Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen

Published: March 10, 2014 doi: 10.3791/51201
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

Abstract

Fagocyterende cellen spelen een belangrijke rol in het aangeboren immuunsysteem door het verwijderen en het elimineren van binnendringende micro-organismen in hun fagosomen. Phagosome rijping is de complexe en strak gereguleerd proces waarbij een ontluikende phagosome ondergaat drastische transformatie door middel van goed georkestreerde interacties met verschillende cellulaire organellen en compartimenten in het cytoplasma. Dit proces, dat essentieel is voor de fysiologische functie van fagocyten door begiftigt phagosomes hun lytische en bactericide eigenschappen, afgesloten met fusie van phagosomes met lysosomen en biogenese van phagolysosomes die wordt beschouwd als de laatste en kritieke fase van rijping voor phagosomes zijn. In dit rapport beschrijven we een live cell imaging gebaseerde methode voor de kwalitatieve en kwantitatieve analyse van het dynamische proces van lysosoom om content delivery, dat is een kenmerk van fagolysosoom biogenese phagosome. Deze aanpak maakt gebruik van IgG-gecoate microbolletjes als model voor phagocytosis en fluorofoor-geconjugeerde dextran moleculen als een luminale lysosomale lading sonde, om de dynamische levering van lysosmal inhoud aan de phagosomes in real time in levende macrofagen te volgen met behulp van time-lapse imaging en confocale laser scanning microscopie. Hier beschrijven we in detail de achtergrond, de voorbereidende stappen en stap-voor-stap experimentele opstelling gemakkelijke en nauwkeurige plaatsing van deze methode in andere laboratoria mogelijk. De beschreven werkwijze is eenvoudig, robuust, en vooral kan gemakkelijk worden aangepast aan phagosomal interacties en rijping bestuderen verschillende systemen en onder verschillende experimentele opstellingen zoals het gebruik van verschillende typen fagocytische cellen, verlies-van-functie experimenten verschillende probes en fagocytische deeltjes.

Introduction

Professionele fagocyten, waaronder macrofagen, spelen een belangrijke in het immuunsysteem. Naast het feit dat de eerste lijn van defensie in het aangeboren immuunsysteem, ze een cruciale rol spelen bij de activering van de adaptieve immuniteit door hun signalering en antigeen-presenterende rol 1-3. Terwijl de functie van professionele fagocyten is veelzijdig, phagosome rijping is de kritische ruggengraat van de bacteriedodende en antigeenverwerking functie van de professionele fagocyten 4,5. Bij de receptor gemedieerde engulfment en opname van een fagocytaire doel, zoals bacteriën, de ontluikende phagosome gaat door een complexe en goed georkestreerde opeenvolging van interactie en uitwisseling met compartimenten van de endocytische netwerk en verscheidene andere celorganellen 6. De aard van de verbindingen uitgewisseld met deze cellulaire entiteiten evenals de verordening en de timing van de fusie gebeurtenissen bepaalt de luminale phagosomal milieu en de phagosomal membraansamenstelling en dus 7, het lot van de rijping phagosome 8.

De fysiologische relevantie van phagosome rijping wordt geïllustreerd door de verschillende strategieën die door diverse intracellulaire pathogenen om te ontsnappen aan, arrestatie of ondermijnen phagosome rijping 9. De meeste strategieën rechtstreeks verhinderen de laatste en kritieke fase van phagosome rijpingsproces: de fusie van phagosome met late endosomale / lysosomale compartimenten, die hen begiftigt met het grootste deel van de hydrolytische enzymen en antibacteriële factoren van een volwassen phagosome 7 , 8,10. Analyse van deze laatste en cruciale stap daarom kan ons sterke indicatoren over de staat van rijping van de phagosomes en als de natuurlijke fysiologische toestand wordt positief of negatief beïnvloed onder de specifieke experimentele instellingen die worden gebruikt.

De late endosomale / lysosomale compartiments worden algemeen beschouwd de terminal compartimenten van de endocytische route, bepaald en onderscheiden van de vroege endocytische compartimenten door de aanwezigheid van verschillende, fase specifieke marker moleculen. Bijvoorbeeld hydrolytische enzymen of membraan componenten zoals Lysosomal geassocieerd membraaneiwitten (lampen) onder anderen 11. De terminal endocytisch compartimenten-voortaan kortweg lysosomen-ook dienen als de belangrijkste locatie voor de laatste fasen van de spijsvertering aan het einde van de fagocytaire / endocytische route 12. Zo kan verteerbare sondes door endocytose en macropinocytose het extracellulaire milieu geladen en getransporteerd door de endocytische route naar lysosomen, waar het zich ophoopt 13,14 na na een bepaalde cyclus van opname en jacht. Fluorofoor geconjugeerde probes voor fluorescentiemicroscopie zoals organische verteerbare polymeer dextran worden vaak gebruikt als endocyticprobes 15-17.

14,18.

Na de beschrijving van onze werkwijze kunnen analoge experimenten ontworpen met gewijzigde instellingen factoren en hun invloed op phagosome rijping onderzoeken; vrijwel elke othaar type hechtende primaire of cellijn fagocytcellen, genetische verlies van functie experimenten, inclusief gen knock-out en knock-down, mutanten of expressie van fusie-eiwitten, fagocytaire-doelstellingen, microbead deklaagmengelingen, endosomale / lysosomale sondes en factoren zoals een cytokines, chemische inhibitoren of siRNA onder andere variabelen zijn die kunnen worden toegepast op de basisbenadering van deze methode.

We definiëren het doel en de fundamentele eisen van deze methode als volgt:

  • Doel van de methode: de directe, kwantitatieve en kwalitatieve observatie en analyse van phagosome rijping met een hoge temporele resolutie in levende fagocytcellen schakelen.
  • Fagocytische lading: Een ter zake gecoat microdeeltjes of biologische doel. Hier gebruiken we IgG-coated 3 micrometer sferische polystyreen microdeeltjes die gemakkelijk worden geïnternaliseerd via de Fc-γ receptor gemedieerde fagocytose. Als alternatief kan elk micro-organisme of gecoat microparticle waarvoor fagocytische receptor aanwezig is op de cellen kan worden gebruikt.
  • Fagocyten: Hechtende fagocytische cellen die de juiste fagocytische receptoren. Hier gebruiken we de muis primaire BMMs die overvloedig de Fc-γ receptoren. Als alternatief zou dendritische cellen (DC), monocyten of fagocytaire epitheelcellen of hun genetische mutanten of knock-out varianten worden gebruikt.
  • Lysosomale lading: Een fluorescent gelabelde lysosomale probe. Hier is Texas Red-geconjugeerd 70.000 kiloDalton dextran (Dex70kD) als het luminale lading van de lysosomen. Als alternatief kan elk fluorescent detecteerbare merker of een cellulair compartiment of organel, of een geschikte probe voor phagosomal eigenschappen zoals zuurgraad of afbrekende capaciteit kan worden gebruikt om de progressie van phagosome rijping bestuderen.
  • Beïnvloedende factoren: bijvoorbeeld signaalmoleculen, chemische verbindingen, gen knock-down, of transiënte expressie van mutante eiwitten kon. Hier hebben we Förgeen het gebruik van een dergelijke factor voor de eenvoud maar een recent voorbeeld met mutant eiwitexpressie en neerhalen invloedsfactoren zie Kasmapour et al.. 18 Elke factor die invloed fagocytose of de omstandigheden en mobiliteit van phagosomes en / of de compartimenten die interageren met rijping phagosomes zou kunnen worden gebruikt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Verzorging van dieren en alle procedures in dit protocol volgen de institutionele en nationale richtlijnen.

