Studium der Biogenese Phagolysosom im Live-Makrophagen

Zusammenfassung

Fresszellen spielen eine wichtige Rolle in der angeborenen Immunsystems durch Entfernen und Beseitigen eindringende Mikroorganismen in ihren Phagosomen. Phagosomenreifung sind die komplexen und stark regulierten Prozess, bei dem eine im Entstehen begriffene phagosome erfährt drastische Transformation durch gut organisierte Interaktion mit verschiedenen zellulären Organellen und Fächer im Zytoplasma. Dieser Prozess, der essentiell für die physiologische Funktion der Fresszellen durch auszustatten Phagosomen mit ihren lytischen und bakteriziden Eigenschaften ist, gipfelt in Fusion von Phagosomen mit Lysosomen und Biogenese der Phagolysosomen, die als die letzte und entscheidende Phase der Reifung für Phagosomen sein wird. In diesem Bericht beschreiben wir eine Live-Cell-Imaging-basierte Methode zur qualitativen und quantitativen Analyse des dynamischen Prozess der Lysosomen, die Lieferung, die ein Markenzeichen der Phagolysosom Biogenese ist Phagosom. Dieser Ansatz verwendet IgG-beschichteten Mikroperlen als Modell für phagocytose und fluorophorkonjugierten Dextranmolekülen als Lumen lysosomalen Fracht-Sonde, um die dynamische Bereitstellung von lysosmal Inhalte an die Phagosomen in Echtzeit im Live-Makrophagen folgen mit Zeitraffer-Imaging und konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie. Hier beschreiben wir detailliert den Hintergrund, die Vorbereitungsschritte und den Schritt-für-Schritt-Versuchsaufbau zur einfachen und präzisen Einsatz dieser Methode in anderen Labors zu ermöglichen. Unsere beschriebene Verfahren ist einfach, robust und vor allem leicht angepasst phagosomalen Wechselwirkungen und Reifung in verschiedenen Systemen und unter verschiedenen experimentellen Bedingungen, wie die Verwendung von verschiedenen Arten Phagozyten, Verlust-Funktion Experimenten verschiedene Sonden zu untersuchen, und phagozytierenden Partikel.

Einleitung

Professionelle Phagozyten, einschließlich Makrophagen, spielen im Immunsystem eine kritische. Zusätzlich dazu, dass die erste Verteidigungslinie des angeborenen Immunsystems, sie spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Aktivierung des adaptiven Immunität durch ihre Signal-und Antigen-präsentierenden Rolle ^03.01. Während die Funktion von professionellen Phagozyten ist vielfältig ist Phagosomenreifung die kritische Rückgrat der bakteriziden und Antigen-Verarbeitungsfunktion der professionellen Phagozyten ^4,5. Bei der Rezeptor-vermittelten Phagozytose und die Aufnahme einer Phagozyten Ziel, wie Bakterien, geht die entstehenden Phagosom über e....

Protokoll

Tierbetreuung und alle Verfahren in diesem Protokoll folgen die institutionellen und nationalen Richtlinien.

Bereiten Sie die Vorbereitungen, die von "Π-" vorab angedeutet sind.

1. Vorbereitung der BMM

1. Führen Sie die Keulung der Mäuse durch Genickbruch.
2. Entfernen Femur und Tibia Knochen, Knochen frei von Gewebe und schneiden Sie beide Enden für die Zugänglichkeit des Knochenmarks.
3. Halten Knochen in eiskaltem PBS oder eiskaltem DMEM-Medium (mit 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin, auf Eis ergänzt, bis der nächste Schritt.
   Hinweis: Führen Sie ....

Ergebnisse

Die richtige Vorbereitung der Zellen und die Perlen für die Bildgebung ist kritisch. Abbildung 1 zeigt den Umriss der Aussaat, Sonde-loading und erste Schritte in diese bildgebenden Verfahren auf der Grundlage unserer optimiertes Protokoll für BMM. Es ist daher wichtig, dass die Protokollparameter getestet und optimiert werden, je nach der Art der Zellen und Sonden, die verwendet werden sollen.

Nach Zugabe der IgG-beschichteten Kügelchen an die vorgespannte Zellen ist es wic.......

Diskussion

Im folgenden Abschnitt werden wir wichtige Schritte des vorgestellten Verfahrens und seine Grenzen zu diskutieren. Außerdem werden wir einige der häufigsten Probleme, mit ihren Lösungen zu verbinden, mögliche Änderungen einzuführen und betrachten Vorteile unserer Methode sowie geeignete komplementäre Methoden für diesen Ansatz.

Die Herstellung der Kügelchen, einschließlich der Kopplung von IgG an die Oberfläche der Kügelchen, ist entscheidend und die Verwendung unfresh Zubereitungen sollten .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM)	PAA, Österreich	E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium ohne Phenolrot (D-MEM)	PAA, Österreich	E15-047
Fötales Rinderserum (FBS)	PAA, Österreich	A15-151
L-Glutamin	PAA, Österreich	M11-004
PBS	PAA, Österreich	H15-002
Penicillin/Streptomycin	PAA, Österreich	P11-010
WillCo-dish® Glasbodenschale (35 mm &leer;, #1.5)	WillCo Wells, Niederlande	GWSt-3522
CELLviewTM Glasbodenschale, 35 mm	Greiner Bio one, Deutschland	627871	Alternativ: Erhältlich als segmentierte
Carboxylierte Latex-Mikrosphären	Polysciences, USA	#09850	Erhältlich in verschiedenen Durchmessern, wir haben 3 μ m
Polystyrol-Mikropartikel	Kisker Biotech, Deutschland	PPs-3.0COOH
Triton-X 100	ROTH, Deutschland	305.1.3
Maus ganzes IgG	Rockland, USA	010-0102
EDAC-Vernetzer	Sigma-Aldrich, USA	E6383-1g
10 mM	Tris Sigma-Aldrich, USA	T1503
1-ml-Spritze Omnifix -F	B.Braun, Deutschland	9161406V
26  G-Nadel (0,45*25 mm)	B.Baun, Deutschland	4657683
RPMI 1640	PAA, Österreich	E15-039
Pferdeserum	Gibco, USA	16050-122
MES-Hydrat	Sigma-Aldrich, USA	M2933
0,2 μ M Spritzenfilter	Sartorius, Deutschland	83.1826.001