Undersøgelse af fagolysosomet Biogenese i Live makrofager

Abstract

Fagocytceller spiller en stor rolle i det medfødte immunsystem ved at fjerne og fjerne invaderende mikroorganismer i deres phagosomes. Phagosome modning er den komplekse og stramt reguleret proces, hvor en spirende phagosome undergår drastiske forvandling gennem veltilrettelagt interaktioner med forskellige cellulære organeller og rum i cytoplasmaet. Denne proces, som er afgørende for den fysiologiske funktion af fagocytceller ved at give phagosomes med deres lytiske og bakteriedræbende egenskaber, kulminerer i fusion af phagosomes med lysosomer og biogenese af phagolysosomes som anses for at være den sidste og afgørende fase af modning phagosomes. I denne rapport beskriver vi en live cell imaging metode til kvalitativ og kvantitativ analyse af den dynamiske proces lysosom at phagosome levering af indhold, der er kendetegnende for fagolysosomet biogenese. Denne fremgangsmåde bruger IgG-belagte mikrokugler som en model for phagocyTosis og fluoroforen-konjugeret dextranmolekyler som luminal lysosomal last probe, for at følge den dynamiske levering af lysosmal indhold til phagosomes i realtid i levende makrofager under anvendelse af time-lapse billeddannelse og konfokal laser scanning mikroskopi. Her beskriver detaljeret baggrunden, forberedelse trin og trin-for-trin forsøgsopstilling der gør det let og præcis indsættelse af denne metode i andre laboratorier. Vores beskrevne metode er enkel, robust, og vigtigst, kan let tilpasses til at studere phagosomal interaktioner og modning i forskellige systemer og under forskellige eksperimentelle indstillinger såsom anvendelse af forskellige fagocytceller typer, tab af funktion eksperimenter, forskellige sonder, og fagocytiske partikler.

Introduction

Professionelle fagocytter, herunder makrofager, spiller en afgørende i immunsystemet. Ud over at være den første linje i forsvaret i det medfødte immunsystem, de spiller også en afgørende rolle i aktivering af den adaptive immunitet gennem deres signalering og antigenpræsenterende rolle ^1-3. Mens funktionen af professionelle fagocytter er mangesidet, phagosome modning er den kritiske rygraden i bakteriedræbende og antigenbehandling funktion af de professionelle fagocytter ^4,5. Efter receptor medieret engulfment og optagelse af en fagocytisk mål, såsom bakterier, den spirende phagosome går gennem en kompleks og godt orkestreret sekvens af samspil og udvekslinger med rum i endocytiske nettet og flere andre cellulære organeller ^6. Arten af ​​de forbindelser, der udveksles med disse cellulære enheder samt regulering og timingen af ​​fusionsbegivenheder bestemmer luminale phagosomal miljø og phagosOMAL sammensætning membran og dermed ⁷ skæbne modning phagosome ^8.

Den fysiologiske relevans af phagosome modning er eksemplificeret ved de forskellige strategier, som forskellige intracellulære patogener at flygte fra, arrestation eller undergrave phagosome modning ^9. De fleste af disse strategier direkte eller indirekte forhindre endelig og kritisk fase af phagosome modningsproces: fusion af phagosome med sene endosomale / lysosomale rum, der forlener dem med hovedparten af hydrolytiske enzymer og anti-bakterielle faktorer af en moden phagosome ^{7 , 8,10.} Analyse af den sidste kritiske skridt kan derfor give os stærke indikatorer om tilstanden af ​​modningen af ​​phagosomes og hvis den naturlige fysiologiske tilstand bliver positivt eller negativt påvirket under de særlige eksperimentelle indstillinger, der bliver udnyttet.

Den sene endosomale / lysosomale rums er generelt anses for at være de terminale rum i endocytiske proces, defineret og adskiller sig fra de tidlige endocytiske rum ved tilstedeværelsen af ​​forskellige, Stage specifikke markørmolekyler. For eksempel hydrolytiske enzymer eller membran komponenter såsom Lysosomal associerede membranproteiner (lamper) blandt andre ^11. Terminalen endocytisk rum-herefter blot kaldet lysosomer-også tjene som det vigtigste sted for de afsluttende faser af fordøjelse ved afslutningen af den fagocytære / endocytiske proces ^12. På denne måde kan ufordøjelige sonder indlæses via endocytose og macropinocytosis fra den ekstracellulære miljø og transporteres gennem endocytiske vejen til lysosomer, hvor det ophobes ^13,14 efter at have fulgt en klart defineret optagelse og jage. Fluorofor-konjugerede prober til fluorescensmikroskopi såsom organiske ufordøjelige polymer dextran er almindeligt anvendt som endocyticprobes ^15-17.

14,18.

Efter beskrivelsen af ​​vores metode, kan analoge forsøg tilrettelægges med ændrede indstillinger og faktorer til at undersøge deres indflydelse på phagosome modning, næsten enhver othendes type af vedhængende primære eller celle-line fagocytceller, genetisk tab af funktion forsøg, herunder gen knock-out og knock-down, mutanter eller udtryk for fusionsproteiner, fagocytiske-mål, microbead coatingforbindelser, endosomale / lysosomale sonder og faktorer som et cytokiner, kemiske hæmmere eller siRNA blandt andre er alle variabler, der kan anvendes til den grundlæggende fremgangsmåde ved denne metode.

