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Immunology and Infection

लाइव मैक्रोफेज में Phagolysosome biogenesis का अध्ययन

Published: March 10, 2014 doi: 10.3791/51201
Automatic Translation
1, 1, 1,2
1Research Group Phagosome Biology, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Division of Mycobacterial Research, National Institute for Medical Research

Abstract

Phagocytic कोशिकाओं को हटाने और उनके phagosomes में हमलावर सूक्ष्मजीवों को नष्ट करने से सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में एक प्रमुख भूमिका निभाते हैं. Phagosome परिपक्वता एक नवजात फेगोसोम कोशिका द्रव्य में विभिन्न सेलुलर organelles और डिब्बों के साथ अच्छी तरह से करवाया बातचीत के माध्यम से कठोर परिवर्तन की प्रक्रिया होती है जिसके दौरान जटिल और कसकर विनियमित प्रक्रिया है. उनके अपघट्य और जीवाणुनाशक गुण के साथ phagosomes endowing द्वारा phagocytic कोशिकाओं के शारीरिक समारोह के लिए आवश्यक है, जो इस प्रक्रिया में, लाइसोसोम और phagosomes के लिए परिपक्वता के अंतिम और महत्वपूर्ण चरण माना जाता है जो phagolysosomes की जीवजनन साथ phagosomes के विलय में खत्म. इस रिपोर्ट में, हम phagolysosome जीवजनन की एक बानगी है जो सामग्री वितरण, phagosome को लाइसोसोम के गतिशील प्रक्रिया के गुणात्मक और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक जीवित कोशिका इमेजिंग आधारित विधि का वर्णन. यह दृष्टिकोण phagocy के लिए एक मॉडल के रूप में आईजीजी में लिपटे microbeads का उपयोग करता हैएक luminal lysosomal कार्गो जांच के रूप में tosis और fluorophore संयुग्मित dextran अणुओं, समय चूक इमेजिंग और लेजर confocal माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग का उपयोग लाइव मैक्रोफेज में वास्तविक समय में phagosomes को lysosmal सामग्री के गतिशील वितरण का पालन करने के क्रम में. यहाँ हम विस्तार से पृष्ठभूमि, तैयारी कदम और अन्य प्रयोगशालाओं में इस विधि का आसान और सटीक तैनाती सक्षम करने के लिए कदम दर कदम प्रयोगात्मक सेटअप का वर्णन. हमारे वर्णित विधि सरल, मजबूत, और सबसे महत्वपूर्ण बात यह आसानी से विभिन्न प्रणालियों में और इस तरह के विभिन्न phagocytic कोशिकाओं प्रकार, हानि के समारोह प्रयोगों, अलग जांच के उपयोग के रूप में विभिन्न प्रयोगात्मक सेटिंग के तहत phagosomal बातचीत और परिपक्वता का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, और phagocytic कणों.

Introduction

मैक्रोफेज सहित व्यावसायिक फ़ैगोसाइट, प्रतिरक्षा प्रणाली में एक महत्वपूर्ण खेलते हैं. सहज प्रतिरक्षा प्रणाली में रक्षा की पहली पंक्ति होने के अलावा, वे भी भूमिका 1-3 पेश उनके संकेतन और प्रतिजन के माध्यम से प्रतिरक्षा अनुकूली की सक्रियता में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं. पेशेवर फ़ैगोसाइट के समारोह में बहुमुखी है, phagosome परिपक्वता पेशेवर फ़ैगोसाइट 4,5 की जीवाणुनाशक और प्रतिजन प्रसंस्करण समारोह के महत्वपूर्ण रीढ़ है. रिसेप्टर मध्यस्थता घिराव और बैक्टीरिया जैसे एक phagocytic लक्ष्य, के तेज होने पर नवजात फेगोसोम बातचीत और endocytic नेटवर्क के डिब्बों और कई अन्य सेलुलर organelles 6 के साथ आदान प्रदान का एक जटिल और अच्छी तरह से करवाया अनुक्रम के माध्यम से चला जाता है. यौगिकों की प्रकृति इन सेलुलर संस्थाओं के साथ ही विनियमन के साथ विमर्श किया और फ्यूजन घटनाओं के समय luminal phagosomal परिवेश और phagos निर्धारित करता हैOmal झिल्ली संरचना और, इस प्रकार 7, परिपक्व फेगोसोम 8 के भाग्य.

फेगोसोम परिपक्वता की शारीरिक प्रासंगिकता, से बचने की गिरफ्तारी या फेगोसोम परिपक्वता 9 नाश के लिए विभिन्न intracellular रोगज़नक़ों द्वारा नियोजित विविध रणनीतियों द्वारा उदाहरण है. Hydrolytic एंजाइमों और एक परिपक्व फेगोसोम 7 के विरोधी बैक्टीरियल कारकों के थोक के साथ उन्हें endows जो देर endosomal / lysosomal डिब्बों के साथ फेगोसोम का फ्यूजन,: इन रणनीतियों में से अधिकांश सीधे या परोक्ष रूप से phagosome परिपक्वता की प्रक्रिया के अंतिम और महत्वपूर्ण चरण को रोकने के , 8,10. प्राकृतिक शारीरिक स्थिति का उपयोग किया जा रहा है कि विशेष रूप से प्रयोगात्मक सेटिंग के तहत प्रभावित सकारात्मक या नकारात्मक किया जा रहा है इस अंतिम और महत्वपूर्ण कदम का विश्लेषण इसलिए phagosomes की परिपक्वता की स्थिति के बारे में मजबूत संकेतक के साथ हमें प्रदान कर सकते हैं.

देर endosomal / lysosomal कम्पार्टमेंटएस आम तौर पर विभिन्न की मौजूदगी से जल्दी endocytic डिब्बों से परिभाषित और प्रतिष्ठित endocytic मार्ग के टर्मिनल डिब्बों, विशिष्ट, मार्कर अणुओं चरण होने के लिए माना जाता है. उदाहरण के लिए इस तरह दूसरों के 11 के बीच Lysosomal जुड़े झिल्ली प्रोटीन (दीपक) के रूप में hydrolytic एंजाइमों या झिल्ली घटकों के लिए. टर्मिनल endocytic डिब्बों-आगे से लाइसोसोम भी phagocytic / endocytic मार्ग 12 के अंत में पाचन के अंतिम चरण के लिए मुख्य स्थान के रूप में सेवा के लिए बस के रूप में भेजा. इस तरह, nondigestible जांच बाह्य परिवेश से endocytosis और macropinocytosis के माध्यम से लोड किया जा सकता है और यह तेज और चेस का एक परिभाषित चक्र के बाद के बाद 13,14 जम जाता है जहां लाइसोसोम को endocytic मार्ग, के माध्यम से पहुँचाया. 15-17 endocyticprobes के रूप में इस तरह के कार्बनिक nondigestible बहुलक dextran के रूप में फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए fluorophore संयुग्मित जांच आमतौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं.

14,18 उपयोग कर प्रस्तुत किया, एकत्र समय चूक इमेजिंग डेटा खुला स्रोत और स्वतंत्र रूप से उपलब्ध छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर, फिजी (या ImageJ) का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता का वर्णन कैसे.

हमारे विधि का वर्णन के बाद, अनुरूप प्रयोगों फेगोसोम परिपक्वता पर उनके प्रभाव की जांच करने के लिए संशोधित सेटिंग्स और कारकों का उपयोग कर बनाया जा सकता है, वास्तव में किसी भी ओ.टी.पक्षपाती प्राथमिक या सेल लाइन phagocytic कोशिकाओं की उसके प्रकार, सहित समारोह प्रयोगों की आनुवंशिक नुकसान जीन बाहर दस्तक और तोड़े नीचे, म्यूटेंट या संलयन प्रोटीन, phagocytic लक्ष्य, microbead कोटिंग यौगिकों, endosomal / lysosomal जांच और कारकों जैसे एक की अभिव्यक्ति दूसरों के बीच में साइटोकिन्स, रासायनिक inhibitors, या siRNA इस विधि के बुनियादी दृष्टिकोण को लागू किया जा सकता है कि सभी चर रहे हैं.