Bereid de preparaten die worden aangeduid met "Π-" vooraf.

1. Bereiding van BMMs

  1. Voer het doden van de muizen door cervicale dislocatie.
  2. Verwijder bovenbeen en onderbeen botten, botten en uit weefsel en trim beide uiteinden voor de toegankelijkheid van het beenmerg.
  3. Houd botten in ijskoude PBS of ijskoude DMEM-medium (aangevuld met 100 U / ml penicilline en 100 ug / ml streptomycine, op ijs tot de volgende stap.
    Opmerking: Voer de volgende stappen in een klasse II bioveiligheid kast om het risico van verontreiniging te minimaliseren.
  4. Spoel de mergholte met koud PBS + penicilline / streptomycine met een 26 G (0,45 mm) naald bevestigd aan een 1 ml spuit.
  5. Pellet cellen door voorzichtig centrifugeren bij 350 xg gedurende 10 min, resuspendeer de pellet in BMM medium en plaat in steriele microbiologie niet-beklede petrischaaltjes.
    1. Voorbereiding van de BMM medium
      • Dulbecco's gemodificeerd Eagles Medium DMEM
      • 10% geïnactiveerd FCS
      • 20% muisfibroblast L929 cellijn kweeksupernatant (bron van macrofaag-kolonie stimulerende factor, M-CSF)
      • 5% paard serum
      • 2 mM glutamine
    2. Voorbereiding van de L929 cellijn kweekmedium;
      • RPMI (Roswell Park Memorial Institute) 1640-medium
      • 10% geïnactiveerd FCS
      • 2 mM glutamine
    3. Voorbereiding van de muis fibroblast L929 cellijn kweeksupernatans;
      • Confluente L929 cellen werden 1:4, gekweekt in 175 cm2 kolven gedurende 2 dagen met 20 ml L929 medium en de kweeksupernatant werd gewonnen na 48 uur, gefiltreerd en toegevoegd aan de BMM-medium
  6. Incubeer de cellen gespoeld uithet femur in een incubator bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer.
  7. Na iedere 48 uur (maximaal 72 uur) van incubatie, zuig het medium en vervangen door verse BMM medium, voor maximaal 10 dagen. Meer dan 95% van de cellen positief voor CD14 zoals getest door flowcytometrie. CD14 is een pattern recognition receptor vooral tot uitdrukking door macrofagen. Door het percentage cellen positief voor deze receptor heeft een zuivere kweek van hechtende BMMs gegenereerd.

Opmerking: de voorbereiding en de cultuur van de cellen dienovereenkomstig als andere celtypes worden gebruikt.

2. Coating van Microbeads als Fagocytische Cargo

  1. Voor de bereiding van 1 ml kralensuspensie Gebruik 400 gl 2,5% 3 urn gecarboxyleerd polystyreen microdeeltjes of andere microdeeltjes.
  2. Breng de kralensuspensie een 1,5 ml microcentrifugebuis, 3x wassen met PBS en voeg 100 ul van 500 mM 2 - (N-morfolino) ethanenulfonic natriumzout, MES buffer bij pH 6,7 om de hiel pellet.
  3. Los op 50 ug muis IgG (polyklonaal IgG antilichaam) in 50 ul steriele DDH 2 O en toe te voegen aan de kraal schorsing.
  4. Vul de schorsing tot 1 ml met een steriele DDH 2 O (450 pl).
  5. Incubeer de oplossing gedurende 15 min op een roterend wiel bij kamertemperatuur.
  6. Bereid EDAC verknopingsmiddel, N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimidehydrochloride in een concentratie van 10 mg / ml en voeg 14 ul aan de parelsuspensie.
    Opmerking: EDAC verknopingen aminogroepen van het IgG met de carboxylgroepen op het oppervlak van de kralen en vergemakkelijkt de immobilisatie van het IgG op de korrel oppervlak. Dit is essentieel voor kraal opname en derhalve moet vers worden bereid.
  7. Incubeer de suspensie op een roterend wiel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
  8. Voeg 14 ul van EDAC verknoper en incubeer de suspensie op een roterend wiel gedurende 1 uur bij KT.
  9. Centrifugeer de suspensie bij 10.000 g gedurende 2 minuten in een microcentrifuge.
  10. Was de korrels 3x in stopbuffer (1% Triton X-100 in 10 mM Tris, pH 9,4) om de verknopingsreactie te stoppen door resuspenderen van de pellet in stopbuffer en centrifugeren van de oplossing bij 10.000 g gedurende 2 minuten.
  11. Was kralen 3x in PBS en resuspendeer de pellet in 1 ml PBS.
    Optioneel: Bereid werken porties van 30-50 pl.
  12. Slaan de IgG-coated kraal suspensie bij 4 ° C niet langer dan 4 weken en nooit toestaan ​​dat de schorsing te worden bevroren.

Opmerking: Een conserveermiddel zoals natriumazide in een eindconcentratie van 0,02% (w / v) kan worden toegevoegd aan de suspensie bacteriegroei en besmetting te voorkomen. In dit geval wassen van de bolletjes vóór het gebruik worden uitgevoerd om cytotoxische effecten van het conserveermiddel voorkomen. Centrifugeer een hoeveelheid van de suspensie bij 10.000 g gedurende 2 min en was de kralen door reschorsing van de pellet in PBS. Herhaal het wassen 3x.

3. Bereiding van de dextran Probe voorraadoplossing

  1. Los het Texas Red 70.000 kiloDalton Dextran (Dex70kD) in PBS bij 20 mg / ml en bewaar bij -20 ° C, volgens de instructies van de fabrikant.
    Opmerking: Houd de voorraden bij -20 ° C tot enkele maanden, of bij 4 ° C gedurende enkele weken, zie de documentatie fabrikanten.
  2. Bereid de dextran oplossing voor het experiment van de voorraad door verdunnen volledig DMEM celkweekmedium (DMEM, 10% FCS, 2 mM L-glutamine) bij ongeveer 1 mg / ml (aantal maal geconcentreerde oplossing worden verdund tot de uiteindelijke werking concentratie van 20 ug / ml voorafgaande aan toevoeging aan de cellen).
  3. Gebruik een ultrasoon waterbad om de dextran hoeveelheid ultrasone trillingen gedurende 5 minuten om de oplossing te homogeniseren en los aggregaten die later kunnen leiden tot artefact generatie tijdens de beeldvorming.
  4. Centrifugeer bij maximale ggedurende 5 min in een microcentrifuge om eventuele onopgeloste bosjes of verontreinigingen uit de oplossing te verwijderen.
  5. Duw de supernatant naar een nieuwe buis waardoor in pellet op de bodem van de buis en verdun de oplossing voor de uiteindelijke werking concentratie van 20 ug / ml volledig DMEM celkweekmedium.
  6. Filter-steriele de oplossing om met een 0,2 um spuit gemonteerd filter.