Vi definerer målet og de grundlæggende krav af denne metode som følger:

• Målet for metoden: at muliggøre direkte, kvantitativ og kvalitativ observation og analyse af phagosome modning med høj tidslig opløsning i levende fagocytceller.
• Fagocyterende last: En behørigt belagt mikropartikler eller biologisk mål. Her bruger vi IgG-coatede 3 um sfæriske polystyren mikropartikler, der let internaliseres via Fc-γ-receptor-medieret fagocytose. Alternativt kan mikroorganisme eller overtrukket microparticle for hvilke en fagocytisk receptor er til stede på de celler, kan anvendes.
• Fagocytiske celler: Adhærente fagocytiske celler, der udtrykker de relevante fagocytiske receptorer. Her bruger vi mus primære BMMs der rigeligt udtrykker Fc-γ-receptorer. Alternativt kunne dendritiske celler (DC), monocytter eller phagocytiske epitelceller eller deres genetiske mutanter eller knock-out varianter anvendes.
• Lysosomale last: En fluorescens-mærkede lysosomale sonde. Her Texas Red-konjugeret 70.000 kilodalton dextran (Dex70kD) anvendt som den luminale last af lysosomer. Alternativt kan fluorescens detekterbar markør af et cellulært rum eller organel eller en passende probe til phagosomal egenskaber såsom syre-eller nedbrydende kapacitet, kan anvendes til at studere udviklingen af ​​phagosome modning.
• Faktorer: For eksempel signalmolekyler, kemiske forbindelser, gen knock-down, eller transient ekspression af mutant proteiner kunne. Her har vi FÖRGen brug af en sådan faktor for overskuelighedens skyld, men for et nyligt eksempel med mutant protein udtryk og knock-down påvirkende faktorer se Kasmapour et al. ^18. Enhver faktor, der kan påvirke fagocytose eller omstændighederne og mobilitet phagosomes og / eller de rum, der interagerer med udløb phagosomes kunne potentielt anvendes.

Protocol

Dyrepleje og alle procedurer i denne protokol følger de institutionelle og nationale retningslinjer.

Forbered de forberedelser, der er markeret med "Π-" på forhånd.

1.. Fremstilling af BMMs

1. Udfør aflivning af musene ved cervikal dislokation.
2. Fjern lårben og skinneben knogler, frie ben fra væv og trim begge ender for tilgængeligheden af ​​knoglemarven.
3. Holde knoglerne i iskold PBS eller iskold DMEM-medium (suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 ug / ml streptomycin, på is, indtil det næste trin.
   Bemærk: Foretag følgende trin under en klasse II biosikkerhed kabinet for at minimere risikoen for forurening.
4. Skyl benpiben med koldt PBS + penicillin / streptomycin ved hjælp af en 26 G (0,45 mm) nål fastgjort til en 1 ml sprøjte.
5. Pellet celler ved forsigtig centrifugering ved 350 xg i 10 min pellet resuspenderes i BMM withium og plade i steril mikrobiologi noncoated petriskåle.
   1. Fremstilling af BMM medium
      • Dulbeccos Modified Eagles Medium DMEM
      • 10% inaktiveret FCS
      • 20% muse-fibroblast L929 cellelinien kultursupernatant (kilde makrofag koloni-stimulerende faktor, M-CSF)
      • 5% hesteserum
      • 2 mM glutamin
   2. Fremstilling af L929 cellelinien dyrkningsmedium;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium
      • 10% inaktiveret FCS
      • 2 mM glutamin
   3. Fremstilling af muse-fibroblast L929 cellelinien kultursupernatant;
      • Sammenflydende L929-celler blev delt 1:4 dyrket i 175 ^cm2 kolber i 2 dage under anvendelse af 20 ml L929-medium, og kultursupernatanten blev opsamlet efter 48 timer, filtreret og tilsat til BMM-medium
6. Inkubér cellerne skyllet fralårbenet i en inkubator ved 37 ° C i 5% _{CO2-atmosfære.}
7. Efter hver 48 timer (maksimalt 72 timer) inkubation opsug mellemlang og erstatte med frisk BMM medium, i op til 10 dage. Mere end 95% af cellerne var positive for CD14 som testet ved flowcytometri. CD14 er en mønstergenkendelse receptor primært udtrykkes af makrofager. Ved at bestemme procentdelen af ​​celler positive for denne receptor er en renkultur af vedhængende BMMs blevet genereret.

Bemærk: forberede og kultur cellerne i overensstemmelse hermed, hvis der anvendes andre celletyper.

2. Overfladebehandling af Microbeads som Fagocytisk Cargo

1. Til fremstilling af 1 ml perleopslæmning bruge 400 pi 2,5% 3 um carboxylerede polystyren mikropartikler eller alternative mikropartikler.
2. Overfør perlesuspensionen til et 1,5 ml mikrocentrifugerør, vaskes 3x med PBS, og 100 pi af 500 mM 2 - (N-morpholino) ethanulfonic-natriumsalt, MES-buffer ved pH 6,7 til perlen pellet.
3. 50 ug muse-IgG (polyklonale IgG antistof) opløses i 50 pi sterilt _ddH2O og føje til perlen suspension.
4. Fyld suspensionen op til 1 ml med sterilt _ddH2O (450 ul).
5. Inkuberes opløsningen i 15 minutter på et roterende hjul ved stuetemperatur.
6. Forbered EDAC tværbindingsmiddel, N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimid-hydrochlorid i en koncentration på 10 mg / ml, og der tilsættes 14 pi til perlesuspensionen.
   Bemærk: EDAC tværbindinger aminogrupper af IgG med carboxylgrupperne på overfladen af perlerne og letter immobilisering af IgG på perleoverfladen. Dette er kritisk for perle optagelse og derfor løsningen bør tilberedes frisk.
7. Inkuberes suspensionen på et roterende hjul i 1 time ved stuetemperatur.
8. Tilføj 14 pi EDAC krydsbinder og inkuber suspensionen på et roterende hjul i 1 time ved stuetemperatur.
9. Centrifugeres suspensionen ved 10.000 xg i 2 min i en mikrocentrifuge.
10. Vask perlerne 3x i stop-buffer (1% Triton-X 100 i 10 mM Tris, pH 9,4) for at stoppe den tværbindende reaktion, ved at resuspendere pelleten i stop-buffer og centrifugering af opløsningen ved 10.000 xg i 2 min.
11. Vask perler 3x i PBS, og pellet resuspenderes i 1 ml PBS.
    Valgfrit: Forbered arbejder portioner af 30-50 ul.
12. Opbevar IgG-overtrukne perlesuspension ved 4 ° C ikke længere end 4 uger og aldrig tillade suspensionen, der skal fryses.

Bemærk: Et konserveringsmiddel, såsom natriumazid til en slutkoncentration på 0,02% (w / v) kan sættes til suspensionen for at forhindre bakteriel vækst og kontaminering. I dette tilfælde er vask af perlerne før dets anvendelse skal udføres for at undgå cytotoksiske virkninger af konserveringsmiddel. Centrifugeres en alikvot af suspensionen ved 10.000 x g i 2 min og vaske perlerne ved resuspendere pellet i PBS. Gentag vask 3x.