हम के रूप में इस पद्धति का लक्ष्य और बुनियादी आवश्यकताओं को परिभाषित:

  • विधि का लक्ष्य: phagocytic जीवित कोशिकाओं में उच्च अस्थायी समाधान के साथ फेगोसोम परिपक्वता की, प्रत्यक्ष मात्रात्मक और गुणात्मक अवलोकन और विश्लेषण कर सकें.
  • Phagocytic कार्गो: एक उचित लेपित microparticle या जैविक लक्ष्य. यहाँ हम आसानी एफसी-γ रिसेप्टर मध्यस्थता phagocytosis के माध्यम से भली भाँति रहे हैं कि 3 माइक्रोन गोलाकार polystyrene microparticles आईजीजी में लिपटे उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, किसी भी सूक्ष्मजीव या लेपित micएक phagocytic रिसेप्टर कोशिकाओं पर मौजूद है जिसके लिए roparticle इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • Phagocytic कोशिकाओं: उचित phagocytic रिसेप्टर्स व्यक्त पक्षपाती phagocytic कोशिकाओं. यहाँ हम बहुतायत एफसी-γ रिसेप्टर्स व्यक्त जो माउस प्राथमिक BMMs का उपयोग करें. वैकल्पिक रूप से, वृक्ष के समान कोशिकाओं (डीसी), monocytes या phagocytic उपकला कोशिकाओं या उनके आनुवंशिक म्यूटेंट या नाक आउट वेरिएंट इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • Lysosomal कार्गो: एक fluorescently लेबल lysosomal जांच. इधर, टेक्सास लाल संयुग्मित 70,000 kiloDaltons dextran (Dex70kD) लाइसोसोम की luminal माल के रूप में प्रयोग किया जाता है. वैकल्पिक रूप से, इस तरह की अम्लता या degradative क्षमता के रूप में phagosomal संपत्तियों के लिए एक सेलुलर डिब्बे या organelle, या एक उचित जांच के किसी भी fluorescently detectable मार्कर, phagosome परिपक्वता की प्रगति का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  • उदाहरण के लिए, अणु, रासायनिक यौगिकों, जीन दस्तक नीचे सकता है, या उत्परिवर्ती प्रोटीन की क्षणिक अभिव्यक्ति संकेत: कारकों को प्रभावित. यहाँ, हम FORG हैसादगी के लिए इस तरह के एक कारक के एक प्रयोग करें, लेकिन उत्परिवर्ती प्रोटीन अभिव्यक्ति और Kasmapour एट अल. 18 phagosomes के phagocytosis या परिस्थितियों और गतिशीलता को प्रभावित और / कर सकते हैं कि किसी भी पहलू देखने के लिए कृपया नीचे दस्तक को प्रभावित करने वाले कारकों के साथ हाल ही में एक उदाहरण के लिए या परिपक्व phagosomes के साथ बातचीत कि डिब्बों के संभावित इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

इस प्रोटोकॉल में जानवरों की देखभाल और सभी प्रक्रियाओं संस्थागत और राष्ट्रीय दिशा निर्देशों का पालन करें.

"Π-" पहले से संकेत कर रहे हैं कि तैयारियाँ तैयार करें.

1. BMMs की तैयारी

  1. गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था से चूहों की मुर्गियों को मारने प्रदर्शन करना.
  2. ऊतक से फीमर और टिबिया हड्डियों, नि: शुल्क हड्डियों निकालें और अस्थि मज्जा की पहुंच के लिए दोनों सिरों ट्रिम.
  3. ठंडा पीबीएस या अगले चरण तक बर्फ पर 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन 100 यू / एमएल पेनिसिलिन और, साथ पूरक ठंडा DMEM मध्यम (में हड्डियों रखें.
    नोट: संक्रमण के जोखिम को कम करने के लिए एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत निम्न चरणों का आचरण.
  4. 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी 26 जी (0.45 मिमी) सुई का उपयोग ठंड पीबीएस + पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन साथ दिमाग़ी गुहा फ्लश.
  5. 10 मिनट के लिए 350 XG पर कोमल centrifugation द्वारा गोली कोशिकाओं, BMM मेड में गोली resuspendबाँझ माइक्रोबायोलॉजी में IUM और प्लेट पेट्री डिश noncoated.
    1. BMM माध्यम की तैयारी
      • Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम DMEM
      • 10% निष्क्रिय FCS
      • 20% माउस fibroblast L929 सेल लाइन संस्कृति सतह पर तैरनेवाला (बृहतभक्षककोशिका कॉलोनी उत्तेजक कारक, एम सीएसएफ के स्रोत)
      • 5% घोड़े सीरम
      • 2 मिमी glutamine
    2. L929 सेल लाइन संस्कृति के माध्यम से तैयार करना;
      • RPMI (Roswell पार्क मेमोरियल संस्थान) 1640 मध्यम
      • 10% निष्क्रिय FCS
      • 2 मिमी glutamine
    3. माउस fibroblast L929 सेल लाइन संस्कृति पर तैरनेवाला तैयार करना;
      • मिला हुआ L929 कोशिकाओं 175 सेमी में सुसंस्कृत, 01:04 विभाजित किया गया 20 मिलीलीटर L929 मध्यम और संस्कृति पर तैरनेवाला का उपयोग कर 2 दिनों के लिए 2 बोतल 48 घंटा के बाद एकत्र की गई थी, फ़िल्टर और BMM-माध्यम से जोड़ा
  6. से प्लावित कोशिकाओं को सेतेसीओ 2 माहौल 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में फीमर.
  7. ऊष्मायन के हर 48 घंटा (अधिकतम 72 घंटा) के बाद, मध्यम aspirate और अप करने के लिए 10 दिनों के लिए, ताजा BMM मध्यम से बदलें. फ्लो द्वारा परीक्षण के रूप में कोशिकाओं के 95% से अधिक CD14 के लिए सकारात्मक थे. CD14 मैक्रोफेज द्वारा मुख्य रूप से व्यक्त एक पैटर्न मान्यता रिसेप्टर है. इस रिसेप्टर के लिए सकारात्मक कोशिकाओं का प्रतिशत निर्धारित करने, पक्षपाती BMMs का शुद्ध संस्कृति उत्पन्न किया गया है.

नोट: अन्य प्रकार की कोशिकाओं का उपयोग किया जाता है यदि उसके अनुसार कोशिकाओं को तैयार करने और संस्कृति.

2. Phagocytic माल के रूप में microbeads की कोटिंग

  1. 1 मिलीलीटर मनका निलंबन की तैयारी के लिए, 2.5% की 400 μl 3 माइक्रोन Carboxylated polystyrene microparticles, या वैकल्पिक microparticles उपयोग करें.
  2. एक 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूब मनका निलंबन स्थानांतरण, पीबीएस के साथ 3x धोने और 500 मिमी 2 की 100 μl जोड़ने - (एन morpholino) ethanesulfonic एसिड सोडियम नमक, मनका गोली पीएच 6.7 पर एमईएस बफर.
  3. बाँझ DDH 2 हे 50 μl में 50 माइक्रोग्राम माउस आईजीजी (पॉलीक्लोनल आईजीजी एंटीबॉडी) को भंग करने और मनका निलंबन को जोड़ें.
  4. बाँझ DDH 2 हे (450 μl) के साथ 1 मिलीलीटर निलंबन भरें.
  5. आरटी पर एक घूर्णन पहिया पर 15 मिनट के लिए समाधान सेते हैं.
  6. मिलीलीटर 10 मिलीग्राम / के एक एकाग्रता में EDAC पार linker, एन (3 dimethylaminopropyl)-n 'ethylcarbodiimide हाइड्रोक्लोराइड तैयार है और मनका निलंबन के 14 μl जोड़ें.
    नोट: EDAC पार से लिंक मोतियों की सतह पर carboxyl समूहों के साथ आईजीजी के समूहों अमीनो और मनका सतह पर आईजीजी के स्थिरीकरण की सुविधा. इस मनका तेज के लिए महत्वपूर्ण है और इसलिए समाधान हौसले से तैयार किया जाना चाहिए है.
  7. आरटी पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर निलंबन सेते हैं.
  8. EDAC पार linker के 14 μl जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए एक घूर्णन पहिया पर निलंबन सेते.
  9. एक microcentrifuge में 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर निलंबन अपकेंद्रित्र.
  10. मोती रोकने के बफर में गोली resuspending और 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर समाधान कताई द्वारा, पार से जोड़ने की प्रतिक्रिया को रोकने के क्रम में रोकने के बफर (10 मिमी Tris, पीएच 9.4 में 1% Triton एक्स 100) में 3x धो लें.
  11. पीबीएस में 3x मोती धो लें और 1 मिलीलीटर पीबीएस में गोली resuspend.
    वैकल्पिक: 30-50 μl का काम कर aliquots तैयार करें.
  12. अब नहीं 4 सप्ताह की तुलना के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर आईजीजी में लिपटे मनका निलंबन स्टोर और निलंबन जमे हुए किया जा करने की अनुमति कभी नहीं.

नोट: इस तरह 0.02% की एक अंतिम एकाग्रता (w / v) जीवाणु वृद्धि और प्रदूषण को रोकने के निलंबन के लिए जोड़ा जा सकता है पर सोडियम azide के रूप में एक परिरक्षक. इस मामले में पूर्व में इसके उपयोग के लिए मोतियों की धुलाई परिरक्षक की साइटोटोक्सिक प्रभाव से बचने के लिए प्रदर्शन किया जाना है. 2 मिनट के लिए 10,000 XG पर निलंबन की एक विभाज्य अपकेंद्रित्र और फिर से मोती धोनेपीबीएस में गोली निलंबित. वॉशिंग 3x दोहराएँ.

