元格，足以代表被球探评估。
一项所述的方法的主要限制是必要的实验，得到显著样品尺寸的数量。所描述的方法是相对时间和工作密集的，因为观察到吞噬体中的一个视场，取决于所选择的分辨率的数目是有限的。池的随机选择的吞噬体的数量非常低，结果引起该风险，少数极端值可能对平均值一个突出的效果。另一方面较大的样本量将使吞噬体到吞噬体或细胞与细胞之间的差异掩蔽。
可能出现的常见问题包括污染，缺乏吞噬和过度漂白和照片由于激光的光毒性作用。
不育，适当的储存和准备葡聚糖是至关重要的，以避免污染。在我们的经验，所购买的葡聚糖不应该被认为是无菌的溶液。样品污染的风险可以被库存和稀葡聚糖溶液无菌过滤的广泛离心显著降低。另一方面，常规制备的新鲜珠悬浮液，其中含有蛋白质和容易受到污染，还可以减少污染的风险。
缺乏或吞噬作用的低水平可能是由于次优的有孔玻璃珠的IgG涂层。因此，准备组件珠（IgG溶液，EDAC）新鲜和不使用珠这是超过4周龄与否的抗体偶联重要的是一直保持只在4°C。由于有孔玻璃珠利用之前短暂超声处理，建议以制备分装以避免股票停牌的重复超声。另一个原因是比预期的吞噬性能较低可能是不健康的，不是最优培养的或旧的细胞，因此严格遵守建议的培养条件为使用的细胞类型是必不可少的。举例来说，收获期间胰蛋白酶消化过多可能会破坏吞噬表面受体和损害吞噬能力。
过度的光致漂白可以是与一些荧光基团的一个主要问题。调节显微镜的设置， 即激发光和样品暴露时间的强度，根据荧光团的漂白敏感性有助于控制的漂白。对于采集的连续帧之间的时间间隔，帧速率，这在更高的频率提供了更高的时间分辨率和更好的启示的重要相互作用动力学，以及探针的漂白之间的平衡有吨Ø遭致。的最佳平衡主要取决于在给定的实验中加以解决的问题。调整扫描分辨率，扫描频率和行或帧平均地表示可以被改变，以进一步优化样品暴露于激发光的持续时间的设置。可用性的一些选项由正在使用显微镜系统的类型却决定。
相同的一般应遵循的准则，以尽量减少激光的激发光对细胞的光毒性作用。这种效果可表现为成像或在非天然形态20中的显着增加期间暴露于激光的细胞的死亡。
这里我们提出了一个基本的和一般的方法，该方法允许修改和适应不同的实验设置。如所提到的，这个方法可以用于功能丧失，例如在基因敲除模型的研究中，基因敲除或突变蛋白的表达。它还允许不同的调理策略，以针对特定的吞噬受体，采用不同的核内体/溶酶体探针以及化学抑制剂或细胞因子的研究。
过与各荧光融合蛋白及其突变体的表达研究可以用于研究在发货适当的探针与吞噬体的效果。此外动力学和蛋白质本身的相互作用的动力学与吞噬体进行分析。有几个可用的探针可以用于这些目的。探头的通用类的一个突出的例子包括LysoTracker组acidotropic染料，被广泛用于跟踪内涵体室的质子流明以及在吞噬体腔。珠的涂层提供了另一种多种可能性。配体，包括核酸，如细 菌DNA 21，瑾珑的特定CpG位点现实的表面成分，如脂多糖，蛋白质，如抗生物素蛋白，血清蛋白，包括补体因子（ 如补体C1q或的iC3b）都可以穿越挂珠22-24。这使得这些配体在吞噬作用和吞噬体成熟的作用的研究。使用信号分子和免疫介质（例如细胞因子）打开的可能性另一个范围。
最后，这个方法还可以扩展，并适于通过比较活与死亡或致病与非致病性细菌的吸收来进行直接的研究，微生物，例如，虽然在图像分析细菌的形状不规则带来了新的挑战。
这种方法的未来的应用是作为歧管可应用的修改。作为下一个步骤，比例度量分析方法可以适用。组合的pH敏感和pH值不敏感的荧光染料珠涂层，或利用单探针来测量URE吞噬体的pH值（ 例如试剂盒pHrodo，FluoProbes）以及化合物，使它们能够通过实验遵循蛋白质和脂质的降解动力学的吞噬体（ 例如 OVA，HRP，牛血清白蛋白和甘油三酯脂肪酶底物）的内部可用25-31。这些共同构成可能建立的基础上，这里提出吞噬体的活细胞成像的基本方法调查方法广大。
所描述的方法可以实现相比，基于吞噬隔离32的方法高得多的时间分辨率。吞噬体的ELISA或Western印迹分析，可以代表相当高的数字事件在特定的时间点，但数据代表事件的一个更为异质性和潜在的不同步的人口。流式细胞仪为基础的方法在理论上允许分析到单个细胞水平，并以这种方式可能不太容易heterogeneiTY细胞群，但不确定同步的类似的问题，需要非常高的事件计数可靠的评估仍然存在。然而，高通量，灵敏度和流量的重现性流式细胞术方法33,34使它们的最佳补充，活细胞成像的方法。
总而言之，我们的方法的优点在于，准确性和与该单吞噬体可以遵循在活细胞中的成熟过程中高时间分辨率。相比，这限制观测到更少的时间点的所有其它方法，在自生能力和预处理的细胞，可以在这里随着时间下容易地修改的生理条件下长时间动态和连续跟随的细胞事件。我们可以定义相对于吞噬货物，这使得吞噬阶段的歧视更精确的摄取事件。通过这种方式，使同步到不是O唯一一句形象化吞噬体的类似的行为，它也允许确定由于例如细胞与细胞之间的差异的个体差异。最重要的是，这可能持有的关键，理解复杂的相互作用相互作用的动态特性可以有效地使用我们的活细胞成像方法高时间分辨率的照明。
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Disclosures
作者什么都没有透露。
Acknowledgments
我们感谢吞噬体生物学实验室手稿的批判性阅读的成员。这项工作是由亥姆霍兹青年研究者补助（倡议和亥姆霍兹联合会的网络基金） 和优先方案，德国研究理事会（德意志研究联合会，DFG）的SPP1580资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Austria | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) | PAA, Austria | E15-047 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | PAA, Austria | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Austria | M11-004 | |
| PBS | PAA, Austria | H15-002 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA, Austria | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Netherlands | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm | Greiner Bio one, Germany | 627871 | Alternative: Available as segmented |
| Carboxylated latex microspheres | Polysciences, USA | #09850 | Available in different diameters, we used 3 μm |
| Polystyrene microparticles | Kisker Biotech, Germany | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Germany | 305.1.3 | |
| mouse whole IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml syringe Omnifix -F | B.Braun, Germany | 9161406V | |
| 26 G needle (0.45*25 mm) | B.Baun, Germany | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Austria | E15-039 | |
| Horse Serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0.2 μM syringe mounted filter | Sartorius, Germany | 83.1826.001 |
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