3. Fremstilling af Dextran Probe Stamopløsning

1. Opløs Texas Red 70.000 kilodalton Dextran (Dex70kD) i PBS ved 20 mg / ml og opbevares ved -20 ° C, i henhold til producentens anvisninger.
   Bemærk: Hold lagrene ved -20 ° C i op til flere måneder, eller ved 4 ° C i få uger, se producentens dokumentation.
2. Forbered dextranopløsningen til eksperimentet fra bestanden ved at fortynde det i fuldstændig DMEM celledyrkningsmedium (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutamin) ved cirka 1 mg / ml (adskillige gange koncentreret opløsning, der skal fortyndes til endelig bearbejdning koncentration på 20 ug / ml før tilsætning til cellerne).
3. Brug en ultralyd vandbad til lydbehandle dextran portion i 5 min at homogenisere løsningen og opløse aggregater, der senere kan føre til artefakt generation under billedbehandling.
4. Der centrifugeres ved maksimal gi 5 minutter i en mikrocentrifuge for at fjerne eventuelle uopløste klumper eller urenheder fra opløsningen.
5. Flyt forsigtigt supernatanten til et frisk rør og samtidig undgå pellet i bunden af ​​røret og fortyndes opløsningen til den endelige bearbejdning koncentration på 20 ug / ml i komplet DMEM celledyrkningsmedium.
6. Filter-sterile løsningen ved hjælp af en 0,2 um sprøjte monteret filter.

4.. Dextran preloading

1. Seed celler i et levende celler glasbund skål og inkuberes i mindst 12 timer (ved 37 ° C i 5% _{CO2-atmosfære)} for at sikre fastgørelse og akklimatisering.
   Bemærk: Der er segmenteret glasbund retter tilgængelige, som tillader udførelse af flere eksperimenter (op til fire rum) per fad.
2. Forbered dextran i DMEM opløsning som beskrevet i protokol 3. Varm op den forberedt dextran i DMEM løsning ved hjælp af et vandbad ved 37 ° C.
3. Aspirer medium ennd tilføje dextranopløsning til cellerne grundigt og inkuberes ved 37 ° C i 5% _{CO2-atmosfære} i 2-8 timer for optagelse.
   Bemærk: Plan og optimere protokol baseret på sonden og celletype, der bruges, og strengt overholde denne varighed, når gentage eksperimenter. Dette er vigtigt for profilen af ​​dextran akkumulering i endocytiske proces og dermed reproducerbarhed eksperimenter.
4. Vask cellerne 3x med forvarmet komplet DMEM medium aspirer medium og skyl cellerne grundigt med frisk medium.
5. Cellerne inkuberes med komplet DMEM medium i 4-12 timer ved 37 ° C i 5% _{CO2-atmosfære.}
6. Vask cellerne en gang med forvarmet komplet filtreret phenolrødt-frit DMEM-medium.
7. For at opnå optimale resultater imaging, skift til forvarmet fuldstændig filtreret phenolrødt-frit DMEM-medium i mindst 30 minutter før starten af ​​billeddannelse. Phenolrødt kan medføre afkøling af fluorescerende signaler, øget baggrundsstøj ogdermed reducere billedets kontrast og klarhed.

Bemærk: Opsætning af mikroskop og indstillingerne billedbehandling i forvejen, ifølge preplanned og optimeret protokol baseret på den type af sonde og celler, der er brugt.

5.. Tilføjelse af IgG-belagte perler

1. Ækvilibrer en portion af preprepared 1% perlesuspension til RT og lydbehandle i en ultralyd vandbad i 2-3 min.
2. Læg 1-6 pi af 1% perlesuspension til den fuldstændige filtreret phenol-DMEM medium under en klasse II biosikkerhed kabinet for at minimere risikoen for forurening (et godt udgangspunkt koncentration er 1 pi / 2 ^cm2 skål overflade).
   Bemærk: Her BMMs blev podet ved 25.000 celler / brønd og en 6 pi 1% lager perlesuspension blev tilsat til mediet i skålen. Dette svarer til omtrent en perle / celle-forhold på 15:1. Forholdet skal tilpasses til typen af ​​de celler, der anvendes, og til perle materiale; dvs.e. latexperler har lav densitet og ikke synker til bunds hurtigt, mens polystyrenkugler vask og komme i kontakt med de adhærerende celler meget hurtigere og dermed i større antal.
   Bemærk: Afhængigt af eksperimentet, kan det være en fordel at vælge den region, der vil blive observeret på forhånd. Perlesuspension kan derefter kun føjes til det specifikke område af glasbund fad og derved øge sandsynligheden for at observere gunstige optagelse begivenheder.
3. Den tætte sky af perler kan spredes ved forsigtigt at pipettere suspensionen i glasbund fad.
4. Vent perler synke til bunden af ​​glasset bunden skålen og er omtrent i samme plan med vedhængende fagocytceller.
5. Fokus på området af interesse (ROI) og start time-lapse billeddannelse.

Bemærk: Det kan være nødvendigt at finjustere fokus, mens billeddannelse er i gang, afhængigt af det billeddannende system, der bruges, dens stahed og mobilitet af de observerede celler. Bemærk dog, at dette kan gøre det umuligt, at korrekt analyse af phagosomes som stærkt afviger fra flyet af fokus som følge af refokusering.