3. Dextran जांच स्टॉक समाधान की तैयारी

  1. टेक्सास रेड 70,000 kiloDaltons भंग 20 मिलीग्राम पर पीबीएस में dextran (Dex70kD) निर्माता के निर्देशों के अनुसार, -20 डिग्री सेल्सियस पर / एमएल और दुकान.
    नोट: कई महीने तक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टॉक रखने, या 4 डिग्री सेल्सियस पर कुछ हफ्तों के लिए, निर्माताओं के दस्तावेज़ देखें.
  2. (को पतला हो जाएगा कि केंद्रित समाधान कई गुना लगभग 1 मिलीग्राम / एमएल (DMEM, 10% FCS, 2 मिमी एल glutamine) पूरा DMEM सेल संस्कृति माध्यम में गिराए द्वारा स्टॉक से प्रयोग के लिए dextran समाधान तैयार कोशिकाओं के अलावा पहले 20 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम काम एकाग्रता).
  3. समाधान homogenize और बाद में इमेजिंग के दौरान विरूपण साक्ष्य पीढ़ी को जन्म दे सकता है कि समुच्चय भंग करने के लिए 5 मिनट के लिए dextran विभाज्य sonicate को एक अल्ट्रासाउंड पानी से स्नान करें.
  4. अधिकतम जी पर अपकेंद्रित्रएक microcentrifuge में 5 मिनट के समाधान से किसी भी अघुलित clumps या को दूर करने के लिए.
  5. ध्यान से ट्यूब के नीचे गोली से परहेज करते हुए एक ताजा ट्यूब पर तैरनेवाला कदम है और पूरा DMEM सेल संस्कृति के माध्यम में 20 माइक्रोग्राम / एमएल की अंतिम काम एकाग्रता का हल पतला.
  6. एक 0.2 माइक्रोन सिरिंज घुड़सवार फिल्टर का उपयोग कर फ़िल्टर बाँझ समाधान.

4. Dextran preloading

  1. बीज एक लाइव सेल इमेजिंग गिलास नीचे डिश में कोशिकाओं और लगाव और अभ्यास होना सुनिश्चित करने के लिए (5% सीओ 2 के वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस) कम से कम 12 घंटे के लिए सेते हैं.
    नोट: पकवान प्रति (चार डिब्बों तक) कई प्रयोगों प्रदर्शन की अनुमति है कि उपलब्ध खंडों गिलास नीचे व्यंजन हैं.
  2. प्रोटोकॉल 3 में वर्णित के रूप में DMEM समाधान में dextran तैयार करें. 37 डिग्री सेल्सियस पर एक पानी के स्नान का उपयोग कर, DMEM समाधान में तैयार dextran वार्म अप
  3. महाप्राण मध्यम एकएन डी तेज के लिए 2-8 घंटे के लिए सीओ 2 माहौल 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर ध्यान से कोशिकाओं को dextran समाधान जोड़ने और सेते हैं.
    योजना और इस्तेमाल किया और प्रयोगों को दोहरा जब सख्ती से इस अवधि के लिए रखना है कि जांच और सेल प्रकार के आधार पर प्रोटोकॉल का अनुकूलन: ध्यान दें. इस endocytic मार्ग में dextran संचय की प्रोफाइल और प्रयोगों की इस प्रकार reproducibility के लिए आवश्यक है.
  4. 3X के साथ prewarmed पूरा DMEM मध्यम कोशिकाओं को धो लें, महाप्राण मध्यम और ताजा माध्यम से ध्यान से कोशिकाओं कुल्ला.
  5. सीओ 2 माहौल 5% में 37 डिग्री सेल्सियस पर 4-12 घंटे के लिए पूरा DMEM मध्यम के साथ कोशिकाओं को सेते हैं.
  6. Prewarmed पूरा फ़िल्टर्ड फिनोल लाल मुक्त DMEM माध्यम के साथ एक बार कोशिकाओं को धो लें.
  7. इष्टतम इमेजिंग परिणामों के लिए, इमेजिंग के शुरू होने से पहले prewarmed पूरा फ़िल्टर्ड फिनोल लाल मुक्त DMEM मध्यम कम से कम 30 मिनट के लिए बदल जाते हैं. Phenol लाल पृष्ठभूमि शोर बढ़ रही है, फ्लोरोसेंट संकेतों के शमन का कारण है और हो सकता हैइस प्रकार छवि के विपरीत और स्पष्टता को कम.

नोट: उपयोग किया जाता है कि जांच और कोशिकाओं के प्रकार के आधार पर preplanned और अनुकूलित प्रोटोकॉल के अनुसार, माइक्रोस्कोप और अग्रिम में इमेजिंग सेटिंग्स निर्धारित करें.

5. आईजीजी लिपटे मोतियों जोड़ना

  1. आर टी के लिए preprepared 1% मनका निलंबन के एक विभाज्य संतुलित करना और 2-3 मिनट के लिए एक अल्ट्रासाउंड पानी के स्नान में sonicate.
  2. संदूषण (एक अच्छा प्रारंभिक एकाग्रता 1 μl / 2 2 सेमी पकवान सतह है) के जोखिम को कम करने के लिए एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट के तहत पूरा फ़िल्टर्ड फिनोल लाल मुक्त DMEM मध्यम करने के लिए 1% मनका निलंबन की 1-6 μl जोड़ें.
    नोट: यहाँ BMMs 25,000 कोशिकाओं / अच्छी तरह पर वरीयता प्राप्त थे और 1% शेयर मनका निलंबन की 6 μl पकवान में के माध्यम से जोड़ा गया था. यह मोटे तौर पर 15:01 के एक मनका / सेल अनुपात के बराबर होती है. अनुपात का इस्तेमाल किया और मनका सामग्री है कि कोशिकाओं के प्रकार के लिए समायोजित किया गया है, मैं.ई. polystyrene मोती बड़ी संख्या में बहुत तेजी से और इस तरह पक्षपाती कोशिकाओं के संपर्क में सिंक और आने जबकि लेटेक्स मोती, कम घनत्व है और जल्दी से नीचे सिंक नहीं है.
    नोट: प्रयोग पर निर्भर करता है, यह अग्रिम में मनाया जाएगा कि क्षेत्र का चयन करने के लिए लाभ का हो सकता है. मनका निलंबन तो इसलिए अनुकूल तेज घटनाओं को देख के संभावना बढ़ ही गिलास नीचे पकवान की है कि विशिष्ट क्षेत्र के लिए जोड़ा जा सकता है.
  3. मोती के घने बादल धीरे गिलास नीचे पकवान में निलंबन pipetting द्वारा प्रचारित किया जा सकता.
  4. मोती गिलास नीचे पकवान के नीचे सिंक और पक्षपाती phagocytic कोशिकाओं के साथ एक ही विमान में लगभग रहे हैं जब तक प्रतीक्षा करें.
  5. ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र पर ध्यान केंद्रित करने और समय चूक इमेजिंग शुरू करते हैं.

नोट: इमेजिंग प्रयोग किया जाता है कि इमेजिंग सिस्टम के आधार पर कार्य प्रगति पर है, जबकि यह अपने स्टेशन फोकस ठीक धुन करने के लिए आवश्यक हो सकता हैसाख और मनाया कोशिकाओं की गतिशीलता. हालांकि, यह असंभव प्रस्तुत करना हो सकता है कि जोरदार refocusing का एक परिणाम के रूप में ध्यान केंद्रित करने के विमान से विचलित कि phagosomes का उचित विश्लेषण ध्यान दें.

6. इमेजिंग

इष्टतम इमेजिंग गुणवत्ता के लिए नीचे दिए गए सामान्य दिशा निर्देशों का पालन करें;

  1. इस तरह के एक लेजर स्कैनिंग या कताई डिस्क सिस्टम के रूप में एक confocal इमेजिंग प्रणाली का प्रयोग करें.
    नोट: Leica लास वायुसेना सॉफ्टवेयर द्वारा नियंत्रित और एक पर्यावरण नियंत्रण कक्ष से लैस एक Leica टीसीएस SP5 AOBS लेजर स्कैनिंग confocal खुर्दबीन समय चूक वीडियो इमेजिंग के लिए यहां इस्तेमाल किया गया था.
  2. ऐसी आदि स्कैनिंग गति, बढ़ाई, संकल्प, के रूप में इमेजिंग सेटिंग्स को अनुकूलित. इस्तेमाल प्रणाली के आधार पर हर 7-20 सेकंड में एक फ्रेम की दर, के लिए अनुमति देने के लिए एक तरह से.
    नोट: यहाँ, एक 200 हर्ट्ज स्कैनिंग गति, 2x स्कैनर जूम और 512 x 512 पिक्सल resu के एक प्रस्ताव पर 2-3X की एक लाइन औसतन3-5 सेकंड / टहनी के बीच एक रिकॉर्डिंग समय में lted. हर 10 सेकंड में एक फ्रेम की दर से कम से कम 120 मिनट की durations के साथ समय व्यतीत कर फिल्में रिकॉर्ड किया गया था.
  3. इस्तेमाल किया इमेजिंग सिस्टम और जांच (एस) के आधार पर उचित उत्तेजना / उत्सर्जन सेटिंग्स का उपयोग करें.
    1. अत्यधिक तस्वीर विरंजन रोकने के लिए सेटिंग्स को अनुकूलित.
      नोट: यहाँ, टेक्सास लाल Dextran 70kD एक DPSS (561 एनएम) लेजर और उत्सर्जन प्रकाश 610 एनएम उत्सर्जन चोटी के साथ 600-650 एनएम पर एक Leica संकर डिटेक्टर (हैदराबाद) द्वारा खोजा गया था का उपयोग कर उत्तेजित हो गया था. लेजर तीव्रता संकेत तीव्रता के लिए अनुकूलित और फ्लोरोफोरे (एस) और कोशिकाओं पर लेजर प्रकाश के फोटो विषाक्तता प्रभाव की तस्वीर विरंजन कम करने के लिए जितना संभव हो कम रखा जाना है. आम तौर पर, यह उचित और स्थिर संकेत तीव्रता प्राप्त करने के लिए स्कैनिंग गति, लाइन औसतन, स्कैनिंग संकल्प, फ्रेम अंतराल और इमेजिंग की अवधि के संतुलन और मनका तेज और फेगोसोम परिपक्वता समर्थक की पूरी अवधि पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण हैउपकर.
  4. वे एक fluorophore साथ संयुग्मित नहीं कर रहे हैं मोती के अवलोकन के लिए एक उज्ज्वल क्षेत्र (बीएफ) चैनल शामिल करें.
    नोट: टेक्सास लाल चैनल के अलावा, बीएफ चैनल मोती कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, उसी DPSS लेजर प्रकाश स्रोत और संकेत एक तस्वीर गुणक (पीएमटी) डिटेक्टर के साथ पकड़ा गया था के रूप में इस्तेमाल किया गया था.
    नोट: collated जा रहा है कि डेटा प्राप्त जब समान रिकॉर्डिंग सेटिंग्स लागू करने के लिए सुनिश्चित करें. सबसे महत्वपूर्ण मानदंडों हैं: उत्तेजना लेजर तीव्रता, डिटेक्टर सेटिंग, अधिग्रहण सेटिंग्स, बढ़ाई और फ्रेम अंतराल. अवलोकन डेटा बिंदुओं (हर 12 सेकंड में फ्रेम के साथ एक और सेट के साथ हर 7 सेकंड में हासिल फ्रेम के साथ एक अवलोकन मुक़ाबला करने के लिए उदाहरण के लिए) ओवरलैप नहीं होगा के रूप में समान फ्रेम अंतराल का उपयोग नहीं एक वक्र औसतन कदम की जरूरत होगी. इस डेटा मूल्यांकन के लिए आवश्यक कदम बढ़ाने के लिए और इस तरह के OriginLab रूप वक्र औसतन समारोह के साथ अतिरिक्त सॉफ्टवेयर, 'आवश्यकता होगीमूल प्रो आँकड़े सॉफ्टवेयर ( http://www.originlab.com/ ).
  5. अधिमानतः, इस्तेमाल किया इमेजिंग प्रणाली का मूल फ़ाइल प्रारूप में समय व्यतीत हो वीडियो को बचाने और संकुचित प्रारूपों में निर्यात करने से बचें.