4. Dextran Preloading

  1. Zaadcellen in een live cell imaging glazen bodem schaal en incubeer gedurende ten minste 12 uur (bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer) het beslag en acclimatisatie waarborgen.
    Let op: Er zijn gesegmenteerd glazen bodem gerechten beschikbaar die het mogelijk maken het uitvoeren van meerdere experimenten (maximaal vier compartimenten) per schotel.
  2. Bereid de dextran in DMEM oplossing zoals beschreven in protocol 3. Warm de bereide dextran in DMEM oplossing, met behulp van een waterbad bij 37 ° C.
  3. Aspireren medium eennd voeg dextranoplossing aan de cellen voorzichtig en incubeer bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer gedurende 2-8 uur voor opname.
    Opmerking: Plan en optimaliseren protocol gebaseerd op de sonde en celtype dat wordt gebruikt en strikt houden deze duur bij het ​​herhalen van experimenten. Dit is essentieel voor het profiel van dextran accumulatie in de endocytische route en dus reproduceerbaarheid experimenten.
  4. Was de cellen 3x met voorverwarmde compleet DMEM medium; aspireren medium en spoel cellen zorgvuldig met vers medium.
  5. Incubeer cellen met volledige DMEM medium voor 4-12 uur bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer.
  6. Was de cellen eenmaal met voorverwarmde compleet gefilterd fenol rood-vrij DMEM medium.
  7. Voor optimale weergaveresultaten, wijziging voorverwarmde volledig gefilterde fenolrood-vrij DMEM medium ten minste 30 minuten voorafgaand aan beeldvorming. Fenolrood kunnen blussen van fluorescerende signalen veroorzaken, verhogen van achtergrondgeluiden endus beeldcontrast en de helderheid te verminderen.

Opmerking: Stel de microscoop en de beeldvorming instellingen vooraf volgens vooraf geplande en geoptimaliseerd protocol gebaseerd op het type sonde en cellen die worden gebruikt.

5. Toevoegen IgG-beklede kralen

  1. Equilibreer een hoeveelheid van preprepared 1% kraal schorsing tot kamertemperatuur en ultrasone trillingen in een ultrasoon waterbad gedurende 2-3 minuten.
  2. Voeg 1-6 ul van de 1% kralensuspensie het volledige gefilterde fenolrood-vrij DMEM medium in een klasse II bioveiligheid kast besmettingsgevaar (een goed uitgangspunt concentratie 1 ul / 2 cm2 schaal oppervlak) te minimaliseren.
    Opmerking: Hier BMMs werden uitgezaaid met 25.000 cellen / putje en 6 ui 1% stock kraal suspensie aan het medium toegevoegd in de schotel. Dit komt overeen met ongeveer een kraal / cel verhouding van 15:01. De verhouding moet worden aangepast aan de aard van de cellen die wordt gebruikt en de hiel materiaal i.e. latex kralen hebben lage dichtheid en niet snel bezinken, terwijl polystyreen korrels zinken en in contact met de hechtende cellen veel sneller en dus in grotere aantallen.
    Opmerking: Afhankelijk van het experiment, kan het voordelig zijn om de regio die zal worden waargenomen vooraf te selecteren. Kraal schorsing kan dan alleen worden toegevoegd aan die specifieke regio van de glazen bodem schaal, dus het vergroten van de kans op het waarnemen van gunstige opname gebeurtenissen.
  3. De dichte wolk van kralen kan worden verspreid door de pipet voorzichtig de suspensie in de glazen bodem schaal.
  4. Wacht tot korrels zinken naar de bodem van de glazen bodem schaal en zijn ongeveer in hetzelfde vlak met de hechtende fagocyten.
  5. Focus op de regio van belang (ROI) en start de time-lapse imaging.

Opmerking: Het kan nodig zijn om de nadruk te verfijnen terwijl beeldvorming wordt uitgevoerd, afhankelijk van het beeldvormingssysteem dat wordt gebruikt, de stadelijkheid en de mobiliteit van de cellen waargenomen. Merk echter op dat dit onmogelijk kan maken, de juiste analyse van phagosomes die sterk afwijken van het vlak van focus als gevolg van de heroriëntatie.

6. Imaging

Volg de algemene richtlijnen hieronder voor een optimale beeldkwaliteit;

  1. Gebruik een confocale beeldvormingssysteem zoals een laser-scanning of draaiende schijf systeem.
    Opmerking: Een Leica TCS SP5 AOB Laser scanning confocale microscoop gecontroleerd door de Leica LAS AF software en uitgerust met een milieu-regelkamer werd hier gebruikt voor time-lapse video beeldvorming.
  2. Optimaliseer de imaging-instellingen, zoals scansnelheid, vergroting, resolutie, enz. op een wijze zodat een snelheid van een frame in elke 7-20 seconden, afhankelijk van het toegepaste systeem.
    Opmerking: Hier, een 200 Hz scansnelheid, 2x scanner zoom en een lijn middeling van 2-3x op een resolutie van 512 x 512 pixels automalted in een opnameduur tussen 3-5 sec / rame. Een tarief van een frame in elke 10 seconden werd gebruikt om time-lapse video-opnamen maken met een duur van ten minste 120 minuten.
  3. Gebruik de juiste excitatie / emissie-instellingen op basis van de gebruikte imaging-systeem en sonde (s).
    1. De instellingen optimaliseren om overmatige fotoblekingsreactie voorkomen.
      Opmerking: Hier, de Texas Red dextran 70 kd was enthousiast met behulp van een DPSS (561 nm) laser en emissie licht werd gedetecteerd door een Leica hybride detector (hyd) bij 600-650 nm met de emissie piek bij 610 nm. Laserintensiteit moet worden aangepast aan de signaalintensiteit en bleef zo ​​laag mogelijk fotoblekingsreactie van de fluorofoor (s) en foto-toxisch effect van het laserlicht op de cellen te minimaliseren. In het algemeen is het belangrijk om de scansnelheid lijn middeling, scanresolutie, rasterinterval en duur van het beeldvormende evenwicht een goede en stabiele signaalintensiteit verkrijgen en vastleggen van de volledige duur van de kraal opname en phagosome rijping proproces.
  4. Onder andere een bright-field (BF) kanaal voor het observeren van de kralen als ze niet geconjugeerd met een fluorofoor.
    Opmerking: Aan de Texas Red kanaal werd BF kanaal gebruikt om de kralen te visualiseren, werd dezelfde DPSS laser gebruikt als lichtbron en signaal werd gedetecteerd met een fotovermenigvuldiger (PMT) detector.
    Opmerking: Zorg ervoor dat u dezelfde opname-instellingen toe te passen bij de verwerving van gegevens die moeten worden verzameld. Belangrijkste parameters zijn: excitatie laser intensiteiten, detector instelling, acquisitie instellingen, vergroting en frame intervallen. Het niet gebruiken van identieke kader intervallen zal een curve-middeling stap noodzakelijk als de observatiegegevens punten elkaar niet overlappen (bijvoorbeeld om een ​​observatie met frames verworven bij elke 7 sec met een andere set met frames op elke 12 sec verzamelen). Dit zou verhoging van de stappen die nodig zijn voor data-evaluatie en vereisen extra software met curve-middelingsfunctie, zoals OriginLab 's Origin Pro statistiek software ( http://www.originlab.com/ ).
  5. Voorkeur, sparen de time-lapse video in het eigen bestandssysteem-formaat van de gebruikte beeldvormende systeem en voorkom exporteurs in gecomprimeerde formaten.