6.. Imaging

Følg nedennævnte generelle retningslinjer for optimal billedkvalitet;

1. Brug en konfokal billeddannelse, såsom en laser-scanning eller rotationsskiveteknologi system.
   Bemærk: Et Leica TCS SP5 AOB'er Laser konfokal mikroskop kontrolleres af Leica LAS AF-software og er udstyret med en miljømæssig kontrol kammer blev brugt her til time-lapse video billeddannelse.
2. Optimer de billeddannende indstillinger såsom scanning hastighed, forstørrelse, opløsning osv. på en sådan måde at tillade en hastighed på en ramme i hver 7-20 sek afhængigt af det anvendte system.
   Bemærk: Her er et 200 Hz scanning hastighed, 2x scanner zoom og en linje gennemsnitsberegning af 2-3x med en opløsning på 512 x 512 pixels resulted i en optagelse tid mellem 3-5 sek / Rame. Et sats på en ramme i hver 10 sek blev brugt til at optage time-lapse film med varigheder på mindst 120 min.
3. Anvend passende excitation / emission indstillinger baseret på det anvendte imaging system og sonde (r).
   1. Optimere indstillingerne for at forhindre overdreven fotoblegende.
      Bemærk: Her Texas Red Dextran 70kD var begejstret ved hjælp af en DPSS (561 nm) laser og emission lys blev opdaget af en Leica hybrid detektor (Hyd) ved 600-650 nm med peak emission ved 610 nm. Laserintensitet skal tilpasses til signalintensiteten og holdes så lav som muligt for at minimere fotoblegende af fluoroforen (r) og foto toksicitet virkning af laserlys på cellerne. Generelt er det vigtigt at skabe balance mellem scanning hastighed, line gennemsnitsberegning, scanning opløsning, frame interval og varighed imaging at få ordentlig og stabilt signal intensitet og fange den komplette varighed perle optagelse og phagosome modning proces.
4. Inkluderer en lys-felt (BF) kanal til at observere perlerne, hvis de ikke er konjugeret med en fluorofor.
   Bemærk: Ved siden af Texas Red-kanalen blev BF kanal, der bruges til at visualisere perlerne blev den samme DPSS laser, der anvendes som lyskilde og signalet blev detekteret med et foto multiplikator (PMT) detektor.
   Bemærk: Sørg for at anvende identiske optagelsesindstillinger, når de erhverver data, der skal indsamles. Vigtigste parametre er: excitation laser intensiteter, detektor indstilling, indstillinger erhvervelsesomkostninger, forstørrelse og rammeintervaller. Ikke at bruge identiske rammeintervaller vil nødvendiggøre en kurve-gennemsnitsberegning trin som observationspunkterne datapunkter ikke vil overlappe (fx at samle en observation med rammer erhvervet ved hver 7 sekunder med et andet sæt med rammer på hver 12 sek). Dette ville øge de nødvendige skridt til analyse af data og kræver ekstra software med kurve-gennemsnitsberegning funktion, såsom OriginLab 's Origin Pro statistik software ( http://www.originlab.com/ ).
5. Fortrinsvis gemme time-lapse video i det native fil-format af det anvendte imaging system og undgå eksport i komprimerede formater.

Bemærk: Her blev time-lapse film gemt i den indfødte Leica LAS AF format filer, som derefter importeres direkte til at åbne i Fiji (LIF).. Fiji er i stand til at læse de indfødte filformater fra de fleste mikroskop producenter, der bruger den medfølgende Bio formater importør plug-in. Eksport af time-lapse film fil i et billede serie med JPG eller TIFF eller som en videofil i en AVI container format er ikke nødvendigt eller anbefalet. Ud over at bevare den bedst mulige billedkvalitet fra den oprindelige observation ved at undgå lossy komprimering algoritmer (fx JPEG), ved hjælp af den indfødte mikroskop filformat forsikrer, at filens meta-data (tidsstempler, forstørrelse, laser og erhvervelse intensiteter, Detektor-indstillinger osv.) bevares og til rådighed for Fiji. Men hvis en eller anden grund har brug for at blive eksporteret i et andet format til analyse time-lapse video-filer, så sørg for at bruge ukomprimerede filformater såsom TIFF-billede serie og separat RGB farve (rød, grøn, blå) kanaler allerede på dette trin, da Fiji kan ofte ikke held adskille BF kanal fra andre farvekanaler i eksporterede filer. Sørg også for at bevare den oprindelige mikroskop filer som reference.

7.. Analyse af Time-lapse film

1. Brug ImageJ, Fiji eller anden software, der giver en analoger signal forening analysekapacitet.
   Bemærk: Her blev Fiji anvendt til analyse af time-lapse film. Fiji er en ImageJ fordeling indeholder et billede behandling pakke med reorganiserede værktøj menuer og yderligere native plug-ins, der er tilgængelig til gratis download på http://fiji.sc . Beskrevet i denne sekt procesion er afbildet i figur 2.
2. Åbn filen i Fiji ved at klikke på "File", "Open" og vælge filen, eller ved at trække og slippe filen til Fiji.
3. Vælg mellem følgende muligheder;
   1. Stak visning: Vis stak med Hyperstack,
   2. Farve muligheder: farvetilstand farvelægges,
   3. Split kanaler i separate vinduer: Split kanaler (for hver RGB farve-kanal, der blev indspillet vil blive åbnet et separat vindue).
4. I tilfælde af en billedserie skal anvendes, indlæse serie til Fiji ved at gå til "File", "Import", "Image Sequence" og vælg et billede i den mappe, der indeholder målbilledet serien.
   1. Set filtre og betingelser for indlæsning af valgte billeder i serien, for eksempel;
      1. Antal billeder: hvor mange billeder der skal indlæses.
      2. Start billede: hvilket billede er udgangspunktet billede i serien.
      3. Forøgelsen: tilvæksten mellemrammer, der skal lastes (hver ramme i hver anden ramme osv.).
      4. Filnavn indeholder: filtrering til specifik kanal ved hjælp af filnavnet (f.eks ved at indstille "C001", som er, hvordan normalt billederne fra "kanal 1" er mærket efter farve-separation af en multikanal time-lapse video).
5. Fjern skalering ved at gå til "Analyze", "Set skala ...", markere feltet "Global" og klikke på "Klik for at fjerne skala".
   Bemærk: Dette trin giver pixel-baseret analyse af billederne i tilfælde forskellige forstørrelser har været brugt til de forskellige eksperimentelle apparater, der skal evalueres. Hvis har altid været holdt konstant forstørrelsen indstillinger, og de indfødte mikroskop filen blev importeret direkte til Fiji, kan dette trin springes over, da Fiji kan forstå og bruge forstørrelsen og skala data fra mikroskop filens metadata.
6. Indstil måleparameter ops ved at gå til "Analyze", "Set Målinger", og at kontrollere følgende felter: "Area", "Standardafvigelse", "Integreret tæthed", "Display label" og "Mean grå værdi".
7. Omdirigere til den farvekanal, der indeholder signalet fra sonden, der skal måles, og bekræft med "OK".
8. Gå til rammen, hvor målingerne skal startes, og vælg BF kanal vinduet ved at klikke på den øverste kant af vinduet.
9. Brug "ovale markeringsværktøj" for at vælge et område af interesse (ROI), dvs en cirkulær ROI på internaliserede perlen. Sørg for, at markeringen er monteret tæt til den yderste kant af perlen så synlig i BF kanal.
   Bemærk: Når du bruger en pc, skal du holde Shift-tasten nede, mens du bruger markeringsværktøjet til at sikre en cirkulær ROI.
10. Start målingen optimalt et par frames før den fulde engulfment af perlen er afsluttet, og bemærkramme, hvor en fuldt dannet spirende perle-phagosome er dannet og fagocyterende kop er lukket. Dette bør være relativt tydeligt mærkbare i BF kanal.
11. Gå til "Analyze" og klik på "Measure" for at udføre målingen, resultatet vil blive vist i et separat vindue med titlen "Results".
12. Gå til det næste billede, justere placeringen af ​​ROI i tilfælde perlen er flyttet, og gentag målingen. Resultatet vil blive tilføjet til listen i resultatet vinduet, og hver analyseret ramme kan identificeres baseret på værdien i kolonnen "Label".
    Bemærk: Brug af genvejstaster (fx "M" for mål) kan markant fremskynde evalueringsprocessen se listen over genveje og tildele kostume dem under menuen "Plugins".
13. Efter endt måling af alle relevante rammer, kan resultaterne blive kopieret til et regneark som MS Excel. Kolonnen "IntDen" skildrer intensities af det valgte område i kanalen, at målingen blev omdirigeret til.