नोट: (. LIF) अब, समय चूक फिल्मों फिर सीधे फिजी में खोलने के लिए आयात किया गया जो देशी Leica लास वायुसेना प्रारूप फ़ाइलें, में बच गए. फिजी शामिल जैव स्वरूपों आयातक प्लग का उपयोग सबसे माइक्रोस्कोप निर्माताओं से देशी फ़ाइल स्वरूपों को पढ़ने में सक्षम है. JPG या झगड़ा साथ या एक AVI कंटेनर प्रारूप में एक वीडियो फ़ाइल के रूप में एक छवि श्रृंखला में समय व्यतीत हो फिल्म फ़ाइल निर्यात आवश्यक या सिफारिश नहीं है. देशी माइक्रोस्कोप फ़ाइल स्वरूप का उपयोग कर, हानिपूर्ण संपीड़न एल्गोरिदम (जैसे JPEG) से बचने के द्वारा मूल अवलोकन से सबसे अच्छा संभव छवि गुणवत्ता बनाए रखने के अलावा सुनिश्चित करता है कि फाइल के मेटा डेटा (समय टिकटों, बढ़ाई, लेजर और अधिग्रहण तीव्रता, डिटेक्टर सेटिंग्स आदि) संरक्षित और फिजी के लिए उपलब्ध है. किसी भी कारण के लिए, समय चूक वीडियो फाइल विश्लेषण के लिए एक अलग स्वरूप में निर्यात करने की आवश्यकता हालांकि, अगर इस तरह झगड़ा छवि श्रृंखला और अलग आरजीबी रंग (लाल, हरा, नीला) इस पर पहले से ही चैनल के रूप में असम्पीडित फ़ाइल स्वरूपों का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें फिजी अक्सर सफलतापूर्वक निर्यात फ़ाइलों में अन्य रंग चैनलों से बीएफ चैनल को अलग नहीं कर सकते हैं, जैसा कदम. इसके अलावा, एक संदर्भ के रूप में मूल माइक्रोस्कोप फ़ाइलों की रक्षा करने के लिए सुनिश्चित करें.

7. समय चूक फिल्मों का विश्लेषण

  1. ImageJ, फिजी या एक analogues संकेत एसोसिएशन विश्लेषण की क्षमता प्रदान करता है कि किसी भी अन्य सॉफ्टवेयर का प्रयोग करें.
    नोट: यहाँ, फिजी समय चूक फिल्मों के विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया था. फिजी में मुफ्त डाउनलोड के लिए उपलब्ध पुनर्गठित उपकरण मेनू और अतिरिक्त देशी प्लग इन, के साथ एक छवि प्रसंस्करण पैकेज वाली एक ImageJ वितरण है http://fiji.sc . इस संप्रदाय में वर्णित प्रक्रियाआयन चित्रा 2 में दिखाया गया है.
  2. "ओपन", "फाइल" पर क्लिक करें और फ़ाइल का चयन, या खींचने और फिजी के लिए फ़ाइल छोड़ने के द्वारा द्वारा फिजी में फ़ाइल खोलें.
  3. निम्न विकल्प चुनें;
    1. देखने ढेर: देखें Hyperstack के साथ हो चुकी है,
    2. रंग विकल्प: रंग मोड रंग,
    3. अलग खिड़कियों में विभाजित चैनल: विभाजित चैनल (दर्ज की गई थी कि हर आरजीबी रंग चैनल के लिए एक अलग विंडो खोला जाएगा).
  4. मामले में एक छवि श्रृंखला, "फाइल" "आयात", "छवि अनुक्रम" और लक्ष्य छवि श्रृंखला वाले फ़ोल्डर में किसी भी छवि फ़ाइल का चयन करने के लिए जा रहा द्वारा फिजी को श्रृंखला लोड का उपयोग किया जा रहा है.
    1. सेट फिल्टर और उदाहरण के लिए श्रृंखला में लदान चयनित छवियों, के लिए शर्तों;
      1. छवियों की संख्या: लोड करने के लिए कर रहे हैं कि कितने तख्ते.
      2. छवि शुरू: श्रृंखला में शुरू फ्रेम है जो छवि.
      3. वेतन वृद्धि: वेतन वृद्धि के बीच(तख्ते आदि हर फ्रेम, हर दूसरे फ्रेम,.) लोड करने के लिए.
      4. फ़ाइल का नाम शामिल हैं: ("1 चैनल" से छवियों को एक multichannel समय चूक वीडियो के रंग जुदाई के बाद चिह्नित कर रहे हैं कि कैसे सामान्य रूप से है जो "c001", सेट करके उदाहरण के लिए) फ़ाइल नाम का उपयोग कर विशिष्ट चैनल के लिए फिल्टरिंग.
  5. , "... पैमाने पर सेट", "विश्लेषण" के लिए जा बॉक्स "ग्लोबल" जाँच और "पैमाने को हटाने के लिए क्लिक करें" पर क्लिक करके स्केलिंग निकालें.
    नोट: यह कदम विभिन्न आवर्धन का मूल्यांकन किया जाना है कि विभिन्न प्रयोगात्मक सेट के लिए इस्तेमाल किया गया है मामले में छवियों के पिक्सेल आधारित विश्लेषण की अनुमति देता है. बढ़ाई सेटिंग्स हमेशा स्थिर रखा गया है और देशी माइक्रोस्कोप फाइल सीधे फिजी के लिए आयात किया गया था यदि फिजी माइक्रोस्कोप फ़ाइल के मेटाडाटा से बढ़ाई और पैमाने पर डेटा को समझते हैं और उपयोग कर सकते हैं, जैसा कि इस कदम, छोड़ी जा सकती हैं.
  6. माप पैरामीटर सेट करें"एरिया", "मानक विचलन", "एकीकृत घनत्व", "प्रदर्शन लेबल" और "ग्रे मूल्य मतलब": "सेट माप" "विश्लेषण" के लिए जा रहा है और निम्नलिखित बक्से की जाँच करके एस.
  7. मापा और "ठीक है" के साथ की पुष्टि की जानी है कि जांच से संकेत होता है कि रंग चैनल पर रीडायरेक्ट.
  8. माप शुरू हो रहे हैं और खिड़की के ऊपरी छोर पर क्लिक करके बीएफ चैनल खिड़की का चयन करें जिसमें फ्रेम में जाना.
  9. भाँति मनका पर एक परिपत्र आरओआई यानी, ब्याज की एक क्षेत्र (आरओआई) का चयन करने के लिए "अंडाकार चयन उपकरण" का प्रयोग करें. चयन बीएफ चैनल में के रूप में दिखाई दे मनका के बाहरी छोर पर कसकर फिट है सुनिश्चित करें.
    नोट: एक पीसी का उपयोग करते समय एक परिपत्र आरओआई सुनिश्चित करने के लिए चयन उपकरण का उपयोग करते समय, शिफ्ट कुंजी पकड़.
  10. बेहतर मनका से भरा घिराव से पहले कुछ फ्रेम पूरा हो गया है माप शुरू करें और ध्यान देंएक पूरी तरह का गठन नवजात मनका फेगोसोम बनाई है और phagocytic कप बंद हो गया है फ्रेम में जो. इस बीएफ चैनल में अपेक्षाकृत स्पष्ट रूप से discernable होना चाहिए.
  11. "विश्लेषण" और माप निष्पादित करने के लिए "उपाय" पर क्लिक करने के लिए जाओ, परिणाम "परिणाम" शीर्षक से एक अलग विंडो में प्रदर्शित किया जाएगा.
  12. अगले फ्रेम में जाने मनका ले जाया गया है मामले में आरओआई की स्थिति को समायोजित, और माप दोहराएँ. परिणाम परिणाम विंडो में सूची में जोड़ दिया जाएगा, प्रत्येक का विश्लेषण फ्रेम "लेबल" स्तंभ में मूल्य के आधार पर पहचाना जा सकता है.
    नोट: (उपाय के लिए उदाहरण के लिए "एम") शॉर्टकट कुंजियों का उपयोग काफी मूल्यांकन प्रक्रिया तेज हो सकती है; शॉर्टकट की सूची देखने और मेनू "प्लगइन्स" के तहत पोशाक वाले आवंटित.
  13. सभी प्रासंगिक फ्रेम की माप पूरा करने के बाद, परिणाम ऐसे एमएस एक्सेल जैसे स्प्रेडशीट आवेदन को कॉपी किया जा सकता है. स्तंभ "IntDen" intensitie दर्शाया गया हैमाप पर पुनः निर्देशित किया गया था कि चैनल में चयनित क्षेत्र की है.

