Fagocyterende cellen spelen een belangrijke rol in het aangeboren immuunsysteem door het verwijderen en het elimineren van binnendringende micro-organismen in hun fagosomen. Phagosome rijping is de complexe en strak gereguleerd proces waarbij een ontluikende phagosome ondergaat drastische transformatie door middel van goed georkestreerde interacties met verschillende cellulaire organellen en compartimenten in het cytoplasma. Dit proces, dat essentieel is voor de fysiologische functie van fagocyten door begiftigt phagosomes hun lytische en bactericide eigenschappen, afgesloten met fusie van phagosomes met lysosomen en biogenese van phagolysosomes die wordt beschouwd als de laatste en kritieke fase van rijping voor phagosomes zijn. In dit rapport beschrijven we een live cell imaging gebaseerde methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het dynamische proces van lysosoom om content delivery, dat is een kenmerk van fagolysosoom biogenese phagosome. Deze aanpak maakt gebruik van IgG-gecoate microbolletjes als model voor phagocytosis en fluorofoor-geconjugeerde dextran moleculen als een luminale lysosomale lading sonde, om de dynamische levering van lysosmal inhoud aan de phagosomes in real time in levende macrofagen te volgen met behulp van time-lapse imaging en confocale laser scanning microscopie. Hier beschrijven we in detail de achtergrond, de voorbereidende stappen en stap-voor-stap experimentele opstelling gemakkelijke en nauwkeurige plaatsing van deze methode in andere laboratoria mogelijk. De beschreven werkwijze is eenvoudig, robuust, en vooral kan gemakkelijk worden aangepast aan phagosomal interacties en rijping bestuderen verschillende systemen en onder verschillende experimentele opstellingen zoals het gebruik van verschillende typen fagocytische cellen, verlies-van-functie experimenten verschillende probes en fagocytische deeltjes.
Een abonnement op JoVE is vereist om deze inhoud te bekijken. Log in of start vandaag met uw gratis proefperiode.
Methodenartikel
Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen
In dit artikel
Samenvatting
Inleiding
Professionele fagocyten, waaronder macrofagen, spelen een belangrijke in het immuunsysteem. Naast het feit dat de eerste lijn van defensie in het aangeboren immuunsysteem, ze een cruciale rol spelen bij de activering van de adaptieve immuniteit door hun signalering en antigeen-presenterende rol 1-3. Terwijl de functie van professionele fagocyten is veelzijdig, phagosome rijping is de kritische ruggengraat van de bacteriedodende en antigeenverwerking functie van de professionele fagocyten 4,5. Bij de receptor gemedieerde engulfment en opname van een fagocytaire doel, zoals bacteriën, de ontluikende phagosome gaat door een complexe en goed georkes....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Protocol
Verzorging van dieren en alle procedures in dit protocol volgen de institutionele en nationale richtlijnen.
Bereid de preparaten die worden aangeduid met "Π-" vooraf.
1. Bereiding van BMMs
- Voer het doden van de muizen door cervicale dislocatie.
- Verwijder bovenbeen en onderbeen botten, botten en uit weefsel en trim beide uiteinden voor de toegankelijkheid van het beenmerg.
- Houd botten in ijskoude PBS of ijskoude DMEM-medium (aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, op ijs tot de volgende stap.
Opmerking: Voer de volgende stappen in....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Resultaten
De juiste bereiding van de cellen en kralen voor beeldvorming is kritisch. Figuur 1 toont de omtrek van het zaaien, probe-laden en eerste beeldvormende stappen in deze methode, gebaseerd op onze geoptimaliseerde protocol BMMs. Het is derhalve van belang dat het protocol parameters worden getest en geoptimaliseerd, afhankelijk van het type cellen en probes die worden gebruikt.
Na toevoeging van de met IgG beladen kralen om de voorgeladen cellen, is het belangrijk dat het gezi.......
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Discussie
In de volgende paragraaf zullen we bespreken kritische stappen van de gepresenteerde methode en zijn beperkingen. Verder zullen we verbinden een aantal van de meest voorkomende problemen met hun oplossingen, mogelijk wijzigingen aan te brengen en te overwegen de voordelen van onze methode alsmede geschikte complementaire methoden voor deze aanpak.
De bereiding van de korrels, zoals de koppeling van IgG aan de korrel oppervlak is cruciaal en het gebruik van unfresh preparaten worden vermeden........
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Openbaarmakingen
De auteurs hebben niets te onthullen.
Dankbetuigingen
Wij danken de leden van de phagosome Biology Laboratory voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door een Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative en Netwerken fondsen van de Helmholtz Association) en een Prioriteit Programma SPP1580 Grant van de Duitse Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).
....Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Materialen
| Naam | Bedrijf | Catalogusnummer | Opmerkingen |
|---|---|---|---|
| Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) | PAA, Oostenrijk | E15-009 | |
| Dulbecco's Modified Eagles Medium zonder fenol rood (D-MEM) | PAA, Oostenrijk | E15-047 | |
| Fetaal bovien serum (FBS) | PAA, Oostenrijk | A15-151 | |
| L-Glutamine | PAA, Oostenrijk | M11-004 | |
| PBS | PAA, Oostenrijk | H15-002 | |
| Penicilline/Streptomycine | PAA, Oostenrijk | P11-010 | |
| WillCo-dish® Glasbodemschaal (35 mm ∅, #1.5) | WillCo Wells, Nederland | GWSt-3522 | |
| CELLviewTM glasbodemschaal, 35 mm | Greiner Bio one, Duitsland | 627871 | Alternatief: Beschikbaar als gesegmenteerd |
| Carboxylerde latex microsferen | Polysciences, USA | #09850 | Beschikbaar in verschillende diameters, we gebruikten 3 μm |
| Polystyreen microdeeltjes | Kisker Biotech, Duitsland | PPs-3.0COOH | |
| Triton-X 100 | ROTH, Duitsland | 305.1.3 | |
| muis geheel IgG | Rockland, USA | 010-0102 | |
| EDAC crosslinker | Sigma-Aldrich, USA | E6383-1g | |
| 10 mM Tris | Sigma-Aldrich,USA | T1503 | |
| 1-ml spuit Omnifix -F | B.Braun, Duitsland | 9161406V | |
| 26 G naald (0.45*25 mm) | B.Baun, Duitsland | 4657683 | |
| RPMI 1640 | PAA, Oostenrijk | E15-039 | |
| Paarden serum | Gibco, USA | 16050-122 | |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich, USA | M2933 | |
| 0,2 μM spuit gemonteerde filter | Sartorius, Duitsland | 83.1826.001 |
Referenties
- Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
- Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
- Iwasaki, A., Medzhit....
Toegang beperkt. Log in of start een proefperiode om deze inhoud te bekijken.
Herprints en machtigingen