8.. Blegning Korrektion

Afhængigt af den anvendte probe og billedbehandling indstillinger, kan fotoblegende forekomme. Afhængigt af dens omfang, kan det stærkt påvirke resultatet af evalueringen. Dog kan denne virkning delvis korrigeres ved at anvende en tilsvarende, men modsat hastighed af ændring til de målte værdier. Hvis nuværende kan fotoblegende koefficient beregnes ved at måle den tidsafhængige signal intensitet fald i hele rammen, eller specifikt beskårne område af rammen, i den tid-span er relevant for analysen af ​​hver phagosome. Denne fremgangsmåde er afbildet i figur 3 og 4.

1. Under "Plugins" menuen på Fiji, bruge "Time Series Analyzer" plug-in til at bestemme det generelle fald i hele-frame eller ROI specifik probe signal intensitet over tid (figur 3).
   Bemærk: Time Series Analyzer plug-in er tilgængelig for download på http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , i tilfælde der ikke allerede er til stede i menuen plugins.
2. Plot målingen mod tiden (i sekunder) i MS Excel, kun for de rammer, der svarer til de rammer af en analyseret phagosome.
3. Anvend en lineær trend-linie (figur 4A) til plottet, en negativ hældning for aftagende signal indikerer tilstedeværelsen af foto-blegning virkning.
4. Påfør vendt skråning til værdier fra en analyseret phagosome (figur 4B og 4C): berigtiget signal intensitet (SI) = rå SI + (tid i sekunder * omvendt hældning)

Bemærk: hver enkelt analyserede phagosome vil have et bestemt tidsrum (starter ved fuldstændig optagelse billede) under en optaget time-lapse film, foto-bleaching skal genberegnes for den specifikke spændvidde og vil kun være gyldige for at korrigere de målte værdier fra den specifikke phagosome.

9.. Dataevaluering

1. Sætvis data og beregne den gennemsnitlige og statistiske fejl af blegning korrigerede værdier i passende software.
2. Plot de evaluerede data i en passende form.

Bemærk: Her er de videnskabelige statistikker og plotte software GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ blev), der anvendes. Prism software er i stand til at generere og plot en gennemsnitlig kurve med de tilsvarende fejlindikatorer, så længe alle data har samme frame rate (dvs. alle er erhvervet med med samme intervaller, såsom én ramme hver 10 sek).

Bemærk: Store variationer af de absolutte SI værdier inden gentagelser af samme experiment sæt vil introducere meget store statistiske fejl og gøre data ubrugelige. Dette kan være tilfældet, hvis protokollen, f.eks imaging indstillinger ikke holdes strengt identiske mellem forskellige eksperiment gentager, der skal samles.

Representative Results

Den korrekte forberedelse af celler og perler til billeddannelse er kritisk. Figur 1 viser omridset af såning, sonde-loading og indledende billedbehandling trin i denne metode, baseret på vores optimerede protokol for BMMs. Det er derfor afgørende, at protokollen parametre kontrolleres og optimeres afhængig af typen af ​​celler og prober, der skal anvendes.

Efter tilsætning af de IgG-belagte kugler til forudinstallerede celler, er det vigtigt, at synsfeltet er valgt på en måde for at tilvejebringe det største antal potentielle optagelse begivenheder i det største antal celler som muligt, samtidig med at den foruddefinerede forstørrelsen af protokollen. Som vist i figur 2, kan denne tilgang give et større antal analyserbare phagosomes i hver time-lapse video. Ud over at øge datapunkterne per video udbyttet af hvert eksperiment sæt, dette mindsker variationen indført ved varierende peripheral forhold og øger robustheden af ​​data.

Det anbefales, at signal-foreningen målemetode (figur 2) skal udføres af den samme person, og i en blind måde, hvis det er muligt. Dette kunne bidrage til at mindske fejl ved at fjerne flere personlig fejlkilder og reducere bias, som ROI tildelt hver phagosome skal vælges og flyttes manuelt efter hver frame.

Mens naturligt reglen om "jo større stikprøvestørrelse, jo bedre" gælder også her, undgår vi at evaluere mere end 5 perle-phagosome per celle i synsfeltet for at forhindre at give for meget vægt på en enkelt celle som adfærd alle celler i samme kultur er ikke nødvendigvis homogen ^19. Disse phagosomes bør vælges tilfældigt i videst muligt omfang. I denne sammenhæng parametre såsom phagosomes er fuldt synlig i brændplanet for hele varigheden af ​​imaging og heller ikke at værepåvirket af overdreven fotoblegning er afgørende. Desuden kan ophæve parkering et stort antal af store partikler med en enkelt celle påvirke fusionsprocessen dynamik for de phagosomes i cellen, så bør gives prioritet til de phagosomes der er uptaken tidligere i processen ved en relativt "tom celle". Som hovedregel bør de midlede målinger fra mindst fem celler fra op til fem uafhængige forsøg (og dermed op til 25 phagosomes) sørge for god statistisk signifikans.