8. ब्लीचिंग सुधार

प्रयोग किया जांच और इमेजिंग सेटिंग्स पर निर्भर करता है, तस्वीर विरंजन हो सकती है. अपनी सीमा के आधार पर यह दृढ़ता से मूल्यांकन के परिणाम को प्रभावित कर सकता है. हालांकि, इस प्रभाव को आंशिक रूप से मापा मूल्यों के लिए परिवर्तन की एक समान है लेकिन विपरीत दर लागू करने से सुधारा जा सकता है. अगर मौजूद है, तस्वीर विरंजन गुणांक प्रत्येक फेगोसोम का विश्लेषण करने के लिए प्रासंगिक समय अवधि के दौरान पूरे फ्रेम में समय पर निर्भर संकेत तीव्रता कम, या फ्रेम के लिए विशेष रूप से फसली क्षेत्र को मापने के द्वारा की गणना की जा सकती है. इस प्रक्रिया आंकड़े 3 और 4 में दिखाया गया है.

  1. फिजी की "प्लगइन्स" मेनू के तहत, पूरे फ्रेम में सामान्य कमी, या समय के साथ आरओआई विशिष्ट जांच संकेत तीव्रता (चित्रा 3 निर्धारित करने के लिए "समय श्रृंखला विश्लेषक" प्लग उपयोग).
    नोट: समय श्रृंखला विश्लेषक प्लग में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/time-series.html प्लगइन्स मेनू में मामले में पहले से ही मौजूद नहीं.
  2. केवल एक विश्लेषण किया फेगोसोम के फ्रेम के अनुरूप है कि फ्रेम के लिए, एमएस एक्सेल में (सेकंड में) समय के खिलाफ माप प्लॉट.
  3. साजिश करने के लिए एक रेखीय प्रवृत्ति लाइन (चित्रा -4 ए) लागू करें, घटते संकेत के लिए एक नकारात्मक ढलान तस्वीर विरंजन प्रभाव की उपस्थिति का संकेत है.
  4. एक विश्लेषण किया फेगोसोम (आंकड़े 4B और 4C) से मूल्यों के उलट ढलान लागू करें: सही संकेत तीव्रता (एसआई) = कच्चे एसआई + (सेकंड में समय * ढलान रिवर्स)

नोट: हर एक विश्लेषण किया phagosome एक रिकॉर्ड समय व्यतीत हो फिल्म के दौरान (पूरा तेज फ्रेम पर शुरू) एक निश्चित समय अवधि के लिए होगा, फोटो bleacहिंग कि विशिष्ट अवधि के लिए पुन: परिकलित किया जाना चाहिए और कि विशिष्ट phagosome से मापा मूल्यों को सही करने के लिए ही मान्य होगा.

9. डेटा मूल्यांकन

  1. डेटा मुक़ाबला और उपयुक्त सॉफ्टवेयर में विरंजन को सही मानों के औसत और सांख्यिकीय त्रुटि की गणना.
  2. एक उपयुक्त रूप में मूल्यांकन डेटा प्लॉट.

नोट: यहाँ, वैज्ञानिक आंकड़े और सॉफ्टवेयर GraphPad चश्मे की साजिश रचने ( http://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ) का इस्तेमाल किया गया था. चश्मे सॉफ्टवेयर के रूप में लंबे समय तक सभी डेटा एक ही फ्रेम दर (यानी सभी तरह के एक फ्रेम हर 10 सेकंड के रूप में एक ही अंतराल पर साथ हासिल किया गया है) के रूप में इसी त्रुटि संकेतक के साथ एक औसत वक्र उत्पन्न करने और साजिश करने के लिए सक्षम है.

नोट: एक ही experim की दोहराता भीतर पूर्ण एसआई मूल्यों की व्यापक बदलावईएनटी सेट बहुत बड़ा सांख्यिकीय त्रुटि परिचय और डेटा व्यर्थ प्रस्तुत करना होगा. प्रोटोकॉल, जैसे इमेजिंग सेटिंग्स, collated जा रहे हैं कि अलग प्रयोग दोहराता बीच सख्ती से समान आयोजित नहीं कर रहे हैं तो यह मामला हो सकता है.

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Representative Results

इमेजिंग के लिए कोशिकाओं और मोतियों की सही तैयारी के लिए महत्वपूर्ण है. चित्रा 1 BMMs के लिए हमारे अनुकूलित प्रोटोकॉल पर आधारित बोने, जांच लोडिंग और इस विधि में प्रारंभिक इमेजिंग कदम की रूपरेखा से पता चलता है. यह प्रोटोकॉल मापदंडों कोशिकाओं और इस्तेमाल हो रहे हैं कि जांच के प्रकार के आधार पर परीक्षण किया और अनुकूलित किया जाना इसलिए जरूरी है कि.

प्रीलोडेड कोशिकाओं को आईजीजी लिपटे मोतियों के बाद इसके अलावा, यह पूर्वनिर्धारित बढ़ाई स्थापित करने के लिए रखते हुए देखने के क्षेत्र में संभव है, कोशिकाओं की सबसे बड़ी संख्या में संभावित तेज घटनाओं की सबसे बड़ी संख्या प्रदान करने के लिए एक तरह से चुना जाता है कि महत्वपूर्ण है प्रोटोकॉल की. चित्रा 2 में दिखाया गया है, इस दृष्टिकोण हर समय चूक वीडियो में analyzable phagosomes की एक बड़ी संख्या के लिए प्रदान कर सकते हैं. प्रत्येक प्रयोग सेट की वीडियो उपज प्रति डेटा अंक बढ़ाने के अलावा, यह अलग periphe द्वारा शुरू की भिन्नता कम हो जाती हैRAL की स्थिति और डेटा की मजबूती बढ़ जाती है.

यह संकेत एसोसिएशन माप प्रक्रिया (चित्रा 2) एक ही व्यक्ति द्वारा और एक अंधा तरीके से संभव अगर में किया जा सिफारिश की है. यह प्रत्येक फेगोसोम को सौंपा आरओआई चयनित और प्रत्येक फ्रेम के बाद मैन्युअल रूप से ले जाया जा रहा है, के रूप में कई व्यक्तिगत त्रुटि स्रोतों को नष्ट करने से त्रुटि को कम करने और पूर्वाग्रह को कम करने में मदद कर सकता है.

स्वाभाविक रूप से शासन "बड़ा नमूना आकार, बेहतर" भी यहाँ लागू होता है, हम सभी के व्यवहार के रूप में किसी एकल कक्ष के लिए बहुत ज्यादा वजन देने को रोकने के लिए देखने के क्षेत्र में सेल प्रति अधिक से अधिक 5 मनका फेगोसोम के मूल्यांकन से बचने एक ही संस्कृति के भीतर कोशिकाओं जरूरी 19 समरूप नहीं है. ये phagosomes जहाँ तक संभव हो बेतरतीब ढंग से चुना जाना चाहिए. इस संदर्भ में, इस तरह के phagosomes भी इमेजिंग की पूरी अवधि के लिए केन्द्र विमान में पूरी तरह से दिखाई जा रही है और जैसे मानकों नहीं किया जा रहाअत्यधिक तस्वीर विरंजन से प्रभावित आवश्यक हैं. इसके अलावा, एक एकल कोशिका से बड़े कण की एक बड़ी संख्या uptaking कि सेल में phagosomes के लिए फ्यूजन गतिशीलता को प्रभावित कर सकते हैं, इसलिए प्राथमिकता एक अपेक्षाकृत "खाली सेल" से पहले की प्रक्रिया में uptaken रहे हैं कि phagosomes को दी जानी चाहिए. एक सामान्य नियम के रूप में, (25 phagosomes अप करने के लिए इसलिए,) से पांच स्वतंत्र प्रयोगों से कम से कम पांच कक्षों से औसत माप अच्छा सांख्यिकीय महत्व के लिए प्रदान करना चाहिए.