Opmerking: Hier werden time-lapse filmpjes opgeslagen in de inheemse Leica LAS AF-bestanden, die vervolgens rechtstreeks werden ingevoerd om te openen in Fiji (LIF.). Fiji is in staat om de oorspronkelijke bestandsindelingen lezen van de meeste microscoop fabrikanten die gebruik maken van de meegeleverde Bio formaten importeur plug-in. Exporteren van de time-lapse film bestand in een reeks beelden met JPG-of TIFF-of als een videobestand in een AVI container formaat is niet nodig of aanbevolen. Naast het behoud van de best mogelijke beeldkwaliteit van de oorspronkelijke waarneming door het vermijden van lossy compressie algoritmen (bijv. JPEG), met behulp van de inheemse microscoop bestandsformaat zorgt ervoor dat meta-data van het bestand (tijdstempels, vergroting, laser-en overname intensiteiten, Detectorinstellingen etc.) wordt bewaard en ter beschikking van Fiji. Echter, als om welke reden dan ook, time-lapse video-bestanden die worden uitgevoerd in een ander formaat voor analyse, zorg ervoor om niet-gecomprimeerde bestandsformaten zoals TIFF-serie en aparte RGB-kleur (rood, groen, blauw) kanalen reeds in dit gebruiken stap, zoals Fiji vaak niet met succes de BF kanaal gescheiden van andere kleur kanalen in geëxporteerde bestanden. Zorg er ook voor om de oorspronkelijke microscoop bestanden te bewaren als referentie.

7. Analyse van de Time-lapse films

  1. Gebruik ImageJ, Fiji of andere software die een analoge signaal vereniging analysemogelijkheden biedt.
    Opmerking: Hier, werd Fiji gebruikt voor de analyse van time-lapse filmpjes. Fiji is een ImageJ distributie die een beeld processing pakket met gereorganiseerd gereedschap menu's en extra eigen plug-ins, beschikbaar als gratis download op http://fiji.sc . De in deze sekte beschreven procesion is afgebeeld in figuur 2.
  2. Open het bestand in Fiji door te klikken op "File", "Open" en het kiezen van het bestand, of door te slepen en het bestand naar Fiji.
  3. Kies de volgende opties;
    1. Stack bekijken: Bekijk stack met HyperStack,
    2. Kleur opties: Kleur-modus Colorized,
    3. Gesplitst kanalen in aparte vensters: Split kanalen (voor elke RGB-kleur-kanaal dat werd opgenomen een apart venster wordt geopend).
  4. In het geval dat een reeks beelden wordt gebruikt, laadt de serie naar Fiji door te gaan naar "File", "Import", "Image Sequence" en kies een beeldbestand in de map die het doelwit afbeelding serie bevat.
    1. Set filters en voorwaarden voor het laden geselecteerde beelden in de serie, bijvoorbeeld;
      1. Aantal beelden: hoeveel frames moeten worden geladen.
      2. Eerste beeld: welk beeld is het uitgangspunt beeld van de serie.
      3. Toename: de toename tussenframes worden geladen (elk frame, elke tweede frame, enz.).
      4. Bestandsnaam: filteren voor specifieke kanaal met de naam van het bestand (bijvoorbeeld door het instellen van "C001", dat is hoe normaal de beelden van "kanaal 1" zijn gelabeld na kleur-scheiding van een multichannel time-lapse video).
  5. Verwijder de schalen door te gaan naar "Analyze", "Set schaal ...", het vakje "Global" en klikken op "Klik om schilfers te verwijderen".
    Opmerking: deze stap kunnen pixels gebaseerde analyse van de beeldvorming bij verschillende vergrotingen zijn gebruikt voor de verschillende experimentele sets die worden geëvalueerd. Als de vergroter instellingen altijd constant hebben gehouden zijn en de inheemse microscoop bestand werd direct naar Fiji geïmporteerd, kan deze stap worden overgeslagen, zoals Fiji de vergroting en schaal gegevens van metagegevens de microscoop bestand kunnen begrijpen en gebruiken.
  6. Opgezet meetparameters door te gaan naar "Analyze", "Set Metingen" en het controleren van de volgende vakken: "Area", "standaarddeviatie", "geïntegreerde dichtheid", "Toon label" en "Mean grijswaarde".
  7. Omleiden naar de kleur kanaal dat het signaal bevat van de sonde die moet worden gemeten en bevestig met "OK".
  8. Naar het frame waarin de metingen worden gestart en selecteer BF kanaalvenster door op de bovenrand van het venster.
  9. Gebruik de "ovale selectie gereedschap" om een regio van belang (ROI) te kiezen, dat wil zeggen een cirkelvormige ROI op de geïnternaliseerde kraal. Zorg ervoor dat de selectie strak gemonteerd op de buitenrand van de hiel zichtbaar in de BF kanaal.
    Opmerking: Bij gebruik van een PC, houdt u de Shift-toets ingedrukt terwijl u met behulp van de selectie-instrument om een cirkelvormige ROI te garanderen.
  10. Start de meting optimaal een paar frames voor de volledige blootstelling van de kraal is voltooid en noteer deframe waarin een volledig gevormd ontluikende kraal-phagosome gevormd en fagocytische beker gesloten. Dit moet vrij duidelijk waarneembaar in het BF kanaal.
  11. Ga naar "Analyze" en klik op "Measure" om de meting uit te voeren, het resultaat wordt weergegeven in een apart venster met de titel "Results".
  12. Ga naar het volgende frame, past u de positie van de ROI in het geval de kraal is verhuisd, en herhaal de meting. Het resultaat wordt toegevoegd aan de lijst in het zichtvenster, elk geanalyseerd frame kan worden geïdentificeerd op basis van de waarde in het "label" kolom.
    Opmerking: Het gebruik van sneltoetsen (bijv. "M" for measure) aanzienlijk kan versnellen het evaluatieproces, zie de lijst met snelkoppelingen en toewijzen kostuum degenen onder het menu "Plugins".
  13. Na de meting van alle relevante frames, kunnen de resultaten worden gekopieerd naar een spreadsheetprogramma zoals MS Excel. De kolom "IntDen" schildert de intensities van het geselecteerde gebied in het kanaal dat de meting werd doorgestuurd naar.

8. Bleken Correctie

Afhankelijk van de gebruikte probe en imaging instellingen kan fotoblekingsreactie optreden. Afhankelijk van de omvang, kan dit sterke invloed op de uitkomst van de evaluatie. Echter, kan dit effect gedeeltelijk worden gecorrigeerd door toepassing van een gelijke, tegengestelde snelheid van verandering van de gemeten waarden. Indien aanwezig kan de fotoblekingsreactie coëfficiënt wordt berekend door het meten van de tijdsafhankelijke signaalintensiteit afname van het gehele frame, of specifiek bijgesneden deel van het beeld, tijdens de tijdspanne tot analyse van elk phagosome relevant. Dit proces is weergegeven in figuren 3 en 4.

  1. Onder de "Plugins" menu van Fiji, gebruik dan de "Time Series Analyzer" plug-in met de algemene daling in de hele-frame, of ROI specifieke probe signaal intensiteit in de tijd (figuur 3 te bepalen).
    Opmerking: Time Series Analyzer plug-in is beschikbaar voor download op http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html , indien niet reeds aanwezig zijn in het Plugins menu.
  2. Plot de meting tegen de tijd (in seconden) in MS Excel, alleen de frames die overeenkomen met de frames van een geanalyseerd phagosome.
  3. Breng een lineaire trend-lijn (Figuur 4A) aan de plot, een negatieve helling voor de dalende signaal duidt op de aanwezigheid van foto-bleken effect.
  4. Breng de omgekeerde helling naar waarden uit een geanalyseerd phagosome (Figuren 4B en 4C): gerectificeerd signaalintensiteit (SI) = ruwe SI + (tijd in seconden * omgekeerde helling)

Opmerking: elke afzonderlijke geanalyseerd phagosome zal een bepaalde tijdspanne (beginnend bij volledige opname frame) tijdens een opgenomen time-lapse filmpje, de foto-bleaching moet worden herberekend voor die specifieke overspanning en zal slechts geldig voor het corrigeren van de gemeten waarden van die specifieke phagosome.