Anvendelsen af Tidsrækkeanalyse eller en tilsvarende metode til at opdage en eventuel fotoblegende effekt (Figur 3) er meget vigtigt, da nogle sonder vil lide under kraftig blegning mens nogle er meget foto-stabil. Korrektion trin foto-blegning (Figur 4) bør kun anvendes, hvis der observeres en kraftig blegning effekt i alle forsøg med samme sonde. Det skal bemærkes, at denne proces kan kun delvist korrektvirkningen af ​​blegning. Vigtigt er det, kan overdreven blegning i kun i få tilfælde være et tegn på nonoptimal forhold, såsom forkert magnetisering eller billedbehandling indstillinger forkert medium pH, usunde celler eller nonfresh reagenser.

I figur 5C perle-phagosome angivet med en pil i figur 5A og 5B, analyseres og Dex70kD signalintensitet (SI) associering modning phagosome under en spændvidde på 90 min er plottet. Støjkilden i kurven er den ramme til ramme variationer af det målte signal på grund af faktorer såsom obstruktion af den analyserede phagosome andre phagosome og fokalplan udsving. Men den tidsmæssige tendens signal associering med fagosomet det tydeligt fremgår. Efter et gennemsnit af analyser fra 10 phagosomes fra de to celler er synlige i figur 5A, kan en gennemsnitlig kurve skal plottes (figur 5D) til det statistiske error kan plottes som standardafvigelsen af ​​middelværdien (SEM) eller standardafvigelsen (SD), afhængigt af prøvens størrelse og eksperimentelle betingelser. Mens de absolutte SI værdier af gennemsnit kurve er sædvanligvis forskellig fra enhver enkelt analyseret phagosome, den tidsmæssige udvikling normalt er meget ens. Efter analyse kan det konkluderes, at leveringen af ​​Dex70kD som lysosomale luminale last til perle-phagosomes i vildtype BMMs nået et plateau i 35-40 min efter fagocytose.

Denne metode kan derfor anvendes til at undersøge den kvalitative eller kvantitative effekt af forskellige faktorer på phagosome modningsproces.

Figur 1. Udarbejdelse af celler til billeddannelse. Preprepared BMMs udsås i et glas bund fad mindst 12 timer før tilsætningdextran, er opløsning af dextran i medium tilsat ved 20 ug / ml koncentration og inkuberet i 2-8 timer (belastning), cellerne vaskes, tilsættes frisk medium og celler inkuberes i mindst 4 timer (chase) celler vaskes igen og perlesuspension tilsættes lige før starten af billeddannelse. Klik her for at se større billede .

Figur 2. Trin for trin instruktion for billedanalyse. Efter indlæsning time-lapse video eller billedsekvens i forskellige kanaler i Fiji, evalueringen følger disse trin (Bemærk, at figuren viser et billede collage og ikke alle de vinduer, der vises her, vil forblive åbne samtidigt ). (A) Under "Analyze"-menuen, pixel tilafstand skalering nulstilles i tilfælde af meta-data for billederne er ikke tilgængelige for Fiji, er forskellige forstørrelser tidligere er blevet anvendt i Fiji, eller tidsforskudte optagelser befinder sig på forskellige forstørrelser, ved at gå til (b), "Set Scale" ( c) tikkende den "globale" boks, som anvender nulstillet til alle efterfølgende loadet billede serier og klikke på "Klik for at fjerne skæl." (D) Sørg for, at både den lyse felt (BF) kanal billede serien (hvor perle-phagosomes er klart synlige) og kanal, der indeholder sonde signal er indlæst og har nøjagtig samme frame-tæller og pixel dimensioner, f.eks. to serier af hver 400 rammer med 450 x 450 pixel dimensioner. (E) Under "Analyze" i menuen, kan parametre for vurderingen indstilles under "Set Målinger", hvor "Area", "Integreret tæthed" og "Display label" parametre der skal vælges. (F (G) Dette sikrer måling af røde kanal intensitet i samme region af interesse (ROI), der er angivet ved den stiplede linie og den hvide pil i rød-kanal. Cirkulæret ROI er valgt i BF-kanalen ved hjælp af "Oval" udvælgelse værktøj. (H) Start målingen under "Analyze", "Measure" eller brug genvejen kommando, og gentag for hver frame af hele serien til den ønskede varighed af eksperimentet (fx 90 min.) I hver ramme, flytte og justere placeringen ROI til perle-phagosome af renter og bemærk, at gå til næste ramme i BF serien og giver kommandoen "Measure" automatisk måler ROI i den tilsvarende ramme i rød-kanalen. (i) Måleresultatervises som en liste i "Results" vinduet. I kolonnen "Label", er nøjagtig den frame for hver linje tydeligt identificeret bruge dette til at kontrollere for gentagne målinger af en enkelt ramme eller sprunget frames i lang billede serie. (J) "IntDen" kort for integreret massefylde er den kritiske output parameter, kopiere mindst etiketten og "IntDen" værdier til en MS Excel-ark til at fortsætte med evalueringen. Enheden for IntDen værdi er udefineret og angivet som arbitrære enheder (AU), betyder det ikke skabe nogen problemer, så længe de protokoller følges nøje. Målestokken er 10 mM. Klik her for at se større billede .

Figur 3. Analyse af foto-blegning.60 (a) Åbn billede serie i kanalen af interesse og sørg for, at skalaen er blevet fjernet, hvis det er nødvendigt, (b) Under "Plugins" menuen klik (c) "Time Series Analyzer". (D) brug det rektangulære markeringsværktøj, tegne en rektangulær ROI dækker næsten hele rammen, eller i det mindste hele cellen af interesse for hele varigheden af filmen, (e) tilføje det valgte ROI, (f) Klik på "Get Gennemsnit "og (g) Resultater vil blive vist i" Time Traces "bord og" Time Traces Average "plot. Bemærk dog, at kun en "gennemsnitlige" (Mean intensitet) værdi afbildes mod rammen nummer og ikke "IntDen" værdi. (H) Under "Analyze"-menuen, run "Measure" uden at ændre andre parametre at måle "IntDen" for nøjagtig den samme ROI på den samme ramme. Dette vil give hvad der svarer til Meen intensitet i "IntDen", kan du bruge denne værdi til at beregne omregningsfaktoren (svarende til "område"), og plotte "IntDen" af hele-frame ROI mod tiden i sekunder i MS Excel. (J) Klik på "List", kopiere listen over værdier til et Excel-ark og konvertere alle "mean" værdier til "IntDen" værdier. Klik her for at se større billede .