कुछ बहुत ही तस्वीर स्थिर हैं जबकि कुछ जांच मजबूत विरंजन से भुगतना होगा के रूप में एक संभव तस्वीर विरंजन प्रभाव (चित्रा 3) का पता लगाने के लिए समय श्रृंखला विश्लेषण के आवेदन या एक तुलनीय विधि, बहुत महत्वपूर्ण है. एक मजबूत विरंजन प्रभाव ही जांच के साथ सभी प्रयोगों में मनाया जाता है तस्वीर विरंजन सुधार कदम (चित्रा 4) ही लागू किया जाना चाहिए. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इस प्रक्रिया कर सकते हैं केवल आंशिक रूप से सहीविरंजन के प्रभाव. महत्वपूर्ण बात है, केवल कुछ मामलों में अत्यधिक विरंजन ऐसी गलत उत्तेजना या इमेजिंग सेटिंग्स, गलत मध्यम पीएच, अस्वस्थ कोशिकाओं, या nonfresh अभिकर्मकों के रूप nonoptimal शर्तों का संकेत हो सकता है.

चित्रा 5C में, मनका फेगोसोम चित्रा 5A में एक तीर के साथ संकेत दिया और चित्रा 5B में, विश्लेषण किया है और 90 मिनट के अंतराल के दौरान फेगोसोम परिपक्व करने के लिए Dex70kD संकेत तीव्रता (एसआई) एसोसिएशन साजिश रची है. वक्र में शोर का स्रोत होने के कारण इस तरह के अन्य phagosome और फोकल हवाई जहाज़ के उतार चढ़ाव से विश्लेषण फेगोसोम की रुकावट जैसे कारकों को मापा संकेत के रूपांतरों फ्रेम है. हालांकि, phagosome को संकेत एसोसिएशन के अस्थायी प्रवृत्ति आसानी से स्पष्ट है. चित्रा 5A में दिखाई दे दो कोशिकाओं से 10 phagosomes से विश्लेषण औसत के बाद, एक औसत वक्र (चित्रा 5D) प्लॉट किया जा सकता है जिसके लिए सांख्यिकीय ईrror मतलब की मानक त्रुटि (SEM) या नमूने का आकार और प्रयोगात्मक शर्तों के आधार पर मानक विचलन (एसडी) प्लॉट के रूप में किया जा सकता है. औसतन वक्र के पूर्ण एसआई मानों किसी एक विश्लेषण किया फेगोसोम के उस से आम तौर पर अलग है, अस्थायी प्रवृत्ति आम तौर पर बहुत समान है. विश्लेषण के बाद, यह जंगली प्रकार BMMs में मनका phagosomes को लाइसोसोमल luminal कार्गो के रूप में Dex70kD का वितरण phagocytosis के बाद 35-40 मिनट के भीतर एक पठार पर पहुंच गया है कि निष्कर्ष निकाला जा सकता है.

इस विधि इसलिए फेगोसोम परिपक्वता की प्रक्रिया पर विभिन्न कारकों के गुणात्मक या मात्रात्मक प्रभाव की जांच करने के लिए नियोजित किया जा सकता है.

चित्रा 1
चित्रा 1. इमेजिंग के लिए कोशिकाओं की तैयारी. Preprepared BMMs अलावा पहले एक गिलास नीचे पकवान कम से कम 12 घंटे में वरीयता प्राप्त कर रहे हैंdextran के, मध्यम में dextran का समाधान 20 माइक्रोग्राम / एमएल एकाग्रता में जोड़ा जाता है और 2-8 घंटे (लोडिंग) के लिए incubated, कोशिकाओं धो रहे हैं, ताजा मध्यम गयी है और सेल में कम से कम 4 घंटा (चेस) के लिए incubated हैं, कोशिकाओं रहे हैं फिर से धोया और मनका निलंबन से ठीक पहले इमेजिंग की शुरुआत करने के लिए जोड़ा गया है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 2
चित्रा 2. छवि विश्लेषण के लिए कदम अनुदेश द्वारा कदम. फिजी में विभिन्न चैनलों में समय व्यतीत हो वीडियो या छवि अनुक्रम लोड करने के बाद, मूल्यांकन (चित्रा एक छवि कोलाज को दर्शाया गया है और यहां दिखाए गए सभी खिड़कियां एक साथ खुला रहेगा न ध्यान दें कि इन कदमों में इस प्रकार है ). (एक) के लिए मेनू, पिक्सेल "विश्लेषण" के तहतदूरी स्केलिंग छवियों के मेटा डेटा फिजी के लिए उपलब्ध नहीं हैं मामले में फिर से कायम है, अलग आवर्धन पहले फिजी में इस्तेमाल किया गया है या समय चूक रिकॉर्डिंग (, (ख) "पैमाने पर सेट" के लिए जा रहा द्वारा, विभिन्न आवर्धन पर हैं ग) सभी बाद में भरी हुई छवि श्रृंखला को रीसेट लागू होता है, जो "ग्लोबल" बॉक्स बजाते और "पैमाने हटाने के लिए क्लिक करें" पर क्लिक. (घ) उज्ज्वल क्षेत्र (मनका phagosomes स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं, जहां) (बीएफ) चैनल छवि श्रृंखला और जांच संकेत युक्त चैनल दोनों भरी हुई है और ठीक उसी फ्रेम मायने रखता है और पिक्सेल आयाम, जैसे हैं कि सुनिश्चित करें. 450 X 450 पिक्सेल आयामों के साथ प्रत्येक 400 फ्रेम के दो श्रृंखला. (ई) "विश्लेषण" मेनू के तहत, मूल्यांकन के मापदंडों "एरिया", "एकीकृत घनत्व" और "प्रदर्शन लेबल" मापदंडों का चयन किया जाना है जहां "सेट माप", के तहत स्थापित किया जा सकता. (च (छ) यह लाल चैनल में बिंदीदार रेखा और सफेद तीर ने संकेत दिया है कि ब्याज (आरओआई) के एक ही क्षेत्र में लाल चैनल तीव्रता की माप सुनिश्चित करता है. परिपत्र आरओआई "ओवल" चयन उपकरण का उपयोग बीएफ चैनल में चयन किया गया है. (ज) "विश्लेषण", "उपाय" या शॉर्टकट कमांड के प्रयोग के तहत माप प्रारंभ करें, और प्रयोग के वांछित अवधि (जैसे 90 मिनट) के लिए पूरी श्रृंखला के हर फ्रेम के लिए दोहराएँ. प्रत्येक फ्रेम में ले जाते हैं, और ब्याज का मनका फेगोसोम के लिए आरओआई स्थान बदल डालना और BF श्रृंखला में अगले फ्रेम करने के लिए जा रहा है और स्वत: "उपाय" आदेश दे लाल चैनल की इसी फ्रेम में आरओआई उपाय है ध्यान दें. (मैं) माप परिणाम"परिणाम" खिड़की में एक सूची के रूप में दिखाई देगा. "लेबल" स्तंभ के अंतर्गत, प्रत्येक पंक्ति के लिए सटीक फ्रेम स्पष्ट रूप से पहचान की है, एक भी फ्रेम के दोहराया माप के लिए या लंबे छवि श्रृंखला में तख्ते छोड़ जाँच करने के लिए इस का उपयोग करें. (जे) एकीकृत घनत्व लघु "IntDen" महत्वपूर्ण उत्पादन पैरामीटर है, मूल्यांकन के साथ जारी रखने के लिए एक एमएस एक्सेल शीट को कम से कम लेबल और "IntDen" मूल्यों की नकल. IntDen मूल्य की इकाई अपरिभाषित और मनमाना इकाइयों (एयू) के रूप में संकेत दिया है, इस के रूप में लंबे समय प्रोटोकॉल को कड़ाई से पालन कर रहे हैं के रूप में कोई समस्या पैदा नहीं करता है. स्केल बार 10 माइक्रोन है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 3
चित्रा 3. तस्वीर विरंजन का विश्लेषण.60, ब्याज की चैनल में (एक) खुला छवि श्रृंखला और अगर जरूरत पैमाने हटा दिया गया है बनाना, (ख) "प्लगइन्स" मेनू क्लिक (ग) "समय श्रृंखला विश्लेषक" के तहत. (घ) आयताकार चयन उपकरण का उपयोग, लगभग पूरे फ्रेम को कवर एक आयताकार रॉय, या फिल्म की पूरी अवधि, (ई) चयनित आरओआई जोड़ने के लिए ब्याज की कम से कम पूरे सेल आकर्षित, (च) पर क्लिक करें "औसत प्राप्त निशान "और (छ) परिणाम में प्रदर्शित किया जाएगा" "टेबल और" समय जवाब "साजिश बताते हैं. केवल एक 'औसत' (तीव्रता) मतलब मूल्य फ्रेम संख्या और नहीं "IntDen" मूल्य के खिलाफ साजिश रची है कि, लेकिन ध्यान दें. के तहत (ज) एक ही फ्रेम पर ठीक उसी लागत पर लाभ के लिए "IntDen" को मापने के लिए, किसी भी अन्य मानकों को बदलने के बिना मेनू, भागो "उपाय" "विश्लेषण". यह मेरे के बराबर प्रदान करेगा"IntDen" में एक तीव्रता, रूपांतरण कारक ("एरिया" के बराबर) की गणना और एमएस एक्सेल में सेकंड में समय के खिलाफ पूरे फ्रेम रॉय के "IntDen" साजिश के लिए इस मान का उपयोग करें. (जे), "सूची" पर क्लिक करें एक एक्सेल शीट के लिए मानों की सूची कॉपी और सभी "मीन" मूल्यों "IntDen" मूल्यों के साथ परिवर्तित. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 4
चित्रा 4. तस्वीर विरंजन का सुधार. प्रयोग किया जांच और इमेजिंग सेटिंग्स पर निर्भर करता है, तस्वीर विरंजन हो सकती है. यह दृढ़ता से मूल्यांकन के परिणाम को प्रभावित कर सकता है. ए) पूरे फ्रेम से जांच कच्चा IntDen मूल्यों (एयू) में एमएस एक्सेल में सेकंड में समय के खिलाफ साजिश रची है. एक रेखीय जोड़ेंट्रेंड लाइन;.. एक स्पष्ट रूप से नकारात्मक ढलान सुधार सूत्र का उपयोग कच्चे IntDen पर सही IntDen सी) सही IntDen मूल्यों उलट ढिलाई पैदावार को लागू करने, एक उदाहरण के रूप में तस्वीर विरंजन प्रभाव की उपस्थिति बी) को इंगित करता है, आंशिक रूप से भरपाई के लिए कर रहे हैं तस्वीर विरंजन के प्रभाव. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