9. Evaluatie van de gegevens

  1. Verzamelen van de gegevens en bereken het gemiddelde en statistische fout van de-bleken gecorrigeerde waarden in de juiste software.
  2. Plot de geanalyseerde gegevens in een passende vorm.

Opmerking: Hier, de wetenschappelijke statistieken en plotsoftware GraphPad Prism ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) werd gebruikt. Prism software is in staat om het genereren en plot een gemiddelde curve met de bijbehorende fout indicatoren zolang alle gegevens hebben dezelfde frame rate (dwz alle met werden verworven op dezelfde tijdstippen, zoals een frame om de 10 sec).

Opmerking: Grote verschillen van de absolute SI waarden binnen herhalingen van dezelfde experiment set zal zeer grote statistische fout introduceren en maken de gegevens onbruikbaar. Dit kan het geval zijn als het protocol, zoals beeldvorming instellingen, niet strikt identiek is tussen de verschillende experiment herhalingen die worden verzameld worden gehouden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

De juiste bereiding van de cellen en kralen voor beeldvorming is kritisch. Figuur 1 toont de omtrek van het zaaien, probe-laden en eerste beeldvormende stappen in deze methode, gebaseerd op onze geoptimaliseerde protocol BMMs. Het is derhalve van belang dat het protocol parameters worden getest en geoptimaliseerd, afhankelijk van het type cellen en probes die worden gebruikt.

Na toevoeging van de met IgG beladen kralen om de voorgeladen cellen, is het belangrijk dat het gezichtsveld wordt gekozen op een wijze die het grootste aantal potentiële opname gebeurtenissen in het grootste aantal cellen mogelijke verschaffen, terwijl de vooraf gedefinieerde vergrotingsinstelling van het protocol. Zoals weergegeven in figuur 2, kan deze aanpak voor een groter aantal analyseerbaar phagosomes per time-lapse video. Naast het verhogen van de gegevenspunten per video opbrengst van elk experiment set Dit vermindert de variatie geïntroduceerd door het variëren peripheral omstandigheden en verhoogt de robuustheid van de gegevens.

Het wordt aanbevolen dat de signaal-vereniging meetprocedure (figuur 2) door dezelfde persoon en op een blinde manier indien mogelijk worden uitgevoerd. Dit kan helpen om de fouten te verminderen door het elimineren van meerdere persoonlijke foutenbronnen en vermindering van de voorspanning, als ROI toegewezen aan elke phagosome wordt geselecteerd en verplaatst handmatig na elk frame.

Hoewel uiteraard de regel "hoe groter de steekproef, hoe beter" geldt hier ook, vermijden we gaan meer dan 5 bead-phagosome per cel in het gezichtsveld te voorkomen al te veel gewicht een cel als het gedrag van alle cellen in dezelfde cultuur niet noodzakelijkerwijs homogeen 19. Deze phagosomes moeten willekeurig zoveel mogelijk worden gekozen. In dit verband parameters zoals phagosomes zijnde volledig zichtbaar in het brandvlak voor de gehele duur van beeldvorming en evenmin wordtvan buitensporige photo bleken essentieel. Bovendien terughalen van een groot aantal grote deeltjes door een enkele cel kan invloed hebben op de fusie dynamiek voor de phagosomes in die cel, zodat de prioriteit moet worden gegeven aan de phagosomes die eerder in het proces door een relatief "lege cel" worden uptaken. Als algemene regel geldt dat de metingen op basis van ten minste vijf cellen van maximaal vijf onafhankelijke experimenten (dus tot 25 phagosomes) zorgen voor een goede statistische significantie.

De toepassing van tijdreeksanalyse of een vergelijkbare methode om een eventuele fotoblekingsreactie effect (Figuur 3) te detecteren is zeer belangrijk, omdat sommige probes zullen lijden sterk bleken terwijl sommige zeer foto-stable. De fotoblekingsreactie correctieniveau (figuur 4) te worden toegepast als een sterk blekende effect waargenomen in alle experimenten met dezelfde probe. Er zij opgemerkt dat dit proces kan slechts gedeeltelijk juisthet effect van bleken. Belangrijk is, kan overmatige bleken slechts in enkele gevallen een teken van nonoptimal omstandigheden, zoals verkeerde excitatie of imaging-instellingen, verkeerde medium pH, ongezonde cellen, of nonfresh reagentia.

In figuur 5C, de kraal-phagosome aangegeven met een pijl in de figuur 5A en figuur 5B, is geanalyseerd en de Dex70kD signaalintensiteit (SI) vereniging rijpen phagosome gedurende een tijdsbestek van 90 min wordt uitgezet. De geluidsbron in de curve lijst variaties van het gemeten signaal kader door factoren zoals obstructie van de geanalyseerde phagosome andere phagosome en brandpuntsvlak schommelingen. Echter, de temporele trend van het signaal vereniging phagosome is direct duidelijk. Na het middelen van de analyse van 10 phagosomes van de twee cellen zichtbaar in figuur 5A, kan een gemiddelde curve uitgezet (figuur 5D) waarvoor de statistische error kan worden uitgezet als de standaardfout van het gemiddelde (SEM) of de standaarddeviatie (SD), afhankelijk van de steekproefgrootte en experimentele omstandigheden. Hoewel de absolute SI waarden van de gemiddelde kromme gewoonlijk verschilt van die van een enkele analyse phagosome, de temporele evolutie houdt gewoonlijk zeer vergelijkbaar. Na de analyse kan worden geconcludeerd dat de levering van Dex70kD als lysosomale luminale lading kraal-phagosomes in wild type BMMs een plateau bereikt binnen de 35-40 minuten na fagocytose.

Deze werkwijze kan derhalve worden gebruikt voor de kwalitatieve of kwantitatieve effect van verschillende factoren op de phagosome rijpingsproces onderzoeken.