Figur 4.. Korrektion af fotoblegende. Afhængigt af den anvendte probe og billedbehandling indstillinger, kan fotoblegende forekomme. Dette kan i høj grad påvirke resultatet af evalueringen. A) Raw IntDen værdier (i AU) af sonden fra hele rammen er plottet mod tiden i sekunder i MS Excel. Tilføj en lineærtrend-linje.. en klart negativ hældning indikerer tilstedeværelsen af fotoblegende effekt B) Som et eksempel, at anvende den omvendte slop på rå IntDen hjælp korrektionen formel giver det korrigerede IntDen C) berigtiget IntDen værdier delvis kompensation for effekt af fotoblegende. Klik her for at se større billede .

Figur 5. Præsentation af repræsentative celler, kinetik og gennemsnitsberegning af det korrigerede signal. A) BMMs fyldt med dextran probe ved min 0 ved optagelse af IgG-overtrukne kugler er angivet med pilen. Målestokken er 10 um. Svarer til Movie 1 B) 2.5x zoomet indsætte fra en time-lapse film, der skildrer den angivne phagosome over et tidsrum på 85 minutter efter optagelse, falsk-farvet for bedre synlighed med "Thal" Look-up-table (LUT) i ImageJ. Den målte phagosome ROI er angivet med den hvide stiplet linje. De tilfælde af dextran levering og ophobning i phagosome er angivet med hvide pile. C) berigtiget fluorescenssignal af Texas Red 70kDa dextran leveret fra lysosomer til den angivne phagosome. D) i gennemsnit fluorescens IntDen værdier fra 10 phagosomes inden for de to angivne celler ± SEM . Klik her for at se større billede .

Discussion

I det følgende afsnit vil vi diskutere kritiske trin i den fremlagte metode og dens begrænsninger. Endvidere vil vi forbinde nogle af de almindelige problemer med deres løsninger, foretage eventuelle ændringer og overveje fordelene ved vores metode samt egnede supplerende metoder til denne tilgang.

Fremstillingen af ​​perler, herunder koblingen af ​​IgG til perlens overflade er afgørende, og brugen af ​​unfresh præparater bør undgås. I tillæg til det, er det også afgørende, at dextran er tilberedt fra den frosne lager (udvandet og steriliseret) frisk før hvert forsøg. Det er vigtigt, at lastningen af ​​dextran følger en mere præcis tidsplan for at opnå konsekvens i cellulære optagelse og rum fordeling og akkumulering. Desuden er det vigtigt at anvende ikke kun den samme mikroskopi opsætning og software-indstillinger, men også for at holde de perifere betingelser som konstant som muligt (f.eks temperature, CO _2, fugtighed, perle-addition teknik osv.). Et andet kritisk punkt er udvælgelsen af ​​et synsfelt eller cellen af ​​interesse, bør prøven undersøgt før start af billedbehandling for at vælge celler, der er repræsentative.

En af de store begrænsninger i metoden er antallet af forsøg er nødvendige for at give væsentlige prøvestørrelserne. Den beskrevne metode er relativt tid og arbejde intensivt, da antallet af observerbare phagosomes i én synsfelt, afhængigt af den valgte opløsning er begrænset. Pooling af resultaterne af et meget lavt antal tilfældigt udvalgte phagosomes indebærer risiko for, at nogle ekstreme outliers kan have en fremtrædende effekt på gennemsnit værdier. Større stikprøvestørrelser på den anden side vil gøre det muligt maskering af phagosome-til-phagosome eller celle-til-celle variationer.

De fælles problemer, der kan opstå omfatte forureninger, manglende fagocytose og overdreven blegning og fototoksicitet effekt på grund af laserlys.

Sterilitet, korrekt opbevaring og tilberedning af dextran er afgørende for at undgå forureninger. Det er vores erfaring, bør den købte dextran ikke betragtes som en steril opløsning. Risikoen for kontaminering prøven kan reduceres betydeligt ved omfattende centrifugering af bestanden og steril filtrering af fortyndet dextranopløsningen. På den anden side, regelmæssig fremstilling af frisk perlesuspensionen, som indeholder proteiner og er modtagelige for kontaminering, kan også reducere risikoen for forurening.

Mangel på eller lave niveauer af fagocytose kan skyldes suboptimale IgG-coating af perlerne. Derfor er det vigtigt at forberede komponenterne til IgG kobling af vulsten (IgG opløsning, EDAC) frisk og ikke anvende perler, der er mere end 4 uger gamle eller ikke udelukkende er blevet holdt ved 4 ° C. Da perlerne kortvarigt sonikeres før anvendelse, anbefales det at forberedearbejder portioner for at undgå gentagen sonication af bestanden suspension. En anden grund til lavere end forventet fagocytotisk ydeevne kan være usundt, suboptimalt kulturperler eller gamle celler, streng overholdelse anbefalede dyrkningsbetingelser for den anvendte celletype er derfor afgørende. For eksempel kan overdreven trypsinisering under høst skade fagocytiske overfladereceptorer og forringe fagocytisk kapacitet.

Overdreven fotoblegende kan være et stort problem med nogle fluorophores. Justering mikroskop indstillinger, dvs intensiteten af excitationslyset og varigheden af prøven eksponering ifølge blegning modtagelighed af fluoroforen hjælper med at kontrollere blegning. Med hensyn til tidsintervallet mellem anskaffelser af successive rammer, en balance mellem frame-rate, som ved en højere frekvens giver højere tidsmæssig opløsning og bedre åbenbaring vigtige interaktion dynamik og blegning af sonden har to blive ramt. Den optimale balance afhænger primært af de spørgsmål, der skal behandles i den givne eksperiment. Justering scanningsopløsningen, scanning frekvens og linje eller ramme gennemsnitsberegning repræsenterer indstillinger, der kan ændres til yderligere at optimere varigheden af ​​prøven eksponering excitationslyset. Tilgængeligheden af ​​nogle af disse muligheder er imidlertid bestemt af den type mikroskop, der bliver brugt.