चित्रा 5
चित्रा 5. प्रतिनिधि कोशिकाओं, कैनेटीक्स और सही संकेत के औसत की प्रस्तुति. ए) BMMs तीर द्वारा संकेत आईजीजी में लिपटे मनका के तेज पर न्यूनतम 0 पर dextran जांच के साथ भरा हुआ है. स्केल बार 10 माइक्रोन है. से मेल खाती फिल्म 1 बी) 2.5X तेज करने के बाद, ImageJ में "थाल" देखो सारणी (lut) के साथ बेहतर दृश्यता के लिए झूठी रंग 85 मिनट के अंतराल पर संकेत दिया फेगोसोम चित्रण, एक समय व्यतीत हो फिल्म से सम्मिलित तेजी से बढ़ी है. मापा फेगोसोम आरओआई सफेद धराशायी लाइन के साथ संकेत दिया है. फेगोसोम में dextran वितरण और संचय के उदाहरण सफेद तीर के साथ संकेत कर रहे हैं. सी)) ने संकेत फेगोसोम. विकास के लिए लाइसोसोम से बचाया टेक्सास लाल 70kDa dextran के प्रतिदीप्ति संकेत सही ± SEM के दो संकेत कोशिकाओं के भीतर 10 phagosomes से प्रतिदीप्ति IntDen मूल्यों औसतन . बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

निम्न भाग में हम प्रस्तुत विधि और उसकी सीमाओं का महत्वपूर्ण कदम पर चर्चा करेंगे. इसके अलावा, हम उनके समाधान के साथ आम समस्याओं में से कुछ कनेक्ट संभव संशोधनों को लागू करने और हमारे विधि के फायदे के साथ ही इस दृष्टिकोण के लिए उपयुक्त पूरक के तरीकों पर विचार करेगी.

मनका सतह को आईजीजी के युग्मन सहित मोती, की तैयारी, महत्वपूर्ण है और unfresh तैयारी के प्रयोग से बचा जाना चाहिए. उस के लिए इसके अतिरिक्त, यह dextran हौसले हर प्रयोग से पहले जमे हुए शेयर (पतला और निष्फल) से तैयार किया जाता है कि यह भी महत्वपूर्ण है. यह dextran की लोडिंग सेलुलर तेज और डिब्बे वितरण और संचय में स्थिरता प्राप्त करने के लिए एक सटीक कार्यक्रम इस प्रकार है कि महत्वपूर्ण है. इसके अलावा, यह एक ही माइक्रोस्कोपी सेटअप और सॉफ्टवेयर सेटिंग्स, लेकिन यह भी संभव है (उदाहरण ते के रूप में के रूप में निरंतर परिधीय शर्तों रखने के लिए न केवल उपयोग करने के लिए महत्वपूर्ण हैmperature, सीओ 2, आर्द्रता, मनका इसके अलावा तकनीक, आदि.). एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु दृश्य या ब्याज की सेल के एक क्षेत्र का चयन है, नमूना प्रतिनिधि हैं कि कोशिकाओं का चयन करने के क्रम में इमेजिंग के शुरू होने से पहले scouted किया जाना चाहिए.

विधि की प्रमुख सीमाओं में से एक महत्वपूर्ण नमूने आकार उपज के लिए आवश्यक प्रयोगों की संख्या है. चुनी संकल्प के आधार पर देखने का एक क्षेत्र में प्रत्यक्ष phagosomes, की संख्या सीमित है, के बाद से वर्णित विधि, अपेक्षाकृत समय और काम गहन है. बेतरतीब ढंग से चुनी phagosomes की एक बहुत ही कम संख्या का परिणाम पूलिंग कुछ चरम outliers औसतन मूल्यों पर एक प्रमुख प्रभाव हो सकता है कि जोखिम अपरिहार्य है. दूसरी ओर बड़ा नमूना आकार phagosome से phagosome या सेल करने वाली सेल की विविधताओं मास्किंग सक्षम हो जाएगा.

हो सकता है कि आम समस्याओं contaminations, phagocytosis की कमी और अत्यधिक विरंजन और फोटो शामिललेजर प्रकाश के कारण विषाक्तता प्रभाव.

बाँझपन, उचित भंडारण और dextran की तैयारी संदूषण से बचने के लिए महत्वपूर्ण हैं. हमारे अनुभव में, खरीदी dextran एक बाँझ समाधान के रूप में नहीं माना जाना चाहिए. नमूना संदूषण का खतरा काफी स्टॉक और कमजोर dextran समाधान की बाँझ निस्पंदन का व्यापक centrifugation द्वारा कम किया जा सकता है. दूसरी ओर, प्रोटीन होता है और संदूषण की संभावना है जो ताजा मनका निलंबन की नियमित तैयारी, भी संदूषण के खतरे को कम कर सकते हैं.

की कमी या phagocytosis के निम्न स्तर मोतियों की आईजीजी कोटिंग suboptimal के कारण हो सकता है. इसलिए, यह हौसले और न अधिक से अधिक 4 सप्ताह पुराने या नहीं कर रहे हैं, जो मोती का उपयोग करने के लिए मनका (आईजीजी समाधान, EDAC) के आईजीजी युग्मन के लिए घटकों तैयार करने के लिए महत्वपूर्ण है 4 डिग्री सेल्सियस पर विशेष रूप से रखा गया है मोती संक्षेप उपयोग से पहले sonicated कर रहे हैं, इसे तैयार करने की सिफारिश की हैशेयर निलंबन के दोहराया sonication से बचने के लिए aliquots काम कर रहे. इस्तेमाल किया सेल प्रकार के लिए सिफारिश की संस्कृति शर्तों का कड़ाई से पालन इसलिए आवश्यक है, उम्मीद phagocytic प्रदर्शन की तुलना में कम के लिए एक अन्य कारण, अस्वस्थ suboptimally सुसंस्कृत या पुरानी कोशिकाओं हो सकता है. उदाहरण के लिए, फसल के दौरान अत्यधिक trypsinization phagocytic सतह रिसेप्टर्स को नुकसान पहुंचा और phagocytic क्षमता प्रभावित हो सकती है.

अत्यधिक तस्वीर विरंजन कुछ fluorophores के साथ एक बड़ी समस्या हो सकती है. की fluorophore विरंजन संवेदनशीलता के अनुसार, उत्तेजना प्रकाश और नमूना जोखिम की अवधि की तीव्रता यानी, माइक्रोस्कोप सेटिंग्स समायोजित विरंजन को नियंत्रित करने में मदद करता है. लगातार फ्रेम के अधिग्रहण के बीच समय अंतराल के संबंध में, एक उच्च आवृत्ति पर उच्च अस्थायी समाधान और महत्वपूर्ण बातचीत की गतिशीलता के बेहतर रहस्योद्घाटन के लिए प्रदान करता है जो फ्रेम दर, और जांच की विरंजन के बीच एक संतुलन टी हैओ त्रस्त किया. इष्टतम संतुलन मुख्य रूप से भी प्रयोग में संबोधित किए जाने वाले प्रश्नों पर निर्भर करता है. स्कैनिंग संकल्प, स्कैनिंग आवृत्ति और रेखा या फ्रेम औसतन समायोजित करना आगे उत्तेजना प्रकाश के लिए नमूना जोखिम की अवधि का अनुकूलन करने के लिए बदला जा सकता है कि सेटिंग का प्रतिनिधित्व करते हैं. इन विकल्पों में से कुछ की उपलब्धता तथापि इस्तेमाल किया जा रहा है कि माइक्रोस्कोप प्रणाली के प्रकार से निर्धारित होता है.

एक ही सामान्य दिशा निर्देशों कोशिकाओं पर लेजर उत्तेजना प्रकाश की फोटो विषैले प्रभाव को कम करने के लिए पीछा किया जाना चाहिए. इस आशय इमेजिंग या अप्राकृतिक morphologies 20 में एक उल्लेखनीय वृद्धि के दौरान लेजर प्रकाश के संपर्क में कोशिकाओं की मौत के रूप में प्रकट हो सकता है.