Figuur 1
Figuur 1. Bereiding van cellen voor beeldvorming. Voorbereide BMMs worden gezaaid in een glazen onderste schaal ten minste 12 uur vóór toevoegingdextran, is oplossing van dextran in medium toegevoegd 20 ug / ml concentratie en gedurende 2-8 uur (lading), cellen gewassen, vers medium wordt toegevoegd en de cellen worden gedurende ten minste 4 uur (chase), cellen weer gewassen en kraal suspensie wordt aangebracht vlak voor de start van de beeldvorming. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 2
Figuur 2. Stap voor stap instructie voor beeldanalyse. Na het laden van de time-lapse video of afbeelding volgorde in verschillende kanalen in Fiji, de evaluatie volgt in deze stappen (Merk op dat de afbeelding ziet u een afbeelding collage en niet alle hier getoonde vensters tegelijk open blijven ). (A) Onder "Analyze" menu, pixelafstand schalen wordt teruggezet in het geval de meta-data van de foto's zijn niet beschikbaar voor Fiji, heeft verschillende vergrotingen eerder gebruikt in Fiji of de time-lapse-opnamen zijn op verschillende vergrotingen, door te gaan naar (b) "Set Scale", ( c) de "Global" doos die de reset geldt voor alle daarna geladen afbeelding serie tikt en te klikken op "Click to Scale verwijderen". (D) Zorg ervoor dat zowel het helder veld (BF) kanaal image serie (waar kraal-phagosomes zijn duidelijk zichtbaar) en het kanaal met sondesignaal worden geladen en hebben exact hetzelfde frame-tellingen en pixelafmetingen, bijvoorbeeld. twee series van elk 400 frames met 450 x 450 pixel dimensies. (E) Onder menu "Analyze", parameters van de evaluatie kan worden ingesteld onder "Set Metingen", waar "Area", "geïntegreerde dichtheid" en "Display label" parameters worden geselecteerd. (F (G) Dit garandeert de meting van de rood-kanaal intensiteit in dezelfde regio van belang (ROI) die wordt aangegeven door de stippellijn en de witte pijl in rood-kanaal. De circulaire ROI is geselecteerd in het BF kanaal met de "Oval" selectie tool. (H) Start de meting onder "Analyze", "Measure" of via de snelkoppeling commando, en herhaal voor elk frame van de hele serie voor de gewenste duur van het experiment (bijv. 90 min.). In elk frame, bewegen en stel de ROI locatie aan de korrel-phagosome van de rente en merk op dat gaat naar de volgende frame in de BF serie en het geven van de "Measure" commando automatisch meet de ROI in de overeenkomstige kader van het rode-kanaal. (I) Meetresultatenzal verschijnen als een lijst in het venster "resultaten". Onder het "Label" kolom, wordt de exacte frame voor elke lijn duidelijk is geïdentificeerd; dit gebruiken om te controleren op herhaalde meting van een enkel frame of overgeslagen frames in lange reeks beelden. (J) De "IntDen" kort voor geïntegreerde dichtheid is de output parameter kritisch, althans het etiket en de "IntDen" waarden kopiëren naar een MS Excel sheet te gaan met de evaluatie. De eenheid van IntDen waarde is ongedefinieerd en aangeduid als willekeurige eenheden (au), dit geen problemen opleveren zolang de protocollen strikt worden gevolgd. Schaal bar is 10 micrometer. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 3
Figuur 3. Analyse van de foto-bleken.60 (a) beeld Open serie in het kanaal van belang en zorg ervoor dat de schaal is verwijderd indien nodig, (b) Onder "Plugins" menu klik (c) "Time Series Analyzer". (D) Het gebruik van de rechthoekige selectie tool, trek een rechthoekige ROI die bijna het gehele frame, of in ieder geval de hele cel van belang voor de gehele duur van de film, (e) voeg de geselecteerde ROI, (f) klik "Get Gemiddeld "en (g) De resultaten zullen worden weergegeven in de" Time Traces "tafel en" Time Traces Average "plot. Merk echter op, dat alleen een "gemiddelde" (gemiddelde intensiteit) wordt uitgezet tegen het frame nummer en niet de "IntDen" waarde. (H) Onder "Analyze" menu, run "Measure" zonder wijziging van enige andere parameters, om de "IntDen" meten voor exact dezelfde ROI op hetzelfde frame. Dit zal het equivalent van de Me biedeneen intensiteit in "IntDen" Gebruik deze waarde om de omrekeningsfactor (gelijk aan de "Area") te berekenen en plotten de "IntDen" van het hele frame ROI tegen de tijd in seconden in MS Excel. (J) Klik op "Lijst", kopieert u de lijst van waarden naar een Excel sheet en converteren van alle "Mean" waarden "IntDen" waarden. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 4
Figuur 4. Correctie van fotoblekingsreactie. Afhankelijk van de gebruikte probe en imaging instellingen kan fotoblekingsreactie optreden. Dit kan grote invloed hebben op de uitkomst van de evaluatie. A) Raw IntDen waarden (in au) van de sonde uit het gehele frame zijn uitgezet tegen de tijd in seconden in MS Excel. Voeg een lineairetrend-lijn;.. een duidelijk negatieve helling geeft de aanwezigheid van foto-bleken effect B) Als voorbeeld, het toepassen van de omgekeerde Slop op de ruwe IntDen met de correctie formule geeft de gecorrigeerde IntDen C) Gecorrigeerde IntDen waarden worden gedeeltelijk gecompenseerd voor de effect van foto-bleken. Klik hier voor grotere afbeelding .

Figuur 5
Figuur 5. Presentatie van representatieve cellen, kinetiek en middeling van de gecorrigeerde signaal. A) BMMs geladen met dextran sonde 0 min na opname van de IgG-beklede kraal aangegeven door de pijl. Schaal bar is 10 micrometer. Komt overeen met Film 1 B) 2.5x ingezoomd invoegen van een time-lapse filmpje, beeltenis van de aangegeven phagosome over een tijdsspanne van 85 minuten na opname, valse-gekleurd voor een betere zichtbaarheid met "Thal" Look-Up Table (LUT) in ImageJ. De gemeten phagosome ROI wordt aangegeven met de witte stippellijn. De gevallen van dextran levering en accumulatie in de phagosome worden aangegeven met witte pijlen. C) Gecorrigeerd fluorescentie-signaal van Texas Red 70kDa dextran verlost van lysosomen naar de aangegeven phagosome. D) Averaged fluorescentie IntDen waarden uit 10 phagosomes binnen de twee aangegeven cellen ± SEM . Klik hier voor grotere afbeelding .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

In de volgende paragraaf zullen we bespreken kritische stappen van de gepresenteerde methode en zijn beperkingen. Verder zullen we verbinden een aantal van de meest voorkomende problemen met hun oplossingen, mogelijk wijzigingen aan te brengen en te overwegen de voordelen van onze methode alsmede geschikte complementaire methoden voor deze aanpak.

De bereiding van de korrels, zoals de koppeling van IgG aan de korrel oppervlak is cruciaal en het gebruik van unfresh preparaten worden vermeden. In toevoegingen aan dat, het is ook van cruciaal belang dat de dextran wordt bereid uit de bevroren voorraad (verdund en gesteriliseerd) vers voor elk experiment. Belangrijk is dat de belading van het dextran aan een strak tijdschema om de consistentie van cellulaire opname en Distributie en accumulatie bereiken. Bovendien is het belangrijk om niet alleen dezelfde microscopie installatie en software-instellingen, maar ook om de randvoorwaarden zo constant mogelijk is (bijvoorbeeld te houden gebruikenmperature, CO 2, vochtigheid, kraal-naast techniek, enz.). Een ander kritisch punt is de selectie van een gezichtsveld of de cel van belang, moet het monster voor aanvang van de beeldvorming gescout om cellen die representatief zijn kiezen.

Een van de belangrijkste beperkingen van de werkwijze is het aantal experimenten nodig belangrijke samples afmetingen leveren. De beschreven werkwijze is relatief veel tijd en arbeidsintensief, aangezien het aantal waarneembare phagosomes in een gezichtsveld, afhankelijk van de gekozen resolutie, beperkt. Pooling de resultaten van een zeer gering aantal willekeurig gekozen phagosomes het gevaar inhoudt dat een aantal extreme uitschieters prominent effect op gemiddelde waarden hebben. Grotere steekproefomvang anderzijds zal maskeren van phagosome naar phagosome of cel-cel variaties mogelijk.

De meest voorkomende problemen die kunnen optreden zijn verontreinigingen, gebrek aan fagocytose en overmatig bleken en fototoxiciteit effect als gevolg van het laserlicht.