De samme generelle retningslinjer bør følges for at minimere foto-toksiske effekt af laser excitation lys på cellerne. Denne effekt kan manifestere sig som død af cellerne udsat for laserlys under billedbehandling eller en markant stigning i unaturlige morfologier ^20.

Her har vi præsenteret en grundlæggende og generel metode, som tillader, at ændringer og tilpasninger til forskellige eksperimentelle indstillinger. Som nævnt, kan denne metode anvendes til tab af funktion undersøgelser såsom i knockout-modellergen knockdown eller mutant protein-ekspression. Det giver også mulighed for forskellige opsonisering strategier til at målrette specifikke fagocytiske receptorer, anvendelsen af ​​forskellige endosomale / lysosomale prober samt undersøgelse af kemiske inhibitorer eller cytokiner.

Overekspression undersøgelser med forskellige fluorescerende fusionsproteiner og deres mutanter kan anvendes til at undersøge virkningerne på levering af en passende probe til phagosomes. Desuden kan analyseres kinetik og dynamik for interaktion af proteinet selv med phagosomes. Der er flere sonder til rådighed, der kan anvendes til disse formål. Et fremtrædende eksempel på fælles klasse af sonder omfatter lysoTracker gruppen af ​​acidotropic farvestoffer, der er almindeligt anvendt til at spore protonisering lumen endosomale rum samt phagosomal lumen. Belægningen af ​​perlerne tilbyder en anden mangfoldighed af muligheder. Ligander, herunder nukleinsyrer, såsom specifikke bindingssteder for CpG for bakteriel DNA ²¹ bakterieriale overflade komponenter såsom LPS, proteiner, såsom avidin, serumproteiner, herunder komplement-faktorer (f.eks C1q eller iC3b) alle kan krydsbindes til perler ^22-24. Dette giver mulighed for studiet af den rolle, disse ligander i fagocytose og phagosome modning. Brug signalmolekyler og immunmediatorer (for eksempel cytokiner) åbne en anden vifte af muligheder.

Endelig kan denne metode også udvides og tilpasses til at foretage direkte undersøgelser med mikroorganismer, for eksempel ved at sammenligne udbredelsen af ​​levende vs dræbt eller patogene vs nonpathogenic bakterier, selv om den uregelmæssige form af bakterier skaber nye udfordringer i løbet af billedanalyse.

Fremtidige anvendelser af denne metode er lige så mangfoldige som de ændringer, der kan anvendes. Som et næste skridt, kan forholdet-metriske analysemetoder tilpasses. Kombination af pH-følsomme og pH-ufølsom fluorescerende farvestoffer til perle-coating, eller gøre brug af enkelte sonder til MMAure phagosomal pH (f.eks pHrodo, FluoProbes) samt stoffer, der gør det muligt eksperimentelt at følge kinetikken af protein og lipid nedbrydning inde fagosomet (fx OVA HRP, bovint serumalbumin og triglycerid lipase substrater) er tilgængelige ^25-31. Disse tilsammen gør det muligt at oprette et utal af efterforskningsmetoder baseret på den grundlæggende metode af levende cell imaging af phagosomes præsenteres her.

Den beskrevne metode kan opnå langt højere tidsmæssige resolutioner i forhold til tilgange, der er baseret på phagosome isolation ^32. ELISA eller Western Blot analyser af phagosomes kan repræsentere et meget stort antal arrangementer på bestemte tidspunkter, men data repræsenterer en langt mere heterogen og potentielt synkroniserede befolkning af begivenheder. Flowcytometri tilgange teoretisk tillade analysen ned til den enkelte celle niveau, og på den måde kan være mindre tilbøjelige til at heterogeneity af cellepopulationer men lignende problem med usikker synkronicitet og behovet for meget høje begivenhed tæller for pålidelig evaluering stadig findes. Ikke desto mindre high throughput, følsomhed og reproducerbarhed flowcytometri nærmer ^33,34 gøre dem en optimal supplement til levende celler tilgang.

Tilsammen den fordel, at vores metode ligger i nøjagtighed og høj tidslig opløsning, som enkelt phagosomes kan følges i deres modningsproces i levende celler. I forhold til alle andre metoder, der begrænser indlæg for færre tidspunkter i levedygtige og forbehandlede celler, er det muligt her at følge cellulære begivenheder dynamisk og kontinuerligt over lange perioder under let modificerbare fysiologiske betingelser. Man kunne definere hændelser i forhold til optagelsen af ​​fagocyterende last, som tillader diskrimination af de trin i fagocytose mere præcist. På den måde, synkronisering gør det muligt at ikke only visualisere lignende adfærd phagosomes, det giver også mulighed identificere individuelle forskelle pga. fx celle-til-celle variationer. Vigtigst er det, kan dynamikken i interaktioner, som kan indeholde nøglen til at forstå komplekse vekselvirkninger effektivt belyst i høj tidslig opløsning ved hjælp af vores live-cell imaging tilgang.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)	PAA, Austria	E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM)	PAA, Austria	E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAA, Austria	A15-151
L-Glutamine	PAA, Austria	M11-004
PBS	PAA, Austria	H15-002
Penicillin/Streptomycin	PAA, Austria	P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5)	WillCo Wells, Netherlands	GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm	Greiner Bio one, Germany	627871	Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres	Polysciences, USA	#09850	Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles	Kisker Biotech, Germany	PPs-3.0COOH
Triton-X 100	ROTH, Germany	305.1.3
mouse whole IgG	Rockland, USA	010-0102
EDAC crosslinker	Sigma-Aldrich, USA	E6383-1g
10 mM Tris	Sigma-Aldrich,USA	T1503
1-ml syringe Omnifix -F	B.Braun, Germany	9161406V
26 G needle (0.45*25 mm)	B.Baun, Germany	4657683
RPMI 1640	PAA, Austria	E15-039
Horse Serum	Gibco, USA	16050-122
MES hydrate	Sigma-Aldrich, USA	M2933
0.2 μM syringe mounted filter	Sartorius, Germany	83.1826.001