यहाँ हम अलग प्रयोगात्मक सेटिंग्स के लिए संशोधन और अनुकूलन के लिए अनुमति देता है एक बुनियादी और सामान्य विधि, प्रस्तुत किया है. कहा गया है, इस विधि इस तरह पीटकर मॉडल के रूप में नुकसान के समारोह के अध्ययन के लिए नियोजित किया जा सकता है,जीन पछाड़ना या उत्परिवर्ती प्रोटीन अभिव्यक्ति. विभिन्न opsonization रणनीतियों विशिष्ट phagocytic रिसेप्टर्स लक्ष्य के लिए भी अनुमति देता है, विभिन्न endosomal / lysosomal जांच के उपयोग के साथ ही रासायनिक inhibitors या साइटोकिन्स का अध्ययन.

विभिन्न फ्लोरोसेंट संलयन प्रोटीन और उनके म्यूटेंट साथ अभिव्यक्ति पढ़ाई पर phagosomes के लिए एक उचित जांच के वितरण पर प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा phagosomes साथ कैनेटीक्स और प्रोटीन के ही बातचीत की गतिशीलता का विश्लेषण किया जा सकता है. इन उद्देश्यों के लिए उपयोग किया जा सकता है कि उपलब्ध कई जांच कर रहे हैं. जांच के आम वर्ग का एक प्रमुख उदाहरण व्यापक रूप से endosomal डिब्बों की protonation लुमेन के साथ ही phagosomal लुमेन ट्रैक करने के लिए उपयोग किया जाता है जो acidotropic रंगों के LysoTracker समूह, शामिल हैं. मोतियों की कोटिंग संभावनाओं का एक और भीड़ प्रदान करता है. ऐसे जीवाणु के डीएनए 21, bacte की विशिष्ट CPG साइटों के रूप में न्यूक्लिक एसिड सहित ligands,ऐसे LPS रूप रियाल सतह घटकों, जैसे avidin के रूप में प्रोटीन, पूरक कारकों (जैसे C1q या iC3b) सभी सहित सीरम प्रोटीन पार मोती 22-24 से जोड़ा जा सकता है. इस phagocytosis और फेगोसोम परिपक्वता में इन ligands की भूमिका का अध्ययन की अनुमति देता है. (उदाहरण साइटोकिन्स के लिए) संकेतन अणुओं और प्रतिरक्षा मध्यस्थों का प्रयोग संभावनाओं की एक और श्रृंखला खुला.

अंत में, इस विधि का भी विस्तार किया है और बैक्टीरिया के अनियमित आकार छवि विश्लेषण के दौरान नई चुनौतियों poses हालांकि, लाइव मारे बनाम या nonpathogenic बैक्टीरिया बनाम रोगजनक के तेज तुलना द्वारा उदाहरण के लिए, सूक्ष्मजीवों के साथ सीधे अध्ययन का संचालन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.

इस विधि का भविष्य अनुप्रयोगों लागू किया जा सकता है कि संशोधनों के रूप में के रूप में कई गुना कर रहे हैं. एक अगले कदम के रूप में, अनुपात मीट्रिक विश्लेषण के तरीकों में रूपांतरित किया जा सकता है. मनका कोटिंग, या Meas के लिए एक जांच का उपयोग करने के लिए पीएच संवेदनशील और पीएच असंवेदनशील फ्लोरोसेंट रंगों का संयोजनure phagosomal पीएच (जैसे pHrodo, FluoProbes) और साथ ही यह संभव प्रयोगात्मक फेगोसोम (जैसे ओवीए, एचआरपी, गोजातीय सीरम albumin और ट्राइग्लिसराइड लाइपेस substrates) के अंदर प्रोटीन और लिपिड गिरावट के कैनेटीक्स का पालन करने के लिए कर यौगिकों कि 25-31 उपलब्ध हैं. एक साथ ये यहाँ प्रस्तुत phagosomes का जीना सेल इमेजिंग के बुनियादी विधि पर आधारित खोजी दृष्टिकोण का एक विशाल संख्या की स्थापना संभव बनाते हैं.

वर्णित विधि फेगोसोम अलगाव 32 के आधार पर कर रहे हैं कि तरीकों की तुलना में कहीं अधिक लौकिक संकल्प को प्राप्त कर सकते हैं. एलिसा या वेस्टर्न ब्लाट विशेष बिंदुओं पर समय की घटनाओं की बहुत अधिक संख्या का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं phagosomes का विश्लेषण करती है, लेकिन डेटा की घटनाओं का एक कहीं अधिक विषम और संभावित अनसिंक्रनाइज़्ड आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं. आधारित दृष्टिकोण सैद्धांतिक रूप से व्यक्तिगत सेल स्तर तक नीचे और उस रास्ते में विश्लेषण heterogenei होने का खतरा कम हो सकता है की अनुमति प्रवाह cytometryसेल आबादी की Ty लेकिन अनिश्चित synchronicity की इसी तरह की समस्या और विश्वसनीय मूल्यांकन के लिए बहुत उच्च घटना की गिनती के लिए की जरूरत अभी भी जारी रहती है. बहरहाल, उच्च throughput, संवेदनशीलता और प्रवाह के reproducibility cytometry 33,34 उन्हें लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण के लिए एक इष्टतम पूरक बनाने के दृष्टिकोण.

साथ में ले ली, हमारे विधि का लाभ सटीकता और एकल phagosomes जीवित कोशिकाओं में उनकी परिपक्वता प्रक्रिया में पीछा किया जा सकता है जिसके साथ उच्च अस्थायी समाधान में निहित है. कम समय के अंक के लिए टिप्पणियों को प्रतिबंधित जो सभी अन्य तरीकों की तुलना में, nonviable और pretreated कोशिकाओं में, यह आसानी से परिवर्तनीय शारीरिक शर्तों के तहत समय की लंबी अवधि में गतिशील रूप से और लगातार सेलुलर घटनाओं का पालन करने के लिए यहां संभव है. एक और ठीक phagocytosis के चरणों की भेदभाव की अनुमति देता है जो phagocytic कार्गो के तेज के सापेक्ष घटनाओं को परिभाषित कर सकता. उस रास्ते में, तुल्यकालन के लिए नहीं ओ सक्षम बनाता हैnly phagosomes के समान व्यवहार कल्पना, यह भी कारण जैसे सेल करने वाली सेल बदलाव के लिए व्यक्तिगत मतभेदों की पहचान करने की अनुमति देता है. सबसे महत्वपूर्ण बात, जटिल बातचीत को समझने की कुंजी पकड़ सकता है, जो बातचीत की गतिशीलता को प्रभावी ढंग से हमारे लाइव सेल इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग उच्च अस्थायी समाधान में प्रबुद्ध किया जा सकता है.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए phagosome जीवविज्ञान प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद. यह काम एक Helmholtz युवा अन्वेषक अनुदान (पहल और Helmholtz एसोसिएशन की नेटवर्किंग फंड) और एक प्राथमिकता कार्यक्रम जर्मन अनुसंधान परिषद (ड्यूश Forschungsgemeinschaft, DFG) के SPP1580 अनुदान द्वारा समर्थित है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dulbecco's Modified Eagles Medium (D-MEM) PAA, Austria E15-009
Dulbecco's Modified Eagles Medium without phenol red (D-MEM) PAA, Austria E15-047
Fetal Bovine Serum (FBS) PAA, Austria A15-151
L-Glutamine PAA, Austria M11-004
PBS PAA, Austria H15-002
Penicillin/Streptomycin PAA, Austria P11-010
WillCo-dish® Glass bottom dish (35 mm ∅, #1.5) WillCo Wells, Netherlands GWSt-3522
CELLviewTM glass bottom dish, 35 mm Greiner Bio one, Germany 627871 Alternative: Available as segmented
Carboxylated latex microspheres Polysciences, USA #09850 Available in different diameters, we used 3 μm
Polystyrene microparticles Kisker Biotech, Germany PPs-3.0COOH
Triton-X 100 ROTH, Germany 305.1.3
mouse whole IgG Rockland, USA 010-0102
EDAC crosslinker Sigma-Aldrich, USA E6383-1g
10 mM Tris Sigma-Aldrich,USA T1503
1-ml syringe Omnifix -F B.Braun, Germany 9161406V
26 G needle (0.45*25 mm) B.Baun, Germany 4657683
RPMI 1640 PAA, Austria E15-039
Horse Serum Gibco, USA 16050-122
MES hydrate Sigma-Aldrich, USA M2933
0.2 μM syringe mounted filter Sartorius, Germany 83.1826.001

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इम्यूनोलॉजी अंक 85 lysosome phagosome phagolysosome जीना सेल इमेजिंग फ़ैगोसाइट मैक्रोफेज
लाइव मैक्रोफेज में Phagolysosome biogenesis का अध्ययन
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Bronietzki, M., Kasmapour, B.,… More

Bronietzki, M., Kasmapour, B., Gutierrez, M. G. Study of Phagolysosome Biogenesis in Live Macrophages. J. Vis. Exp. (85), e51201, doi:10.3791/51201 (2014).

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