Steriliteit, de juiste opslag en voorbereiding van de dextran zijn kritiek aan verontreinigingen te voorkomen. In onze ervaring, dient de gekochte dextran niet worden beschouwd als een steriele oplossing. Het risico van contaminatie monster kan aanzienlijk worden verminderd door uitgebreide centrifugeren van de voorraad en steriele filtratie van verdunde dextranoplossing. Anderzijds, regelmatige bereiding van verse kralensuspensie, die eiwitten bevat en is gevoelig voor verontreinigingen, kan ook het risico van verontreinigingen te verminderen.

Geen of lage fagocytose kan door IgG-bekleding van de korrels suboptimale. Daarom is het belangrijk om de componenten voor de IgG koppeling van de kraal (IgG oplossing EDAC) vers en niet op parels die meer dan 4 weken oud of niet gebruiken bereiden zij uitsluitend bewaard bij 4 ° C. Omdat de kralen kort worden behandeld met geluidsgolven vóór gebruik, is het raadzaam om voor te bereidenwerken fracties om herhaalde sonicatie van de voorraad schorsing te voorkomen. Een andere reden voor een lager dan verwachte fagocytaire prestaties kon ongezond, suboptimaal gekweekte of oude cellen zijn, strikte naleving van de aanbevolen kweekomstandigheden voor de gebruikte celtype is daarom essentieel. Zo kan een te grote trypsinisatie tijdens de oogst de fagocytaire oppervlak receptoren beschadigen en aantasting fagocyterende capaciteit.

Overmatig fotoblekingsreactie kan een groot probleem met sommige fluoroforen zijn. Aanpassen microscoop instellingen, namelijk de intensiteit van het excitatielicht en duur van blootstelling monster volgens het bleken gevoeligheid van de fluorofoor helpt bij het ​​bleken controleren. Voor het tijdsinterval tussen verwervingen van opeenvolgende frames, een evenwicht tussen het frame-snelheid, die op een hogere frequentie laat hogere temporele resolutie en beter openbaring belangrijke interactie dynamiek, en het bleken van de sonde to worden getroffen. De optimale balans hoofdzakelijk afhankelijk van de vragen die in de gegeven experiment worden aangepakt. Instellen van de scanresolutie, scannen frequentie en lijn of kader middeling vertegenwoordigen instellingen die kunnen worden aangepast aan het verder optimaliseren van de duur van de blootstelling monster op de excitatie licht. Beschikbaarheid van sommige van deze opties is echter bepaald door het soort microscoop systeem dat wordt gebruikt.

Dezelfde algemene richtsnoeren moeten worden gevolgd om de foto-toxische effect van laser excitatie licht op de cellen te minimaliseren. Dit effect kan worden gemanifesteerd als de dood van de cellen blootgesteld aan het laserlicht tijdens de beeldvorming of een duidelijke toename van onnatuurlijke morfologie 20.

Hier hebben wij een eenvoudige en algemene werkwijze die zorgt voor wijzigingen en aanpassing aan verschillende experimentele instellingen gepresenteerd. Zoals vermeld, kan deze werkwijze worden toegepast voor het verlies-van-functie studies zoals in knockout modellengen knockdown of mutant eiwit expressie. Het staat ook verschillende strategieën opsonisatie specifieke fagocytische receptoren richten, het gebruik van verschillende endosomale / lysosomale probes en de studie van chemische remmers of cytokinen.

Overexpressie studies met verschillende fluorescente fusie-eiwitten en hun mutanten kunnen worden gebruikt om de effecten op de aflevering van een passende probe aan het phagosomes onderzoeken. Verder kinetiek en dynamica van de interactie van het eiwit zelf met phagosomes kunnen worden geanalyseerd. Er zijn verschillende sondes beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor deze doeleinden. Een prominent voorbeeld van bekende klasse van probes de Lysotracker groep acidotropic kleurstoffen, die frequent gebruikt om protonering lumen van endosomale compartimenten en de phagosomal lumen volgen. De bekleding van de korrels heeft een veelheid van mogelijkheden. Liganden, waaronder nucleïnezuren zoals specifieke CpG plaatsen van bacterieel DNA 21, bacrial oppervlak componenten zoals LPS, eiwitten zoals avidine, serumeiwitten zoals complement factoren (bv. C1q of iC3b) alles kan worden oversteken gekoppeld aan kralen 22-24. Dit maakt de studie van de rol van deze liganden in fagocytose en fagosoom rijping. Met behulp van signaalmoleculen en immuunmediatoren (bijvoorbeeld cytokines) openen een ander scala aan mogelijkheden.

Ten slotte kan deze methode ook worden uitgebreid en aangepast aan de directe studies met micro-organismen, bijvoorbeeld door de opname van de live vs gedood of pathogene versus niet-pathogene bacteriën te vergelijken, hoewel de onregelmatige vorm van bacteriën voor nieuwe uitdagingen tijdens beeldanalyse.

Toekomstige toepassingen van deze methode zijn spruitstuk als de wijzigingen die kunnen worden toegepast. Als volgende stap kan verhouding-metrische analyse methoden worden aangepast. Combinatie van pH-gevoelige en pH-ongevoelige fluorescente kleurstoffen voor kraal-coating, of gebruik te maken van enkele sondes naar MMOUre phagosomal pH (bijv. pHrodo, FluoProbes) en verbindingen die het mogelijk maken experimenteel volgen de kinetiek van eiwitten en lipiden afbraak in phagosome (bijv. OVA, HRP, runderserumalbumine en triglyceride lipase substraten) beschikbaar 25-31. Deze vormen samen mogelijk de oprichting van een groot aantal onderzoeksmethoden op basis van de fundamentele wijze van live cell imaging van phagosomes hier gepresenteerd.

De beschreven werkwijze kan veel hoger temporele resoluties tegenover benaderingen die zijn gebaseerd op phagosome isolatie 32 bereiken. ELISA of Western Blot analyses van phagosomes kan een zeer groot aantal evenementen op bepaalde tijdstippen te vertegenwoordigen, maar de gegevens vormen een veel meer heterogeen en mogelijk niet-gesynchroniseerde bevolking van evenementen. Flowcytometrie gebaseerde benaderingen theoretisch kan de analyse tot de afzonderlijke celniveau en op die manier kunnen minder gevoelig voor heterogenei zijnty van celpopulaties maar soortgelijk probleem van onzekere synchroniciteit en de behoefte aan zeer hoge event telt voor betrouwbare evaluatie blijven bestaan. Niettemin, de hoge doorvoer, gevoeligheid en reproduceerbaarheid van flowcytometrie benadert 33,34, maken ze een optimale aanvulling op de live cell imaging aanpak.

Samengevat, het voordeel van onze werkwijze ligt in nauwkeurigheid en hoge tijdsresolutie waarmee enkele phagosomes te volgen in hun rijpingsproces in levende cellen. In vergelijking met alle andere middelen die opmerkingen beperken tot minder tijdstippen in levensvatbare en voorbehandelde cellen, is het hier mogelijk om cellulaire gebeurtenissen dynamisch en continu volgen gedurende lange tijd onder fysiologische omstandigheden gemakkelijk aanpasbaar. Men zou kunnen gebeurtenissen met betrekking tot de opname van de fagocytaire lading, die discriminatie van de stadia van fagocytose nauwkeuriger kunt definiëren. Op die manier maakt synchronisatie niet only visualiseren vergelijkbaar gedrag van phagosomes, maar maakt ook het identificeren individuele verschillen vanwege bijvoorbeeld cel-cel variaties. Het belangrijkste is dat de dynamiek van de interacties die de sleutel kan houden tot het begrijpen van complexe interacties effectief worden verlicht in hoge temporele resolutie met behulp van onze live-cell imaging benadering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Wij danken de leden van de phagosome Biology Laboratory voor het kritisch lezen van het manuscript. Dit werk wordt ondersteund door een Helmholtz Young Investigator Grant (Initiative en Netwerken fondsen van de Helmholtz Association) en een Prioriteit Programma SPP1580 Grant van de Duitse Research Council (Deutsche Forschungsgemeinschaft, DFG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) PAA, Austria E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) PAA, Austria E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA, Austria A15-151
L-Glutamine PAA, Austria M11-004
PBS PAA, Austria H15-002
Penicillin/Streptomycin PAA, Austria P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) WillCo Wells, Netherlands GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm Greiner Bio one, Germany 627871 Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres Polysciences, USA #09850 Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles Kisker Biotech, Germany PPs-3.0COOH
Triton-X 100 ROTH, Germany 305.1.3
mouse whole IgG Rockland, USA 010-0102
EDAC crosslinker Sigma-Aldrich, USA E6383-1g
10 mM Tris Sigma-Aldrich,USA T1503
1-ml syringe Omnifix -F B.Braun, Germany 9161406V
26 G needle (0.45*25 mm) B.Baun, Germany 4657683
RPMI 1640 PAA, Austria E15-039
Horse Serum Gibco, USA 16050-122
MES hydrate Sigma-Aldrich, USA M2933
0.2 μM syringe mounted filter Sartorius, Germany 83.1826.001

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Greenberg, S., Grinstein, S. Phagocytosis and innate immunity. Curr. Opin. Immunol. 14, 136-145 (2002).
  2. Jutras, I., Desjardins, M. Phagocytosis: at the crossroads of innate and adaptive immunity. Ann. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 511-527 (2005).
  3. Iwasaki, A., Medzhitov, R. Regulation of adaptive immunity by the innate immune system. Science. 327, 291-295 (2010).
  4. Stuart, L., Ezekowitz, R. Phagocytosis: elegant complexity. Immunity. 22, 539-550 (2005).
  5. Blander, J. M., Medzhitov, R. On regulation of phagosome maturation and antigen presentation. Nat. Immunol. 7, 1029-1035 (2006).
  6. Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S. The cell biology of phagocytosis. Annu. Rev. Pathol. 7, 61-98 (2012).
  7. Vieira, O. V., Botelho, R. J., Grinstein, S. Phagosome maturation: aging gracefully. Biochem. J. 366, 689-704 (2002).
  8. Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
  9. Flannagan, R. S., Cosio, G., Grinstein, S. Antimicrobial mechanisms of phagocytes and bacterial evasion strategies. Nat Rev Microbiol. 7, 355-366 (2009).
  10. Luzio, J., Pryor, P., Bright, N. Lysosomes: fusion and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
  11. Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30, 3481-3500 (2011).
  12. Luzio, J. P., et al. Lysosome-endosome fusion and lysosome biogenesis. J. Cell. Sci. 113 (pt 9), 1515-1524 (2000).
  13. Eissenberg, L., Goldman, W. Fusion of lysosomes with phagosomes containing Histoplasma capsulatum: use of fluoresceinated dextran). Adv. Exp. Med. Biol. 239, 53-61 (1988).
  14. de Souza Carvalho, C., et al. Internalization, phagolysosomal biogenesis and killing of mycobacteria in enucleated epithelial cells. Cell. Microbiol. 13, 1234-1249 (2011).
  15. Wang, Y. L. Differential and sequential delivery of fluorescent lysosomal probes into phagosomes in mouse peritoneal macrophages. J. Cell Biol. 104, 1749-1754 (1987).
  16. Harrison, R. E., Bucci, C., Vieira, O. V., Schroer, T. A., Grinstein, S. Phagosomes Fuse with Late Endosomes and/or Lysosomes by Extension of Membrane Protrusions along Microtubules: Role of Rab7 and RILP. Mol. Cell. Biol. 23, 6494-6506 (2003).
  17. Huynh, K. K., et al. LAMP proteins are required for fusion of lysosomes with phagosomes. EMBO J. 26, 313-324 (2007).
  18. Kasmapour, B., Gronow, A., Bleck, C., Hong, W., Gutierrez, M. Size-dependent mechanism of cargo sorting during lysosome-phagosome fusion is controlled by Rab34. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 20485-20490 (2012).
  19. Snijder, B., et al. Population context determines cell-to-cell variability in endocytosis and virus infection. Nature. 461, 520-523 (2009).
  20. Knight, M., Roberts, S., Lee, D., Bader, D. Live cell imaging using confocal microscopy induces intracellular calcium transients and cell death. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 284, 9 (2003).
  21. Hemmi, H., et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature. 408, 740-745 (2000).
  22. Underhill, D., Ozinsky, A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr. Opin. Immunol. 14, 103-110 (2002).
  23. Bohdanowicz, M., Cosío, G., Backer, J., Grinstein, S. Class I and class III phosphoinositide 3-kinases are required for actin polymerization that propels phagosomes. J. Cell Biol. 191, 999-1012 (2010).
  24. Hoffmann, E., et al. Initial receptor-ligand interactions modulate gene expression and phagosomal properties during both early and late stages of phagocytosis. Eur. J. Cell Biol. 89, 693-704 (2010).
  25. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. The kinetics of phagosome maturation as a function of phagosome/lysosome fusion and acquisition of hydrolytic activity. Traffic. 6, 413-420 (2005).
  26. Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126, 205-218 (2006).
  27. Yates, R., Hermetter, A., Russell, D. Recording phagosome maturation through the real-time, spectrofluorometric measurement of hydrolytic activities. Methods Mol. Biol. 531, 157-171 (2009).
  28. Russell, D., Vanderven, B., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  29. Hoffmann, E., et al. Autonomous phagosomal degradation and antigen presentation in dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 14556-14561 (2012).
  30. Tan, S., Sukumar, N., Abramovitch, R., Parish, T., Russell, D. Mycobacterium tuberculosis Responds to Chloride and pH as Synergistic Cues to the Immune Status of its Host Cell. PLoS Pathog. 9, (2013).
  31. Aziz, M., Yang, W. -L., Wang, P., et al. Measurement of phagocytic engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Current protocols in immunology. Coliganet, J. E., et al. 14, (2013).
  32. Rogers, L., Foster, L. The dynamic phagosomal proteome and the contribution of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 18520-18525 (2007).
  33. Russell, D. G., Vanderven, B. C., Glennie, S., Mwandumba, H., Heyderman, R. S. The macrophage marches on its phagosome: dynamic assays of phagosome function. Nat. Rev. Immunol. 9, 594-600 (2009).
  34. Savina, A., Vargas, P., Guermonprez, P., Lennon, A. -M., Amigorena, S. Measuring pH, ROS production, maturation, and degradation in dendritic cell phagosomes using cytofluorometry-based assays. Methods. Mol. Biol. 595, 383-402 (2010).

Tags

Immunologie Lysosome phagosome fagolysosoom live-cell imaging fagocyten macrofagen
Studie van fagolysosoom Biogenesis Live macrofagen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bronietzki, M., Kasmapour, B.,… More

Bronietzki, M., Kasmapour, B., Gutierrez, M. G. Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages. J. Vis. Exp. (85), e51201, doi:10.3791/51201 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter